基于Escherichia coli的互补实验用于研究热休克蛋白70的分子伴侣功能

摘要

本方案展示了热休克蛋白70（Hsp70）的分子伴侣活性。E. coli dnaK756 细胞作为该检测的模型，因其携带一种天然但功能受损的Hsp70，使其对热应激敏感。外源性引入有功能的Hsp70可挽救这些细胞的生长缺陷。

摘要

热休克蛋白70（Hsp70）是一种保守蛋白，可促进细胞内其他蛋白质的折叠，因此被称为分子伴侣。尽管Hsp70并非对 E. coli 在正常条件下生长的细胞中，这种分子伴侣在高温条件下对细胞生长变得不可或缺。由于Hsp70高度保守，研究其分子伴侣功能的一种方法是 Hsp70 在不同物种中异源表达基因 E. coli 缺乏 Hsp70 或表达功能受损的天然 Hsp70 的菌株。 E. coli dnaK756 细胞无法支持λ噬菌体DNA的复制。此外，其内源性Hsp70（DnaK）表现出升高的ATP酶活性，同时对GrpE（Hsp70核苷酸交换因子）的亲和力降低。因此， E. coli dnaK756 细胞在30 °C至37 °C温度范围内可正常生长，但在高温下会死亡（>40 °C）。因此，这些细胞可作为研究Hsp70分子伴侣活性的模型。本文详细描述了利用这些细胞进行互补实验的实验方案，从而实现对Hsp70功能的研究 在细胞内 Hsp70的分子伴侣功能

引言

热休克蛋白作为分子伴侣，在促进蛋白质折叠、防止蛋白质聚集以及逆转蛋白质错误折叠方面发挥着重要作用^1,2。热休克蛋白70（Hsp70）是最为重要的分子伴侣之一，在蛋白质稳态中起核心作用^3,4。DnaK 是 E. coli 中 Hsp70 的同源蛋白⁵。

已开发出多种生物物理、生化及基于细胞的检测方法，用于研究Hsp70的分子伴侣活性，并筛选靶向该分子伴侣的抑制剂^6,7,8。Hsp70是一种高度保守的蛋白质。因此，已有报道称多种真核生物的Hsp70（例如恶性疟原虫（Plasmodium falciparum），即疟疾的主要病原体）可在E. coli中替代DnaK的功能^6,9。基于此，已建立了一种以E. coli为基础的互补实验方法....

方案

1. 转化

注意：培养过程中需使用无菌玻璃器皿、移液器吸头以及新鲜配制并经高压灭菌的培养基。在2×酵母胰蛋白胨（YT）琼脂培养基[1.6% 胰蛋白胨（w/v）、1% 酵母提取物（w/v）、0.5% NaCl（w/v）、1.5% 琼脂（w/v）]中培养大肠杆菌（E. coli）细胞。本实验方案中所用常规试剂及其来源详见材料表。

1. 标记2.0 mL 微量离心管，并分装50 µL感受态细胞 E. coli dnaK756细胞，并将细胞置于冰上。
2. 向含有感受态细胞的 2.0 mL 微离心管中，分别加入 10–50 ng 的 pQE60/DnaK、pQE60/KPf 和 pQE60/KPf-V436F 质粒 DNA⁹ 分装至不同的离心管中。
3. 将含有感受态细胞和质粒DNA的2.0 mL微量离心管置于冰上静置30 min。
4. 将感受态细胞与DNA混合物在42 °C下热激60秒，然后将微量离心管放回冰上孵育10分钟。
5. 加入950 µL新鲜的2x YT肉汤（预先在37 °C孵育），于37 °C、150转/分钟振荡条件下孵育1小时。如有必要，可延长细胞培养时间以促进其恢复。
   注意：避免剧烈振荡细胞。
6. 用移....

结果

图2展示了在允许性生长温度37 °C和43.5 °C下点样并培养的含有细胞的琼脂平板扫描图像。在图2的右侧，切出的蛋白印迹条带分别代表DnaK、KPf和KPf-V436F在E. coli dnaK756细胞中的表达情况。如预期所示，所有在37 °C允许性生长温度下培养的E. coli dnaK756细胞均能够生长。然而，在43.5 °C非允许性生长条件下，只有异源表达DnaK和KPf的细胞能够生长，这与先前报道结果一致^6,9,20（图2）。另一方面，表达KPf-V436F的细胞仅能在37 °C下生长，而在43.5 °C下无法生长。这表明DnaK和KPf能够在热应激条件下恢复E. coli dnaK756细胞的生长缺陷。异源.......

讨论

该方案展示了其用途 E. coli dnaK756利用异源表达的Hsp70研究其分子伴侣功能。该检测方法可用于筛选靶向Hsp70功能的抑制剂 细胞内然而，该方法的一个局限性在于Hsp70无法替代DnaK的功能 E. coli 与本实验不兼容。缺乏翻译后修饰²¹ 某些非天然Hsp70的功能缺失可能归因于其在体内的非功能性表现 E. coli 系统。基于酵母的互补实验²² 可能解决某些现有不足之处 E. coli-为基础的检测方法

确保结果可重复性的几个关键步骤至关重要。这些步骤包括在涂布过程中确保仅使用由相应质粒构建体转化的细胞。此外，在整个操作过程中避免培养物污染也非常重要。另外，由于处于应激状态的E. coli DnaK细胞容易发生过度丝状化¹⁰，因此在培养过程中应避免剧烈振荡，因为这种物理应激会促进广泛的丝状化.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-β-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	8,05,740	上样缓冲液组分
乙酸	Labchem	101005125	脱色液组分
丙烯酰胺	Sigma-Aldrich	8008300100	SDS 组分
琼脂	Merck	HG000BX1.500	培养基和液体生长实验组分
琼脂糖	Clever Scientific	14131031	经认证的分子生物学级琼脂糖
过硫酸铵	Sigma-Aldrich	101875295	SDS-PAGE 凝胶组分
氨苄青霉素	VWR International	0339—EU—25G	选择性抗生素
Bis	Sigma-aldrich	1015460100	SDS 组分
溴酚蓝	Sigma-Aldrich	0449-25G	上样缓冲液组分
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4	用于感受态细胞制备
考马斯亮蓝	VWR International	443293X	SDS-PAGE 染色剂
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	RB10368	PBS 缓冲液组分
ECL	Thermofischer Scientific	32109	Western 印迹检测试剂
溴化乙锭	Thermofischer Scientific	17898	DNA 插入性染料
甘油	Merck	SAAR2676520L	上样缓冲液组分
甘氨酸	VWR International	10119CU	SDS 组分
IPTG	Glentham life sciences	162IL	诱导剂
卡那霉素	Melford	K0126	选择性抗生素
氯化镁	Merck	SAAR4123000EM	培养基和液体生长实验组分
甲醇	Labchem	113140129	脱色液组分
磷酸二氢钾	Merck	1,04,87,30,250	PBS 缓冲液组分
蛋白胨	Merck	HG000BX4.250	培养基和液体生长实验组分
氯化钾	Merck	SAAR5042020EM	PBS 缓冲液组分
PVDF 膜	Thermofischer scientific	PB7320	Western 印迹膜
氯化钠	Merck	SAAR5822320EM	培养基和液体生长实验组分
十二烷基硫酸钠	VWR International	108073	用于分离表达蛋白
Spectramax iD3	Separations	373705019	全自动酶标仪
TEMED	VWR international	ACRO420580500	SDS 凝胶组分
四环素	Duchefa Biochemies	T0150.0025	选择性抗生素
Tris	VWR International	19A094101	SDS 凝胶组分
Tween20	Merck	SAAR3164500XF	Western 洗涤缓冲液组分
Western 转膜槽	Thermofisher Scientific	PB0112	将蛋白质转移至硝酸纤维素膜
酵母提取物	Merck	HG000BX6.500	培养基和液体生长实验组分
α-DnaK 抗体	Inqaba	BK CAC09317	一抗
α-兔抗体	Thermofischer scientific	31460	二抗