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基于Escherichia coli的互补实验用于研究热休克蛋白70的分子伴侣功能

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DOI：

10.3791/66515

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2024年3月8日

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry & Microbiology, University of Venda

本文内容

摘要

本方案展示了热休克蛋白70（Hsp70）的分子伴侣活性。E. coli dnaK756 细胞作为该检测的模型，因其携带一种天然但功能受损的Hsp70，使其对热应激敏感。外源性引入有功能的Hsp70可挽救这些细胞的生长缺陷。

摘要

热休克蛋白70（Hsp70）是一种保守蛋白，可促进细胞内其他蛋白质的折叠，因此被称为分子伴侣。尽管Hsp70并非对 E. coli 在正常条件下生长的细胞中，这种分子伴侣在高温条件下对细胞生长变得不可或缺。由于Hsp70高度保守，研究其分子伴侣功能的一种方法是 Hsp70 在不同物种中异源表达基因 E. coli 缺乏 Hsp70 或表达功能受损的天然 Hsp70 的菌株。 E. coli dnaK756 细胞无法支持λ噬菌体DNA的复制。此外，其内源性Hsp70（DnaK）表现出升高的ATP酶活性，同时对GrpE（Hsp70核苷酸交换因子）的亲和力降低。因此， E. coli dnaK756 细胞在30 °C至37 °C温度范围内可正常生长，但在高温下会死亡（>40 °C）。因此，这些细胞可作为研究Hsp70分子伴侣活性的模型。本文详细描述了利用这些细胞进行互补实验的实验方案，从而实现对Hsp70功能的研究 在细胞内 Hsp70的分子伴侣功能

引言

热休克蛋白作为分子伴侣，在促进蛋白质折叠、防止蛋白质聚集以及逆转蛋白质错误折叠方面发挥着重要作用1,2。热休克蛋白70（Hsp70）是最为重要的分子伴侣之一，在蛋白质稳态中起核心作用3,4。DnaK 是 E. coli 中 Hsp70 的同源蛋白5。

已开发出多种生物物理、生化及基于细胞的检测方法，用于研究Hsp70的分子伴侣活性，并筛选靶向该分子伴侣的抑制剂6,7,8。Hsp70是一种高度保守的蛋白质。因此，已有报道称多种真核生物的Hsp70（例如恶性疟原虫（Plasmodium falciparum），即疟疾的主要病原体）可在E. coli中替代DnaK的功能6,9。基于此，已建立了一种以E. coli为基础的互补实验方法，通过在E. coli中异源表达Hsp70来研究其细胞保护功能。该实验通常采用DnaK缺陷型或表达功能受损的天然DnaK的E. coli细胞。虽然在正常条件下DnaK对E. coli的生长并非必需，但在高温或其他应激条件下培养时，DnaK则成为细胞存活所必需的蛋白10,11。

E. coli 中用于通过互补实验研究 Hsp70 功能的菌株包括 E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) 和 E. coli dnaK756。E. coli dnaK103 细胞产生一种截短且无功能的 DnaK 蛋白，因此该菌株在 30 °C 下可正常生长，但对冷和热应激敏感12,13。类似地，E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) 菌株在高于 40 °C 的条件下无法生长14,15。E. coli dnaK756 菌株表达一种突变的天然 DnaK 蛋白（DnaK756），其在第 32、455 和 468 位点发生甘氨酸到天冬氨酸的三重替换，导致蛋白质稳态功能受损。因此，该菌株对λ噬菌体 DNA 具有抗性14。此外，E. coli dnaK756 的 ATP 酶活性升高，而其对核苷酸交换因子 GrpE 的亲和力降低16。E. coli DnaK 突变菌株是通过互补法研究 Hsp70 分子伴侣活性的理想模型。由于 DnaK 仅在应激条件下为必需，互补实验通常在较高温度下进行（图 1）。使用 E. coli 进行此类研究的一些优势包括其基因组特征明确、生长迅速，以及培养和维持成本低廉17。

本文详细描述了一种利用E. coli dnaK756 细胞研究Hsp70功能的实验方案。本实验所用的Hsp70蛋白包括野生型DnaK及其嵌合体衍生物KPf（由DnaK的ATP酶结构域与Plasmodium falciparum Hsp70-1的C端底物结合结构域融合而成6,18）。KPf-V436F被异源表达作为阴性对照，因为该突变基本阻断了其与底物的结合能力，从而消除了其分子伴侣活性9。

方案

1. 转化

注意：培养过程中需使用无菌玻璃器皿、移液器吸头以及新鲜配制并经高压灭菌的培养基。在2×酵母胰蛋白胨（YT）琼脂培养基[1.6% 胰蛋白胨（w/v）、1% 酵母提取物（w/v）、0.5% NaCl（w/v）、1.5% 琼脂（w/v）]中培养大肠杆菌（E. coli）细胞。本实验方案中所用常规试剂及其来源详见材料表。

  1. 标记2.0 mL 微量离心管，并分装50 µL感受态细胞 E. coli dnaK756细胞，并将细胞置于冰上。
  2. 向含有感受态细胞的 2.0 mL 微离心管中，分别加入 10–50 ng 的 pQE60/DnaK、pQE60/KPf 和 pQE60/KPf-V436F 质粒 DNA9 分装至不同的离心管中。
  3. 将含有感受态细胞和质粒DNA的2.0 mL微量离心管置于冰上静置30 min。
  4. 将感受态细胞与DNA混合物在42 °C下热激60秒，然后将微量离心管放回冰上孵育10分钟。
  5. 加入950 µL新鲜的2x YT肉汤（预先在37 °C孵育），于37 °C、150转/分钟振荡条件下孵育1小时。如有必要，可延长细胞培养时间以促进其恢复。
    注意：避免剧烈振荡细胞。
  6. 用移液器吸取100 µL细胞，均匀涂布于含有50 µg/mL卡那霉素、相应菌株所需的10 µg/mL四环素以及100 µg/mL氨苄青霉素的2x YT琼脂平板上（参见 材料清单用于质粒筛选。
  7. 将剩余的细胞（体积约为 900 µL）在 5000 x g 条件下离心 1 分钟 g （在 4 °C 条件下）使用台式微量离心机离心。
  8. 倒出约 800 µL 的培养液，用剩余的培养基重悬沉淀的细胞。
  9. 将回收的细胞接种到2x YT琼脂平板上。
  10. 将两块琼脂平板在37 °C下孵育过夜（或约17 h）。
    注意：这些细胞生长非常缓慢，可能需要更长时间的培养。务必仔细观察可能最初非常微小的菌落。在离心后重悬细胞所用的平板（步骤1.7）可作为备用，以防细胞转化效率较低；在此情况下，沉淀的细胞可能有助于提高转化细胞的回收率。然而，若细胞转化效率很高，则接种浓缩细胞的琼脂平板在培养后可能出现菌体过度生长，难以分辨单菌落。此时，另一个琼脂平板可能更利于获得分布良好的单菌落。

2. 细胞铺板

  1. 从转化子中挑取单个菌落，接种于10 mL添加有50 µg/mL卡那霉素、10 µg/mL四环素（用于筛选E. coli dnaK756 细胞）和100 µg/mL氨苄青霉素（用于质粒筛选）的2x YT液体培养基中。
    注意：使用容量不小于50 mL的三角瓶，以确保培养过程中充分通气。将接种物在37 °C、150 转/分钟振荡条件下培养过夜（17 小时）。
  2. 次日早晨测定OD600 吸光度值。
  3. 使用75%乙醇擦拭工作台面，为后续点样操作做好准备。
  4. 使用2 mL微量离心管，用2x YT液体培养基将菌液浓度调整至OD600 为2.0。
    注意：确保准确测定OD值，因为此步骤对统一各样品间的细胞密度至关重要。
  5. 使用2 mL微量离心管，将菌液进行连续梯度稀释，稀释范围从100 至10-5。
  6. 将用于点样的琼脂平板置于40 °C烘箱中，平板盖部分打开，使平板干燥。
    注意：为确保菌液点样位置均匀分布，可在一张纸上绘制线条，并打印出点样位置模板作为参照。
  7. 取2 µL梯度稀释后的菌液，点样于添加有50 µg/mL卡那霉素、10 µg/mL四环素、100 µg/mL氨苄青霉素以及0.5 mM IPTG（用于诱导重组蛋白表达）的琼脂平板上（参见材料表）。
  8. 每份样品分别点于两块独立的平板上（一块在37 °C培养，另一块在43.5 °C培养）。
    注意：避免刺破琼脂表面。
  9. 将对照样品与实验样品点在同一块平板上，以减少环境因素的影响。
  10. 快速完成点样操作，确保在细胞开始生长前完成全部点样，否则可能导致生长模式偏差。
    注意：点样时应避免产生气溶胶，以免污染平板。同时，点样间隙应保持平板封闭，防止污染。
  11. 将其中一块平板置于37 °C（允许生长温度）培养，另一块置于非允许生长温度43.5 °C培养。
    注意：培养时将平板倒置，防止冷凝水积聚在盖子上，否则冷凝水可能将点样的菌落冲离原位。
  12. 将所有平板同时放入培养箱，并在次日早晨之前避免打开培养箱门。
    注意：培养期间应避免多次开启培养箱门，因为空气进入可能导致温度波动，从而对细胞生长产生不利影响。

3. 验证重组蛋白的表达

  1. 使用无菌接种环，挑取转化后的 E. coli dnaK756 菌落中剩余的部分细胞。
  2. 将细胞接种至10 mL YT液体培养基中，培养基中添加50 µg/mL 卡那霉素、10 µg/mL 四环素和100 µg/mL 氨苄青霉素。在37 °C、150 转/分钟振荡条件下培养过夜（17 小时）。
  3. 将上述培养物转移至90 mL含有步骤3.2所述相应抗生素的无菌2x YT液体培养基中。使细胞生长至对数中期（OD600 = 0.4–0.6）。
  4. 在诱导前取2 mL培养样品（0 小时诱导样品）。
  5. 加入IPTG至终浓度为1 mM，以诱导蛋白表达，并将细胞在37 °C重新培养。
  6. 在诱导后6 小时再取2 mL样品。
  7. 在4 °C条件下，以5000 × g 离心10 分钟收集细胞。
  8. 弃去上清液。
  9. 将沉淀用PBS缓冲液（137 mM NaCl、27 mM KCl、4.3 mM Na2HPO4、1.4 mM KH2PO4）重悬，并于-20 °C保存。

4. SDS-PAGE 和蛋白质印迹分析

  1. 按照先前所述方法制备2块10% SDS凝胶19。
  2. 保留其中一块SDS-PAGE凝胶，用于后续考马斯亮蓝染色以观察蛋白质条带；使用另一块SDS-PAGE凝胶进行Western印迹分析。
  3. 取80 µL重悬的样品，与20 µL 4x Laemmli SDS上样缓冲液混合。
  4. 将混合物在100 °C下煮沸10分钟，然后每样上样10 µL至预制的SDS凝胶中（见材料表）。
  5. 在室温下，以120 V电压在1x SDS电泳缓冲液（25 mm Tris，250 mm 甘氨酸，0.1% (w/v) SDS）中进行电泳，持续1小时。
  6. 用考马斯亮蓝染色液（见材料表）染色凝胶1小时，随后用脱色液（50% (v/v) 甲醇，10% (v/v) 冰醋酸溶于蒸馏水中）脱色2小时。
  7. 使用凝胶成像系统观察凝胶中的蛋白质条带（见材料表）。按照上述方案，使用相同样品重新跑一块SDS-PAGE凝胶。
  8. 电泳结束后，取出SDS-PAGE凝胶进行Western印迹分析，方法同前文所述19。
  9. 将蛋白质转移后的硝酸纤维素膜在洗涤缓冲液（TBS-Tween，pH 7.4 [50 mM Tris，150 mM NaCl，1% (v/v) Tween]）中洗涤3次，每次15分钟。
  10. 分别使用α-DnaK抗体（见材料表）检测DnaK，以及α-PfHsp70-17 检测KPf及其突变体KPf-V436F。
  11. 将一抗以1:2000比例溶于5%脱脂牛奶中，在4 °C、摇床转速60转/分钟条件下孵育1小时。
  12. 用TBS-Tween缓冲液洗涤硝酸纤维素膜3次，每次15分钟，以去除非特异性结合的抗体。
  13. 在与前一步相同的条件下，将膜与二抗（α-兔，见材料表）孵育，随后按照与一抗相同的条件进行后续洗涤。
  14. 使用增强型化学发光（ECL）检测试剂显影条带。
  15. 使用凝胶成像仪观察条带。

结果

图2展示了在允许性生长温度37 °C和43.5 °C下点样并培养的含有细胞的琼脂平板扫描图像。在图2的右侧，切出的蛋白印迹条带分别代表DnaK、KPf和KPf-V436F在E. coli dnaK756细胞中的表达情况。如预期所示，所有在37 °C允许性生长温度下培养的E. coli dnaK756细胞均能够生长。然而，在43.5 °C非允许性生长条件下，只有异源表达DnaK和KPf的细胞能够生长，这与先前报道结果一致6,9,20（图2）。另一方面，表达KPf-V436F的细胞仅能在37 °C下生长，而在43.5 °C下无法生长。这表明DnaK和KPf能够在热应激条件下恢复E. coli dnaK756细胞的生长缺陷。异源表达KPf-V436F的细胞在43.5 °C下无法支持细胞生长，说明该蛋白缺乏分子伴侣功能。因此，KPf-V436F可作为理想的阴性对照蛋白。

大肠杆菌 dnaK756 菌株热应激反应示意图；蛋白质保护；Hsp70 质粒效应；>40°C
图1互补实验原理使用 E. coli dnaK756 用于研究异源表达蛋白的分子伴侣功能的细胞 E. coli dnaK756 表达一种无法在热应激条件下保护细胞的天然DnaK756蛋白。引入功能性异源Hsp70可使细胞在热应激暴露后免于死亡。 请点击此处查看该图的放大版本。

在37°C和43.5°C下进行细菌生长实验与蛋白质印迹分析；蛋白质研究。
图2：互补平板实验，展示DnaK与KPf在高温胁迫下对E. coli dnaK756细胞的保护能力。 转化后的细胞在37 °C（允许生长温度）和43.5 °C（非允许生长温度）下培养。细胞经标准化后以系列稀释方式点板。“N”代表“原液”，即未稀释细胞的第一点。最右侧为蛋白免疫印迹条带，显示三种蛋白的表达情况。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

该方案展示了其用途 E. coli dnaK756利用异源表达的Hsp70研究其分子伴侣功能。该检测方法可用于筛选靶向Hsp70功能的抑制剂 细胞内然而，该方法的一个局限性在于Hsp70无法替代DnaK的功能 E. coli 与本实验不兼容。缺乏翻译后修饰21 某些非天然Hsp70的功能缺失可能归因于其在体内的非功能性表现 E. coli 系统。基于酵母的互补实验22 可能解决某些现有不足之处 E. coli-为基础的检测方法

确保结果可重复性的几个关键步骤至关重要。这些步骤包括在涂布过程中确保仅使用由相应质粒构建体转化的细胞。此外，在整个操作过程中避免培养物污染也非常重要。另外，由于处于应激状态的E. coli DnaK细胞容易发生过度丝状化10，因此在培养过程中应避免剧烈振荡，因为这种物理应激会促进广泛的丝状化。过度丝状化的细胞在OD600处会产生较高的假性生长读数，导致对培养物生长的高估，并对涂布前的细胞标准化产生不利影响。尽管Hsp70在正常条件下对E. coli的生长并非必需，但缺乏该蛋白的细胞对环境应激敏感10。因此，E. coli dnaK756 细胞在转化后或从甘油保存菌种复苏过程中生长缓慢得多。此外，它们对温度波动极为敏感。因此，一旦将涂布好的琼脂平板放入培养箱后，直到观察平板时才应打开培养箱门。

Western blot 数据对于确认重组 Hsp70 蛋白在 E. coli dnaK756 细胞中的表达至关重要。若相应蛋白未能表达，则会导致在非许可生长温度下培养的细胞出现假阴性结果。

披露

作者无竞争性财务利益或其他利益冲突。

致谢

本工作获得了国际遗传工程与生物技术中心（ICGEB）资助项目（编号：HDI/CRP/012）、文达大学研究理事会（编号：I595）、南非科学技术部（DSI）及南非国家研究基金会（NRF）（资助编号：75464）的经费支持。 & 92598）资助，授予 AS。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-β-巯基乙醇Sigma-Aldrich8,05,740上样缓冲液组分
乙酸Labchem101005125脱色液组分
丙烯酰胺Sigma-Aldrich8008300100SDS 组分
琼脂MerckHG000BX1.500培养基和液体生长实验组分
琼脂糖Clever Scientific14131031经认证的分子生物学级琼脂糖
过硫酸铵Sigma-Aldrich101875295SDS-PAGE 凝胶组分
氨苄青霉素VWR International0339—EU—25G选择性抗生素
BisSigma-aldrich1015460100SDS 组分
溴酚蓝Sigma-Aldrich0449-25G上样缓冲液组分
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4用于感受态细胞制备
考马斯亮蓝VWR International443293XSDS-PAGE 染色剂
磷酸氢二钠Sigma-AldrichRB10368PBS 缓冲液组分
ECLThermofischer Scientific32109Western 印迹检测试剂
溴化乙锭Thermofischer Scientific17898DNA 插入性染料
甘油MerckSAAR2676520L上样缓冲液组分
甘氨酸VWR International10119CUSDS 组分
IPTGGlentham life sciences162IL诱导剂
卡那霉素MelfordK0126选择性抗生素
氯化镁MerckSAAR4123000EM培养基和液体生长实验组分
甲醇Labchem113140129脱色液组分
磷酸二氢钾Merck1,04,87,30,250PBS 缓冲液组分
蛋白胨MerckHG000BX4.250培养基和液体生长实验组分
氯化钾MerckSAAR5042020EMPBS 缓冲液组分
PVDF 膜Thermofischer scientificPB7320Western 印迹膜
氯化钠MerckSAAR5822320EM培养基和液体生长实验组分
十二烷基硫酸钠VWR International108073用于分离表达蛋白
Spectramax iD3Separations373705019全自动酶标仪
TEMEDVWR internationalACRO420580500SDS 凝胶组分
四环素Duchefa BiochemiesT0150.0025选择性抗生素
TrisVWR International19A094101SDS 凝胶组分
Tween20MerckSAAR3164500XFWestern 洗涤缓冲液组分
Western 转膜槽Thermofisher ScientificPB0112将蛋白质转移至硝酸纤维素膜
酵母提取物MerckHG000BX6.500培养基和液体生长实验组分
α-DnaK 抗体InqabaBK CAC09317一抗
α-兔抗体Thermofischer scientific31460二抗

参考文献

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