本文所述的大鼠异位辅助性肝移植方案为研究肝同种异体移植物排斥反应的机制提供了一种实用的实验工具。该模型有助于减轻大鼠原位肝移植过程中的手术难度和动物应激反应。
本文内容
摘要
摘要
小型动物移植模型对于研究临床前可行治疗干预措施的器官耐受性研究不可或缺。大鼠肝移植（LTx）方案通常采用原位模型，即切除受体原有的肝脏并以供体肝脏替代。这一技术要求较高的外科手术需要高超的显微外科技术，且由于无肝期和下半身缺血时间较长，手术复杂性进一步增加。因此，人们发展出一种较为简便的异位移植方法，该方法操作更快，且无无肝期和下半身缺血时间，从而减少了受体动物术后应激反应。
该异位肝移植（LTx）方案包括两个主要步骤：从供体大鼠切除肝脏，并将完整肝脏移植至受体大鼠体内。在供体肝切除过程中，外科医生结扎肝上腔静脉（SHVC）和肝动脉（HA）。在受体侧，外科医生移除左肾，并将供体肝脏放置于适当位置，使门静脉（PV）、肝下腔静脉（IHVC）和胆管朝向肾血管。随后，外科医生将受体肾静脉断端与肝脏的IHVC进行端对端吻合，并使用支架将PV与肾动脉进行动脉化吻合。胆汁引流采用肝输尿管吻合术，即将胆管与受体输尿管吻合，使胆汁经由膀胱排出。
移植手术的平均持续时间为130分钟，冷缺血时间约为35分钟，热缺血时间少于25分钟。同系移植中辅助肝脏的苏木精-伊红组织学检查显示，移植后30天肝细胞结构正常，未见明显的实质改变。相比之下，移植后8天的同种异体移植物标本显示出广泛的淋巴细胞浸润，Banff评分系统的排斥活性指数评分为9分。因此，该肝移植方法提供了一种低发病率的排斥模型，可作为原位肝移植的替代方案。
引言
小型动物肝移植（LTx）是研究肝脏排斥机制的重要模型。1968年，Lee和Edgington1首次报道了大鼠异位辅助性肝移植联合门静脉动脉化（HALT-PVA）技术，利用受体的肾静脉和肾动脉对移植的辅助肝脏进行血管重建。随后，Hess等2对该技术进行了改进，通过缩小受体自身肝脏和供体肝脏的体积，并重建供体胆管连接，减轻了原生肝与辅助肝之间的功能竞争，从而实现了移植物的长期存活。此后，套管吻合技术的引入进一步优化了该模型3,4，Schleimer等5确定了调节血流的最佳支架直径，以实现生理性的门静脉血流，避免移植物出现高灌注或低灌注。其他研究者对该方法进行了重要修改，例如采用脾动脉6或髂总动脉7为移植物供血，也有研究者建立了仅依赖静脉血8或仅通过肝动脉供以动脉血9的辅助肝移植模型。
本研究假设，受体原位肝脏的功能竞争不会干扰同种异体移植物的排斥反应，因此我们基于流量调控的Schleimer模型10建立了一种移植方案，该方案不涉及对受体原位肝脏或辅助性供肝的任何体积缩小。选择受体左侧作为移植肝脏的植入位置，因为该位置可使受体肾血管与供体肝脏血管之间实现最佳的空间对位。最初，我们尝试通过肝肠吻合术进行胆道重建，但这些试验仅进一步证实了Schleimer 的观点，即"胆道引流是肝移植的薄弱环节"10。这一问题促使我们开发了一种新技术，即使用支架将供体胆管与受体输尿管进行端对端吻合，使胆汁可通过膀胱排出。采用肝输尿管吻合术的一个显著优势是，可通过观察尿液每日监测移植肝的功能状态：当移植肝分泌胆汁时，尿液会呈现明亮的黄色。图1展示了HALT-PVA方法的示意图概览。
与原位大鼠肝移植（LTx）相比，异位肝移植的一个重要优势在于不存在无肝期或全身下半部分缺血时间，从而使异位移植受体能够更快、更顺利地恢复。此外，采用原位移植方法的肝移植免疫学研究通常依赖于受体发生严重排斥反应或死亡作为实验终点，而异位移植则不同，即使移植物因排斥反应而失去功能，动物仍能保持健康状态。异位移植方法的这两个特点均符合国际“3R原则”（替代、减少和优化）11 的理念，该原则旨在建立一个最大限度减少实验动物所经历的疼痛、痛苦和应激，并改善其福利状况的框架。
本文报道的HALT-PVA模型是一种在临床前研究中用于探讨同种异体肝移植物排斥反应机制的实用且可靠的方法。这一有用的实验技术有助于克服大鼠原位肝移植（LTx）过程中较高的手术要求及动物应激。未来，我们计划利用该方法研究急性免疫排斥反应的机制，同时探索抑制肝移植物排斥反应的新靶点和治疗策略。
方案
动物在威斯康星大学麦迪逊分校医学研究所（UW）的动物护理设施中按照机构指南在特定病原体阴性条件下进行繁殖和饲养。研究方案（编号 M006022）已获得威斯康星大学医学院和公共卫生学院机构动物护理和使用委员会批准，所有动物均得到伦理对待。
1. 动物
- 选用体重为205-235 g的成年Lewis雌性大鼠和体重为250-280 g的Lewis雄性大鼠作为供体大鼠，选用体重为365-420 g的成年雄性Lewis大鼠和Brown Norway大鼠作为受体大鼠。
- 通过将Lewis供体移植至Lewis受体进行同系移植，而将Lewis供体移植至Brown Norway受体进行同种异体移植。
- 所有手术均需由两人协作，使用双人共览显微镜完成。
2. 辅助性肝供体获取手术步骤
- 在诱导室中通过吸入5%异氟烷麻醉供体大鼠。记录大鼠体重，并使用电动剪刀剃除腹部毛发。
- 将大鼠仰卧位固定在加热手术垫上，鼻部置于麻醉面罩中，并用胶带固定四肢。按照当地动物伦理委员会批准的无菌技术对大鼠腹部进行消毒，并将异氟烷浓度下调至2%。
- 使用剪刀从耻骨至剑突做一条纵向正中皮肤和肌肉切口。在纵向切口的中点附近，向左右两侧横向延伸切口，然后在腹壁两侧及剑突处安装牵开器。
- 使用湿润的棉签将肠管向腹部左侧推开，同时用弹簧剪剪断连接肝脏的胃韧带，并将肠管固定在湿润纱布下。用一小块浸有温盐水的无菌纱布覆盖肝脏。
- 使用湿润棉签将肝脏牵开，解剖镰状韧带、三角韧带、肝胃韧带和肝十二指肠韧带。随后，使用双极电凝钳烧灼并切断左外侧叶与前尾状叶之间的食管旁血管。
- 使用弯头镊子或持针器，在膈肌下方分离下腔静脉（SHVC）后方组织，然后将一根5-0丝线从SHVC下方穿过并松松打双结，以备后续使用。
- 将右后外侧肝叶向上牵拉，切断韧带并固定于湿润纱布下。从后腹膜组织中游离出下腔静脉（IHVC），直至右肾静脉水平，并尽可能靠近IHVC处用6-0丝线结扎右肾上腺静脉。该静脉在移取移植物时再行切断。
- 使用27 G水分离针（图2A），将门静脉（PV）从周围结缔组织中分离出来，并通过7-0丝线结扎并切断幽门静脉和脾静脉，从而将其与这些分支分离。
- 游离肝总动脉，使用6-0丝线在其穿过门静脉下方的位置附近进行结扎并切断。
- 在胃十二指肠动脉分叉处用5-0丝线结扎胆管，尽可能保留胆管周围的脂肪组织；特别注意避免将胆管与肝固有动脉分离，同时保持总体长度尽可能短。
- 使用弹簧剪在结扎位置近端的胆管壁上做一个小切口。将一根直径0.0215"、长5 mm的聚酰亚胺导管支架插入胆管腔内，并用6-0丝线固定，留出一端较长线头以备后续使用。在5-0和6-0结扎线之间剪断胆管。
- 使用手术染色笔标记下腔静脉（IHVC）和门静脉（PV）的上侧，以便在吻合时对齐血管，然后尽可能远离肝脏的位置用微血管夹夹闭门静脉。
- 在微血管夹近端的门静脉处插入带有26 G针头的20 mL注射器，用10–15 mL冰冻肝素化生理盐水灌注肝脏；同时，使用弹簧剪尽可能靠近右肾静脉处切断下腔静脉（IHVC）。
- 使用弹簧剪在微血管夹近端切断门静脉，收紧先前绕SHVC放置的5-0结扎线，并解剖膈肌以横断胸腔段下腔静脉，从而切除肝脏。
- 继续解剖肝脏背部剩余的韧带，并切断先前已结扎的肾上腺静脉。将切除的肝脏置于盛有冷盐水的冰上保存。
3. 辅助性肝脏受体移植手术步骤
- 将受体大鼠置于诱导麻醉舱中，通过吸入5%异氟烷进行麻醉。记录大鼠体重，并使用电动剃毛器剃除腹部毛发。
- 将大鼠仰卧位固定在加热手术垫上，鼻部置于麻醉面罩中，四肢用胶带固定。涂抹眼用润滑剂，按照当地动物伦理委员会批准的无菌技术对腹部进行消毒，并将异氟烷浓度下调至2%。
- 使用剪刀从耻骨至剑突处沿中线纵向切开皮肤和肌肉，随后在腹壁两侧安装牵开器。
- 用湿润的棉签将肠管推向腹部右侧，并用湿润纱布覆盖。另取一块湿润纱布覆盖胃、脾脏和肝脏，暴露左侧肾脏及其肾血管。
- 使用27 G水分离针和钝头镊子，将左肾静脉与肾动脉分离，小心清除两根血管周围的脂肪和结缔组织。
- 游离性腺静脉和肾上腺静脉，并使用6-0丝线在靠近肾静脉处暂时结扎。使用双极电凝镊灼烧所有微小侧支，隔离位于主动脉/下腔静脉与肾脏之间的肾静脉和肾动脉。
- 在下极处用6-0丝线结扎并固定输尿管。使用手术染色笔标记肾静脉和肾动脉，以帮助吻合时定位血管方向，并确保无扭曲。
- 尽可能靠近主动脉和下腔静脉处，用微血管夹夹闭肾动脉和肾静脉。使用弹簧剪在血管分叉稍远端切断肾动脉，并在下腔静脉与肾脏之间约中点处切断肾静脉。从周围结缔组织中游离左侧肾脏并将其摘除。
- 使用27 G水分离针向两根血管内灌注肝素化生理盐水，以清除所有残留血液。
- 使用弹簧剪在肾动脉分叉处的分叉口制作一个小的鱼口状开口，形成漏斗形切口，并插入一段由26 G导管切割而成的8 mm支架（图2B）。用6-0丝线固定支架，保留一端线头以备后续使用。
- 植入供体肝脏，使其门静脉（PV）、肝下下腔静脉（IHVC）和胆管朝向受体的左肾静脉和肾动脉。使用9-0尼龙线，在IHVC-肾静脉吻合口的对侧位置安装两根固定缝线。
- 比较两血管宽度，使用弹簧剪在肾静脉断端做小的鱼口状切口，直至其宽度与供体IHVC相近（图2C）。
- 使用9-0尼龙线，以连续缝合方式在血管前壁和后壁共缝合9至10针，将肝脏IHVC端对端吻合至肾静脉。也可采用套管法完成该吻合3,4。
- 确认肾动脉位于IHVC下方（图2D），将先前置于肾动脉内的支架插入肝脏门静脉，并用6-0丝线固定，保留一端线头以便与动脉对侧线头连接。拉紧两端线头，防止其从支架上滑脱。
- 先移除肾静脉上的微血管夹，再移除肾动脉上的微血管夹。
- 肝脏再灌注期间，使用纱布和棉签在吻合区域周围施加轻柔压力，直至吻合通畅（图2D）。移除先前在肾上腺静脉和性腺静脉上放置的临时结扎线。
- 小心地从周围结缔组织中游离左侧输尿管末端约10 mm，保留大量脂肪组织附着。使用弹簧剪在先前5-0结扎线近端的输尿管壁上做一个小切口。
- 将先前连接于胆管的聚酰亚胺支架插入输尿管壁的小切口中。用6-0丝线固定，并将其中一端与支架胆管侧的长线头打结，牢固拉紧两端。
- 将肠管复位至正常解剖位置（图2E），用2–3 mL生理盐水冲洗腹腔，然后使用3-0丝线连续缝合分两层关闭腹腔。
- 皮下注射0.1 mg/kg布托啡诺，将受体动物置于清洁、加热的笼中，监测恢复情况1–2小时后，再转移至动物饲养设施。
4. 术后随访
- 术后第2天开始，每天皮下注射异基因移植受体肝素（1 IU/g）。
- 术后第2天开始，每两天皮下注射同基因移植受体肝素（1 IU/2 g）。
结果
目前，已使用29对大鼠建立了HALT-PVA方案，其中包括17例同基因移植和12例异基因移植。同基因移植肝脏以70%的成功率存活至预定的8天或30天实验终点，而异基因移植肝脏以50%的成功率存活至预定的3天或8天终点。失败案例包括因手术并发症死亡的大鼠，以及受体存活但辅助肝脏功能失常的情况。
手术平均持续时间为130分钟，冷缺血时间约为35分钟，热缺血时间少于25分钟。若无术中并发症，受体动物在10至20分钟内苏醒并恢复活动，1小时内开始饮水，24小时后活动行为与正常健康大鼠无异。
同基因型肝移植在移植后30天显示出良好的颜色和胆管通畅性（图3），而苏木精-伊红（H&E）组织学在术后8天和30天均显示肝细胞结构正常，实质未见明显改变（图4A、B）。异基因移植仅3天后，组织学即显示明显的门脉炎症（图4C），而术后8天的异基因移植物则表现为急性细胞性排斥反应，伴有广泛的淋巴细胞浸润（图4D）。
由经认证的肝脏病理学专家对具有代表性的同种异体和同系肝移植（LTx）标本进行评估，并采用Banff分级方案排斥活性指数（RAI）12对排斥反应进行评分。病理学评估结果显示，术后8天和30天的同系移植组均无排斥反应，Banff RAI评分为0；而术后8天的同种异体移植组则表现为重度排斥，Banff RAI评分为9（表1）。
图1：大鼠HALT-PVA手术的示意图。 使用支架将门静脉（PV）与左肾动脉连接实现动脉化，下腔静脉（IHVC）与左肾静脉行端-端吻合，胆管通过支架与输尿管连接。请点击此处查看该图的放大版本。
图2: 手术操作步骤。 (A) PV的水分离。使用27 G水分离针将PV从周围结缔组织中分离。B) 插入动脉支架。将动脉支架插入肾动脉分叉处切开的一个小型漏斗状开口中。C) 扩宽肾静脉。为了使受体肾静脉的宽度与供体下腔静脉（IHVC）相匹配以进行吻合，在放置两针固定缝线后，于受体肾静脉断端做一小的鱼口状切口。 （D吻合后立即灌注的肝脏移植物。将肾动脉和门静脉连接置于肾静脉和下腔静脉后方，对于预防移植物血栓形成至关重要。E大鼠HALT-PVA在 原位。 在将肠道复位之前，辅助肝脏被放置于腹腔左侧壁。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 3：同基因型辅助性肝移植术后30天情况。 （A）术后30天，辅助肝的颜色和质地与受体原肝相似，而（B）胆管和门静脉（PV）支架仍保持通畅且无梗阻。 请点击此处查看该图的高清版本。
图4：辅助性肝移植物的组织学检查。 苏木精-伊红（H&E）染色显示（A）移植后第8天和（B）第30天的同系移植物，呈现正常的肝细胞结构；以及（C）移植后第3天和（D）第8天的异系移植物，显示门脉炎症和淋巴细胞浸润。比例尺：50 µm。 请点击此处查看本图的放大版本。
| 同种异体移植 | 门脉炎症 | 胆管损伤 | 静脉内膜炎症 | Banff RAI |
| 3天（LT-34） | 2 | 2 | 3 | 7 |
| 3天（LT-38） | 1 | 0 | 0 | 1 |
| 8天（LT-20） | 3 | 3 | 3 | 9 |
| 8天（LT-40） | 3 | 3 | 3 | 9 |
| 同系移植 | ||||
| 8天（LT-13） | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 8天（LT-19） | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 30天（LT-28） | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 30天（LT-32） | 0 | 0 | 0 | 0 |
表1：Banff 分型标准。 同种异体与同系大鼠肺移植的排斥活动指数（RAI）。
讨论
对于终末期肝病患者，肝移植是唯一的治疗选择，美国每年进行近9,000例肝移植手术13。然而，多达25%的肝移植受者会出现免疫排斥反应，这种排斥反应对移植器官和患者均具有严重危害14,15。为了改善肝移植术后的预后，亟需建立创新模型以研究器官排斥反应，并制定有效策略以降低排斥发生率。
与原位大鼠肝移植相比，目前的异位模型建立起来明显更为简便。技术难度的最佳衡量标准是考虑手术过程中最困难的单一操作步骤，即下腔静脉与肾静脉的端对端吻合。我们个人倾向于采用传统缝合方法进行这一连接，而其他人则发现套管系统更为方便3,4；无论采用哪种方式，只要能够熟练地以任意方法完成直径3 mm静脉的端对端吻合，就已具备完成该手术所需的全部技术能力。若有双人共用显微镜的条件，我们更倾向于由两人协作完成手术；然而，这并非本方案成功的必要条件，因为该手术亦可由单人独立完成。
该模型术后主要并发症为移植肝的血栓形成，其发生由以下三种因素引起。首先，动脉支架本身可能诱发血栓，如果支架末端存在毛刺或不规则结构，会导致血流产生涡流和湍流。支架应使用锋利的剃刀切割，而非剪刀，并在显微镜下检查，确保无任何缺陷。其次，若肾动脉/门静脉支架吻合口位于肾静脉/下肝静脉（IHVC）吻合口之上，则会限制血流并诱发血栓。动脉支架的最终放置位置应在下肝静脉（IHVC）下方，参见图2D。第三，术后使用抗凝剂肝素（Heparin）对于预防同种异体移植中的血栓形成至关重要，而较低剂量的肝素也有助于消除同基因型移植物中血栓形成的风险。
与同基因移植相比，异基因移植的较低存活率反映了排斥反应中辅助肝脏的促血栓特性，这种特性会引发动脉支架的血栓形成。为防止异基因移植中支架发生血栓，需多次尝试以确定合适的肝素给药方案。最初，在前6例成功完成手术的异基因移植物受体中，50%的辅助肝脏因血栓形成而失败；但在提高肝素剂量后，后续最后3例异基因移植均未发生血栓并成功存活。随着有效肝素剂量的确定，我们预计异基因移植的成功率将显著提高。同样，大多数同基因移植的失败发生在早期开发阶段，我们预期同基因移植的成功率也将随之改善。
我们采用了Lewis大鼠到Brown Norway大鼠的急性排斥模型进行肝移植（LTx），因为Brown Norway到Lewis品系组合不会发生排斥16。值得注意的是，当正位移植方法用于该排斥模型时，一旦发生肝脏排斥，受体动物会出现严重病态，表现为精神萎靡、活动减少、停止进食，并在14天内死亡16。然而，在本研究的异位LTx模型中，并不以死亡作为实验终点，且不会出现病态情况；即使辅助肝脏完全被排斥，动物在整个实验期间仍保持健康和活跃状态。毫无疑问，该异位LTx模型显著减少了受体动物所经历的疼痛、痛苦和应激反应。
常温下的最新进展 离体 肝脏灌注（NEVLP）是临床肝移植前肝脏保存方法的一项令人振奋的进展17,18,19在NEVLP期间，供体肝脏恢复生理活性，可在移植前进行治疗干预20,21NEVLP 也越来越多地用于评估边缘器官（来自老年或肥胖供体的肝脏，或心脏死亡后获取的供体肝脏）的活力22,23尽管这一成果令人振奋，但目前仅有少数实验室能够成功进行大鼠肝脏的NEVLP移植。24,25这可能是由于动物在手术过程中承受的压力，以及在进行常温机械灌注（NEVLP）和移植前对肝脏处理所需的技术要求较高所致。相比之下，本文所述的异位肝移植（LTx）手术技术对操作技术的要求较低，且对动物造成的应激更小。因此，该方法可能是用于NEVLP及后续移植的小动物模型中的一个可行选择。
综上所述，我们提出了一种替代性的低发病率肝移植模型，该模型可能对未来移植排斥研究具有重要意义。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号K08AI155816，授予DA。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3-0 丝线缝合线 | Ethicon | C013D | |
| 5-0 丝线结扎线 | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 6-0 丝线结扎线 | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| 7-0 丝线结扎线 | Teleflex | 103-s | |
| 9-0 聚酰胺缝合线 | AROSurgical | T05A09N10-13 | 黑色 |
| 双极电凝器 | Codman & Shurtleff Inc. | P.H. 234 | |
| 盐酸丁丙诺啡 | Hospira | 409201232 | |
| 镊子，Adson-Brown 型 | Fine Science Tools | 11627-12 | 12.5 cm |
| 镊子，弯头 Dumont 型 | Fine Science Tools | 11253-25 | 医用 #5/45 11 cm |
| 镊子，缝合打结用 | Fine Science Tools | 18025-10 | 10 cm |
| 肝素钠注射液，USB | Fresenius Kabi | 504015 | 每 10 mL 含 10,000 USP 单位 |
| 水分离套管 | Ambler Surgical | 1021E | 27 G |
| 异氟烷 | Dechra Vet. Products | 17033-091-25 | |
| 静脉导管 | Kendall | 2619PUR | 26 G x 3/4" |
| 磁性牵拉系统 | Fine Science Tools | 18200-50 | |
| 微型夹钳 | Fine Science Tools | 18055-05 | 6 mm |
| 微型夹钳 | Fine Science Tools | 18055-06 | 4 mm |
| 微型夹钳施加器 | Fine Science Tools | 18057-14 | 14 cm |
| 微型持针器 | S&T | C-14 | 14 cm |
| 显微镜 | Zeiss | Universal S3 | 双目 |
| 眼科软膏 | Puralube | 14590500 | |
| 聚酰亚胺管 | Cole Parmer | 95820-04 | 外径 0.0215"，内径 0.0195"，壁厚 0.0010" |
| 生理盐水 | Baxter | 281324 | 0.9% 氯化钠 |
| 手术弹簧剪 | S&T | SDC-15 | 钝头 14 cm |
| 手术弹簧剪 | Fine Science Tools | 15021-15 | Vannas 型 14 cm |
参考文献
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