利用输尿管肝管吻合术的异位辅助性全肝大鼠移植模型用于同种异体移植物排斥研究

摘要

本文所述的大鼠异位辅助性肝移植方案为研究肝同种异体移植物排斥反应的机制提供了一种实用的实验工具。该模型有助于减轻大鼠原位肝移植过程中的手术难度和动物应激反应。

摘要

小型动物移植模型对于研究临床前可行治疗干预措施的器官耐受性研究不可或缺。大鼠肝移植（LTx）方案通常采用原位模型，即切除受体原有的肝脏并以供体肝脏替代。这一技术要求较高的外科手术需要高超的显微外科技术，且由于无肝期和下半身缺血时间较长，手术复杂性进一步增加。因此，人们发展出一种较为简便的异位移植方法，该方法操作更快，且无无肝期和下半身缺血时间，从而减少了受体动物术后应激反应。

该异位肝移植（LTx）方案包括两个主要步骤：从供体大鼠切除肝脏，并将完整肝脏移植至受体大鼠体内。在供体肝切除过程中，外科医生结扎肝上腔静脉（SHVC）和肝动脉（HA）。在受体侧，外科医生移除左肾，并将供体肝脏放置于适当位置，使门静脉（PV）、肝下腔静脉（IHVC）和胆管朝向肾血管。随后，外科医生将受体肾静脉断端与肝脏的IHVC进行端对端吻合，并使用支架将PV与肾动脉进行动脉化吻合。胆汁引流采用肝输尿管吻合术，即将胆管与受体输尿管吻合，使胆汁经由膀胱排出。

移植手术的平均持续时间为130分钟，冷缺血时间约为35分钟，热缺血时间少于25分钟。同系移植中辅助肝脏的苏木精-伊红组织学检查显示，移植后30天肝细胞结构正常，未见明显的实质改变。相比之下，移植后8天的同种异体移植物标本显示出广泛的淋巴细胞浸润，Banff评分系统的排斥活性指数评分为9分。因此，该肝移植方法提供了一种低发病率的排斥模型，可作为原位肝移植的替代方案。

引言

小型动物肝移植（LTx）是研究肝脏排斥机制的重要模型。1968年，Lee和Edgington¹首次报道了大鼠异位辅助性肝移植联合门静脉动脉化（HALT-PVA）技术，利用受体的肾静脉和肾动脉对移植的辅助肝脏进行血管重建。随后，Hess等²对该技术进行了改进，通过缩小受体自身肝脏和供体肝脏的体积，并重建供体胆管连接，减轻了原生肝与辅助肝之间的功能竞争，从而实现了移植物的长期存活。此后，套管吻合技术的引入进一步优化了该模型^3,4，Schleimer等⁵确定了调节血流的最佳支架直径，以实现生理性的门静脉血流，避免移植物出现高灌注或低灌注。其他研究者对该方法进行了重要修改，例如采用脾动脉⁶或髂总动脉⁷为移植物供血，也有研究者建立了仅依赖静脉血⁸或仅通过肝动脉供以动脉血⁹的辅助肝移植模型。

本研究假设，受体原位肝脏的功能竞争不会干扰同种异体移植物的排斥反应，因此我们基于流量调控的Schleimer模型^10....

方案

动物在威斯康星大学麦迪逊分校医学研究所（UW）的动物护理设施中按照机构指南在特定病原体阴性条件下进行繁殖和饲养。研究方案（编号 M006022）已获得威斯康星大学医学院和公共卫生学院机构动物护理和使用委员会批准，所有动物均得到伦理对待。

1. 动物

1. 选用体重为205-235 g的成年Lewis雌性大鼠和体重为250-280 g的Lewis雄性大鼠作为供体大鼠，选用体重为365-420 g的成年雄性Lewis大鼠和Brown Norway大鼠作为受体大鼠。
2. 通过将Lewis供体移植至Lewis受体进行同系移植，而将Lewis供体移植至Brown Norway受体进行同种异体移植。
3. 所有手术均需由两人协作，使用双人共览显微镜完成。

2. 辅助性肝供体获取手术步骤

1. 在诱导室中通过吸入5%异氟烷麻醉供体大鼠。记录大鼠体重，并使用电动剪刀剃除腹部毛发。
2. 将大鼠仰卧位固定在加热手术垫上，鼻部置于麻醉面罩中，并用胶带固定四肢。按照当地动物伦理委员会批准的无菌技术对大鼠腹部进行消毒，并将异氟烷浓度下调至2%。
3. 使用剪刀从耻骨至剑突做一条纵向正中皮肤和肌肉切口。在纵向切口的中点附近，向左右两侧横向延伸切口，然后在腹壁两侧及剑突处安装....

结果

目前，已使用29对大鼠建立了HALT-PVA方案，其中包括17例同基因移植和12例异基因移植。同基因移植肝脏以70%的成功率存活至预定的8天或30天实验终点，而异基因移植肝脏以50%的成功率存活至预定的3天或8天终点。失败案例包括因手术并发症死亡的大鼠，以及受体存活但辅助肝脏功能失常的情况。

手术平均持续时间为130分钟，冷缺血时间约为35分钟，热缺血时间少于25分钟。若无术中并发症，受体动物在10至20分钟内苏醒并恢复活动，1小时内开始饮水，24小时后活动行为与正常健康大鼠无异。

同基因型肝移植在移植后30天显示出良好的颜色和胆管通畅性（图3），而苏木精-伊红（H&E）组织学在术后8天和30天均显示肝细胞结构正常，实质未见明显改变（图4A、B）。异基因移植仅3天后，组织学即显示明显的门脉炎症（图4C），而术.......

讨论

对于终末期肝病患者，肝移植是唯一的治疗选择，美国每年进行近9,000例肝移植手术¹³。然而，多达25%的肝移植受者会出现免疫排斥反应，这种排斥反应对移植器官和患者均具有严重危害^14,15。为了改善肝移植术后的预后，亟需建立创新模型以研究器官排斥反应，并制定有效策略以降低排斥发生率。

与原位大鼠肝移植相比，目前的异位模型建立起来明显更为简便。技术难度的最佳衡量标准是考虑手术过程中最困难的单一操作步骤，即下腔静脉与肾静脉的端对端吻合。我们个人倾向于采用传统缝合方法进行这一连接，而其他人则发现套管系统更为方便^3,4；无论采用哪种方式，只要能够熟练地以任意方法完成直径3 mm静脉的端对端吻合，就已具备完成该手术所需的全部技术能力。若有双人共用显微镜的条件，我们更倾向于由两人协作完成手术；然而，这并非本方案成功的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-0 丝线缝合线	Ethicon	C013D
5-0 丝线结扎线	Fine Science Tools	18020-50
6-0 丝线结扎线	Fine Science Tools	18020-60
7-0 丝线结扎线	Teleflex	103-s
9-0 聚酰胺缝合线	AROSurgical	T05A09N10-13	黑色
双极电凝器	Codman & Shurtleff Inc.	P.H. 234
盐酸丁丙诺啡	Hospira	409201232
镊子，Adson-Brown 型	Fine Science Tools	11627-12	12.5 cm
镊子，弯头 Dumont 型	Fine Science Tools	11253-25	医用 #5/45 11 cm
镊子，缝合打结用	Fine Science Tools	18025-10	10 cm
肝素钠注射液，USB	Fresenius Kabi	504015	每 10 mL 含 10,000 USP 单位
水分离套管	Ambler Surgical	1021E	27 G
异氟烷	Dechra Vet. Products	17033-091-25
静脉导管	Kendall	2619PUR	26 G x 3/4"
磁性牵拉系统	Fine Science Tools	18200-50
微型夹钳	Fine Science Tools	18055-05	6 mm
微型夹钳	Fine Science Tools	18055-06	4 mm
微型夹钳施加器	Fine Science Tools	18057-14	14 cm
微型持针器	S&T	C-14	14 cm
显微镜	Zeiss	Universal S3	双目
眼科软膏	Puralube	14590500
聚酰亚胺管	Cole Parmer	95820-04	外径 0.0215"，内径 0.0195"，壁厚 0.0010"
生理盐水	Baxter	281324	0.9% 氯化钠
手术弹簧剪	S&T	SDC-15	钝头 14 cm
手术弹簧剪	Fine Science Tools	15021-15	Vannas 型 14 cm