更正：腹股沟淋巴结活体显微成像

摘要

已对以下文章发布更正： 腹股沟淋巴结的活体显微镜观察。作者 和讨论 部分已 更新。

摘要

本文更正了 文章 10.3791/2551

方案

已对以下文章发布更正： 腹股沟淋巴结的活体显微镜观察。作者信息、摘要、 讨论和参考文献 部分已 更新。

作者部分已从以下内容更新：

Stephanie L. Sellers1
Geoffrey W. Payne2
1跨学科科学，不列颠哥伦比亚大学北部校区
2北部医学项目，不列颠哥伦比亚大学北部校区

至：

Stephanie L. Sellers1
Geoffrey W. Payne2
1跨学科学习，北不列颠哥伦比亚大学
2北不列颠哥伦比亚大学北部医学项目

引言部分已从以下内容更新：

遍布全身的淋巴结（LN）是免疫系统的重要组成部分。它们是诱导适应性免疫应答以及效应细胞发育的场所，因此在抵御病原体入侵和维持机体健康方面发挥着关键作用。淋巴结的研究选择取决于可及性及所需模型；腹股沟淋巴结位置适宜，便于开展与皮肤和生殖道黏膜感染相关的生物学模型研究。

腹股沟淋巴结（LN）与其他所有淋巴结一样，具有丰富的微血管网络为其提供血液供应。通常，该微血管网络包括淋巴结的主要供血小动脉，该小动脉随后分支并供应高内皮微静脉（HEVs）。HEVs 的结构特化，可在稳态和感染期间促进免疫细胞向淋巴结内的迁移。在上述两种情况下，HEVs 如何调控免疫细胞进入淋巴结是当前深入研究的领域。淋巴结供血小动脉对 HEVs 具有直接的上游调控作用，同时也是富含营养物质和细胞的血液进入淋巴结的主要来源。此外，供血小动脉的变化被认为在促进适应性免疫应答的启动中发挥重要作用。淋巴结微血管系统在维持淋巴结最佳血液供应以及调控免疫细胞流入方面具有显著重要性，这些因素是淋巴结正常功能及后续免疫应答的关键组成部分。

研究淋巴结微血管系统的能力 体内 对于阐明免疫系统与LN内微血管系统之间如何相互作用并相互影响至关重要。本文介绍了一种方法 体内 腹股沟淋巴结成像。我们专注于淋巴结微血管系统的成像，特别关注确保研究健康血管的方法、长时间维持活体血管成像的能力，以及血管程度的量化分析。本文还介绍了通过微血管灌注血管活性药物的方法，以及追踪和量化细胞迁移的潜力。

腹股沟淋巴结的活体显微镜检查可直接评估微血管功能，并实时观察免疫细胞、淋巴结与微循环之间的直接相互作用。该技术有望与其他多种免疫学技术、荧光细胞标记方法相结合，并可加以改造以研究其他淋巴结的血管系统。

至：

遍布全身的淋巴结（LN）是免疫系统的重要组成部分。它们是诱导适应性免疫应答以及效应细胞发育的场所，因此在抵抗病原体入侵和维持健康方面发挥着关键作用。选择何种淋巴结进行研究取决于其可及性及所需的研究模型；其中，腹股沟淋巴结位置适宜，非常适合用于皮肤和生殖道黏膜感染等具有生物学意义的模型研究¹。

腹股沟淋巴结（LN）与其他所有淋巴结一样，具有丰富的微血管网络为其提供血液供应。通常，该微血管网络包括淋巴结的主要供血小动脉，该小动脉随后分支并供应高内皮微静脉（HEVs）¹。HEVs 的结构特化，可在稳态和感染期间促进免疫细胞向淋巴结内的迁移。目前，HEVs 如何在这两种情况下调控免疫细胞进入淋巴结，仍是深入研究的领域。淋巴结供血小动脉对 HEVs 具有直接的上游调控作用，是富含营养物质和细胞的血液进入淋巴结的主要来源。此外，供血小动脉的变化被认为在促进适应性免疫应答的启动中发挥重要作用¹。淋巴结微血管系统在维持淋巴结最佳血液供应以及调控免疫细胞流入方面具有显著重要性，这些因素是淋巴结正常功能及后续免疫应答的关键组成部分¹。

研究淋巴结微血管系统的能力 体内 对于阐明免疫系统与LN内微血管系统之间如何相互作用并彼此影响至关重要。在此，我们介绍一种方法 体内 腹股沟淋巴结的成像。我们专注于淋巴结微血管系统的成像，特别关注确保研究健康血管的方法、长时间维持活体血管成像的能力，以及血管程度的定量分析。本文还介绍了通过微血管灌注血管活性药物的方法，以及追踪和定量细胞迁移的潜力。

腹股沟淋巴结的活体显微镜检查可直接评估微血管功能，并实时观察免疫细胞、淋巴结与微循环之间的直接相互作用。该技术有望与其他多种免疫学技术、荧光细胞标记方法相结合，并可加以改造以研究其他淋巴结的血管系统。

讨论 部分已更新，内容如下：

本文所展示的腹股沟淋巴结活体显微成像技术，能够实现对淋巴结内微血管系统的in-vivo（活体）成像，从而实现直接、实时的动态观察。淋巴结微血管系统的成像是一个独特的研究位点，可用于研究免疫反应与血管系统之间的相互作用。利用该技术，研究可集中于免疫反应本身、血管系统的改变，或二者之间的相互作用。

与所有实验方法一样，标准活体显微镜技术既有优势也存在局限性。标准活体显微镜（IVM），例如本文所述的制备方法，易于进行改良，作者先前已证明可通过引入荧光示踪染料或标记的细胞群体实现落射荧光显微成像。尽管标准IVM无法实现如双光子显微镜或血管造影术所能提供的三维成像与追踪，但仍可在二维层面实现细胞追踪，从而观察并量化细胞间以及细胞与血管系统之间的相互作用，并可结合 体内 给药后使用荧光抗体进行染色，可用于实时获取蛋白质/标志物表达的数据。

值得注意的是，其他成像技术通常需要静态环境以获取图像，常需夹闭手术区域或在平坦样本上加盖盖玻片。这在很大程度上限制甚至完全排除了在样本上主动灌注血管或其他介质以评估血管完整性与生理功能等的能力，也无法在体内显微镜（IVM）样本中开展传导性血管舒张等其他实验技术。此外，标准的体内显微镜技术不要求样本完全平坦，且不受动物呼吸等运动干扰的影响。这使得标准IVM技术可用于更多类型的手术区域，并具有更高的可重复性。本文所述的腹股沟淋巴结样本制备即为一例。鉴于淋巴结的大小和形状，若不损伤组织则无法将其制备成平坦样本，且其位置会因动物呼吸而产生显著运动。此类问题采用其他方法难以克服，但使用本文所述的标准IVM样本制备方法则可轻松解决。

总之，上述制备方法可与多种其他生化、血管和/或免疫学技术联合使用，例如活化或标记细胞亚群的转移、缺氧诱导，以及血管介质的过表达或耗竭。然而，进一步的应用取决于初始制备物的健康状态。因此，始终检测被成像和评估的血管系统的健康状况至关重要。获得健康制备物的关键要点包括：确保制备物在体温条件下持续用平衡的PSS灌流，以及在手术过程中尽量减少对手术区域的接触和机械刺激。

至：

本文所展示的腹股沟淋巴结活体显微成像技术，能够对淋巴结内的微血管系统进行在体成像，从而实现直接、实时的动态观察。淋巴结微血管系统的成像提供了一个独特的研究位点，可用于探索免疫反应与血管系统之间的相互作用。利用该技术，研究可集中于免疫反应本身、血管系统的改变，或二者之间的相互影响。

与所有实验方法一样，标准活体显微镜技术既有优势，也存在局限性^{1,2,3,4,5,6,7}标准的体外显微成像（IVM）技术，例如本文所述的制备方法，可轻松进行修改；作者此前已证明，通过引入荧光示踪染料或标记的细胞群体，可实现透射荧光显微镜观察。^{1,2,3,4,5,6,7}尽管标准的IVM无法提供双光子显微镜或血管造影所能实现的三维成像与追踪功能，但仍可在二维层面实现细胞追踪，从而观察并量化细胞间以及细胞与血管系统之间的相互作用，并结合 体内 给药后使用荧光抗体进行染色，可用于实时获取蛋白质/标志物表达的数据^{1,2,3,4,5,6,7}.

值得注意的是，其他成像技术通常需要静态环境以获取图像，常需夹闭手术区域或在平坦的标本上加盖盖玻片。这在很大程度上甚至完全限制了对样本主动灌注血管或其他介质以评估血管完整性与生理功能等的能力，也限制了在体内显微成像（IVM）标本中开展其他技术（如传导性血管舒张实验）的应用^2,3,4,6,7。此外，标准的体内显微成像（IVM）无需完全平坦的标本，且不受动物呼吸等运动干扰的影响^{1,2,3,4,5,6,7}。这使得标准IVM技术可用于更多类型的手术区域，并具有更高的可重复性。本文所述的腹股沟淋巴结标本即为一例。鉴于淋巴结的大小和形状，若强行将其压平将导致组织损伤；同时，其解剖位置会因动物呼吸而产生显著运动。此类问题在其他方法中难以克服，但采用本文所述的标准IVM标本制备方法则可轻松应对。

总之，上述制备方法可与多种其他生化、血管和/或免疫学技术联合使用，例如转移活化的或标记的细胞亚群、诱导缺氧状态，以及血管介质的过表达或耗竭。然而，进一步的应用取决于初始制备物的健康状态。因此，必须始终检测被成像和评估的血管系统的健康状况。获得健康制备物的关键要点包括：确保制备物在体温条件下持续用平衡的PSS灌注，以及在手术过程中尽量减少对手术区域的接触和机械刺激。

参考文献部分已从以下内容更新：

1. Bearden S.E., Payne G.W., Chisty A., Segal S.S. 衰老对小鼠臀大肌微动脉网络结构和血管运动功能的影响。J Physiol. 561(Pt 2):535-45 (2004)。
2. Looft-Wilson R.C., Payne G.W., Segal S.S. 小鼠骨骼肌微动脉内皮细胞中连接蛋白的表达及扩布性血管舒张。J Appl Physiol. 97(3):1152-8 (2004)。
3. Payne G.W., Madri J.A., Sessa W.C., Segal S.S. 组胺通过内皮源性一氧化氮生成抑制小鼠骨骼肌微动脉中的扩布性血管舒张。Faseb J. (18): 280-286 (2004)。
4. Smeda J.S., Payne G.W. 盐敏感性Dahl大鼠脑血管的自身调节和肌源性功能改变。Stroke. 34(6):1484-90 (2003)。
5. de With M.C., de Vries A.M., Kroese A.B., van der Heijden E.P., Bleys R.L., Segal S.S., Kon M. 仓鼠提睾肌血管解剖及其在微血管移植中的意义。Eur Surg Res. 42(2):97-105 (2009)。
6. Domeier T.L., Segal S.S. 仓鼠供血动脉内皮细胞中扩布性血管舒张的电机械和药理机械信号通路。J Physiol. 579(Pt 1):175-86 (2007)。

至：

1. Soderberg, K.A., Payne, G.W., Sato, A., Medzhitov, R., Segal, S.S., Iwasaki, A. 淋巴结供血动脉的重塑在先天性对适应性免疫的调控中的作用。PNAS. 102(45):16315-16320 (2005)。
2. Bearden S.E., Payne G.W., Chisty A., Segal S.S. 衰老对小鼠臀大肌微动脉网络结构和血管舒缩功能的影响。J Physiol. 561(Pt 2):535-45 (2004)。
3. Looft-Wilson R.C., Payne G.W., Segal S.S. 小鼠骨骼肌微动脉内皮细胞中连接蛋白的表达及血管舒张信号的传导。J Appl Physiol. 97(3):1152-8 (2004)。
4. Payne G.W., Madri J.A., Sessa W.C., Segal S.S. 组胺通过内皮源性一氧化氮的产生抑制小鼠骨骼肌微动脉中的传导性血管舒张。Faseb J. (18): 280-286 (2004)。
5. Smeda J.S., Payne G.W. 盐敏感性Dahl大鼠脑血管中自身调节和肌源性功能的改变。Stroke. 34(6):1484-90 (2003)。
6. de With M.C., de Vries A.M., Kroese A.B., van der Heijden E.P., Bleys R.L., Segal S.S., Kon M. 仓鼠提睾肌的血管解剖及其在微血管移植中的意义。Eur Surg Res. 42(2):97-105 (2009)。
7. Domeier T.L., Segal S.S. 仓鼠供血动脉内皮细胞中传导性血管舒张的电机械和药理机械信号通路。J Physiol. 579(Pt 1):175-86 (2007)。