脱细胞脾基质（DSM）在肝组织工程领域具有广阔的应用前景。本方案概述了制备大鼠DSM的操作流程，包括获取大鼠脾脏、通过灌注法进行脱细胞处理，以及对所得DSM进行评估以确认其特性。
本文内容
摘要
摘要
肝移植是终末期肝病的主要治疗方法。然而，供体器官的短缺及其质量不足促使人们需要开发替代疗法。利用脱细胞肝脏基质（DLM）构建的生物人工肝（BAL）已成为一种有前景的解决方案。但获取合适的DLM仍面临挑战。已有研究探索将脱细胞脾脏基质（DSM）作为BAL的构建基础，提供了一种易于获得的替代方案。在本研究中，通过冻融循环结合灌注脱细胞试剂的方法对大鼠脾脏进行脱细胞处理。该方案保留了DSM中细胞外基质（ECM）的微结构和组分。整个脱细胞过程约耗时11小时，最终获得结构完整的ECM。组织学分析证实，细胞成分被完全清除，同时ECM的结构和组成得以保留。本研究提供的方案为获取DSM提供了一种系统的方法，在肝组织工程和细胞治疗中具有潜在应用价值。这些发现有助于推动终末期肝病替代治疗策略的发展。
引言
肝移植仍是治疗终末期肝病的唯一确定性手段1,2,3。然而，供体器官的严重短缺及其质量的持续下降，使得对替代疗法的需求日益迫切4。在再生医学领域，利用脱细胞肝脏基质（DLM）构建的生物人工肝（BAL）已成为一种颇具前景的解决方案5,6,7。DLM 能够保留肝脏原有的结构，包括其复杂的微血管网络以及细胞外基质（ECM）的多种组分，为构建可移植的生物人工肝提供了理想的支架，有望用于缓解肝脏疾病。
尽管前景广阔，该技术的应用仍面临挑战，尤其是在获取合适的去细胞化肝脏基质（DLM）方面。人源DLM供应短缺，而动物来源的DLM则存在疾病传播和免疫排斥的风险。在一项创新性研究中，我们探索了使用去细胞化脾脏基质（DSM）作为生物人工肝（BAL）的基础8,9,10,11。脾脏在多种临床情况下更易获得，例如门静脉高压、外伤性破裂、特发性血小板减少性紫癜以及心脏死亡后捐献。因此，相较于肝脏，脾脏在科研用途上具有更广泛的可获取性。接受脾切除术的患者通常不会出现严重健康问题，进一步证实了脾脏的非必需性。脾脏的微环境，特别是其细胞外基质和血窦结构，与肝脏相似，这使得脾脏成为肝细胞移植研究中细胞黏附与增殖的适宜器官。基于这些发现，我们先前的研究已证实，DSM在微观结构和成分上与DLM具有可比性，能够支持肝细胞的存活及其功能，包括白蛋白和尿素的生成。此外，DSM还被证明可促进骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化，从而实现更优且稳定的肝功能表现。
通过使用经肝素处理的脱细胞脾基质（DSM），我们构建了具有有效短期抗凝作用和部分肝脏功能代偿能力的功能性生物人工肝（BAL）11。因此，这种三维DSM在肝脏组织工程和细胞治疗的发展中具有重要意义。在本研究中，我们详细介绍了获取大鼠脾脏并制备保留细胞外基质（ECM）微结构和成分的DSM的方法。
方案
本研究经西安交通大学实验动物伦理委员会批准，并依照《实验动物护理与使用指南》的规定进行。
1. 脾脏采集
- 使用体重为250–280 g的雄性Sprague Dawley大鼠。将大鼠饲养于温度和湿度受控的环境中，并提供食物和水 随意，但手术前需禁食除外。
- 术前1小时皮下注射布托啡诺（0.05 mL/kg）作为镇痛剂。通过吸入异氟烷对大鼠进行麻醉。使用5%异氟烷以1.5 L/min的流速在有机玻璃箱中诱导麻醉，并通过面罩以2%异氟烷、流速0.6–0.8 L/min维持麻醉。通过夹捏足趾确认麻醉深度。
- 使用电动剃须刀剃除整个腹部的毛发。将大鼠仰卧位固定于手术台上。通过阴茎背静脉注射2 mL肝素化生理盐水（含1,000 U肝素），以实现全身抗凝。用聚维酮碘溶液对剃毛后的皮肤进行消毒，并覆盖无菌手术巾。
- 使用手术剪在腹部做十字形切口，用止血钳撑开以暴露腹腔，并将肝脏翻向膈肌。将胃肠道外置于腹部右侧，并用湿润纱布覆盖。
- 仔细分离并切断胃脾韧带，以暴露脾门。
注意：脾脏呈红褐色的细长结构，大小约为3.0 cm × 0.6 cm × 0.6 cm，位于左腹部，可被识别。 - 沿脾门处分离，逐步暴露腹腔干、胃十二指肠动脉和脾动脉。在逐步游离周围组织的同时，结扎并切断胃十二指肠动脉和腹腔干。
- 将脾脏翻向右侧以暴露腹主动脉。使用棉签轻轻进行钝性分离，暴露腹主动脉和腹腔干。在腹腔干分支的上方和下方各放置一根长约3 cm的3-0丝线缝合线，并在腹腔干分支处放置一根长约10 cm的6-0丝线缝合线。
- 在腹腔干分支的远端和近端结扎腹主动脉。在动脉分支处做一小切口。轻轻提起6-0丝线，沿腹腔干将24 G静脉导管插入脾动脉，并进行结扎固定。
- 使用注射泵以 4 mL/min 的速度灌注含肝素的生理盐水（25 U/mL），灌注体积为 50 mL。同时切断门静脉作为流出道，使灌注液从脾脏流出。通过放血法处死动物。
- 仔细解剖脾脏周围组织，避免损伤胰腺，同时保留主要的附属血管。
- 检查脾脏周围是否有渗漏，然后取出脾脏和胰腺，并用生理盐水冲洗。
注意：大鼠的脾脏与胰腺紧密相连，胰腺包绕脾动脉走行。若单独切除脾脏，结扎众多细小血管可能较为困难。本方案中，脾脏与胰腺一并切除。经脱细胞处理后，脾脏与胰腺呈透明状，微血管结构清晰可见，有利于保留血管完整的脾脏。 - 将脾脏转移至含有生理盐水的50 mL离心管中，并于-80 °C冰箱中保存。
注意：脾脏及插入脾动脉的静脉导管将一同冷冻保存，以便在灌注实验期间方便连接。
2. 脾脏脱细胞
- 在无菌容器中重复冻融循环3次，以裂解脾细胞。
注意：冻融循环是一种用于支架脱细胞的物理方法。将脾组织置于-80 °C冰箱中过夜冷冻，然后从低温环境中取出，放入室温或37 °C水浴中解冻。此冷冻和解冻过程重复3-6次，可破坏细胞膜，导致细胞裂解。 - 在超净工作台内搭建灌注系统，包括蠕动泵、2 L储液瓶、内径为2.4 mm的硅胶管和气泡捕集器（图1）。
- 用去离子水（ddH2O）充满灌注系统，并持续运行10分钟。
- 小心地将收获的脾脏转移至盛有ddH2O的容器中。
- 将硅胶管连接至已插入脾动脉的静脉导管。
- 以2 mL/min的流速开始用ddH2O灌注30分钟。
- 继续以4 mL/min的流速用ddH2O灌注30分钟。
- 用0.1%（w/v）SDS溶液灌注4小时。
- 用1%（v/v）Triton X-100溶液灌注2小时。
- 以4 mL/min的流速用PBS灌注4小时，以清洗脱细胞脾基质（DSM）。
注意：所有液体均使用蠕动泵进行单向灌注。 - 灌注完成后，结扎并切断胰腺与脾脏之间的血管分支，随后移除胰腺。将脱细胞脾基质（DSM）置于干净且密封的50 mL离心管中，浸泡在含10%青霉素-链霉素的PBS中，并于-20 °C保存，待后续实验使用。
结果
本方案采用反复冻融循环与灌注脱细胞试剂相结合的方法对大鼠脾脏进行脱细胞处理。脾脏的完全脱细胞过程耗时约11小时（图2A）。在脱细胞过程中，脾脏颜色逐渐由深红色转变为斑驳的浅红色，最终呈现白色半透明外观（图2B）。整体形态保持相对完整，可见血管结构（图2B）。
苏木精-伊红染色证实了细胞成分的去除，显示出脱细胞脾基质（DSM）中细胞外基质（ECM）保持完整。这与天然脾脏形成鲜明对比，如图3A所示，天然脾脏中可见细胞核及细胞质成分。细胞的缺失进一步通过4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色及残留DNA含量测定得以确认（DSM：10.1 ± 4 ng/mg干重，天然脾脏：6,200 ± 300 ng/mg干重）。扫描电镜图像揭示了DSM的超微结构特征，显示脾脏淋巴细胞完全去除后呈现出蜂窝状结构（图3C）。这表明脾脏脱细胞过程保留了正常脾脏的超微结构与架构。为更全面地评估DSM中关键细胞外基质蛋白的存在情况，采用了马松三色染色（图3B）和免疫荧光染色。具体分析靶向了I型胶原蛋白（图3D）和纤连蛋白（图3E）。结果表明，ECM的结构成分和基底膜成分均得以保留，与天然脾脏相似。
图 1：实验装置示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：脱细胞流程及脾脏宏观形态变化。（A）脱细胞脾脏基质（DSM）制备流程。脾脏的完全脱细胞过程约需11小时完成。（B）DSM制备过程中脾脏的宏观形态变化。在此过程中，脾脏颜色逐渐由深红色转变为斑驳的浅红色，最终变为白色半透明状。（B）1. 经多次冻融循环后、脱细胞前；2. 去离子水冲洗1小时后；3. SDS灌注4小时后；4. Triton灌注2小时后。缩写：DSM = 脱细胞脾脏基质；SDS = 十二烷基硫酸钠；PBS = 磷酸盐缓冲液；PS = 青霉素-链霉素。请点击此处查看该图的放大版本。
图3脱细胞脾基质的形态学观察 (A) H&E染色；（BMasson 三色染色；C扫描电子显微镜（SEM）；（D，E) I型胶原和纤连蛋白的免疫荧光染色； (F) DAPI 染色。比例尺 = 50 µm (A、B、D-F), 5 µm (C）。缩写：DSM = 脱细胞脾基质；H&E = 苏木精-伊红；SEM = 扫描电子显微镜；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。 请点击此处查看此图的放大版本。
讨论
生物人工肝（BAL）是治疗终末期肝病的有效方法，尤其适用于因供体器官短缺而无法进行肝移植的病例6。构建BAL的一种有前景的策略是利用脱细胞肝脏基质（DLM），该基质可保留肝脏天然的细胞外基质（ECM）和血管结构。然而，人源DLM的稀缺性以及动物源DLM可能带来的感染和免疫原性风险，构成了显著的限制因素。为应对这一挑战，我们提出一种新策略，即采用脱细胞脾基质（DSM）作为BAL的替代支架8,9,10,11。脾脏在多种临床情况下更易获取，且在结构特性上与肝脏相似。在本研究中，我们详细介绍了获取大鼠脾脏并制备DSM的方法，该方法可有效保留ECM的微结构和组分。
理想的脱细胞方法应在去除细胞成分的同时，保留细胞外基质（ECM）原有的结构、组成和机械性能12,13,14。脱细胞方法包括物理、化学和酶处理，每种方法均有其独特的优势与局限性15。尽管这些方法可部分去除细胞成分，但也可能破坏残留ECM的组成、结构和功能特性。脱细胞效果可能受到不同组织来源之间细胞密度、基质厚度和组织形态差异的影响。
迄今为止，脱细胞化过程尚无公认的金标准。通常，单独使用上述任何一种方法都难以在最大程度去除细胞成分的同时，将对细胞外基质（ECM）的不利影响降至最低。因此，最有效的方法需根据组织特性，联合使用多种技术。在本研究中，我们采用了一种结合物理方法（冻融循环和灌注）与化学方法（SDS 和 Triton X-100）的方案，对大鼠脾脏进行脱细胞化处理。
冻融循环可促进细胞裂解，并使细胞从细胞外基质（ECM）中快速脱离16。同时，通过天然血管系统进行灌注可显著提高脱细胞效率，并保留原有的血管网络结构17。十二烷基硫酸钠（SDS）作为一种离子型去垢剂，能有效溶解细胞膜和核膜，从而更彻底地去除细胞质和细胞核成分。然而，该过程也会因糖胺聚糖（GAGs）和胶原蛋白的流失而对细胞外基质的超微结构造成损伤。
SDS 浓度升高与 ECM 支架中残留 DNA 含量降低以及机械强度下降相关。相反，较低浓度的 SDS 能够保留更多的胶原蛋白，并减少 ECM 蛋白的变性程度。相比之下，作为非离子型去污剂的 Triton X-100 能有效破坏脂质-脂质、脂质-蛋白质及 DNA-蛋白质之间的相互作用，提供了一种更为温和的细胞膜溶解方法。然而，它在完全去除细胞核和 DNA 方面效果不足。因此，需要将其与低浓度 SDS 及物理处理方法联合使用，以确保在保留 ECM 原有结构、成分和性能的前提下彻底清除细胞成分。需要注意的是，残留的去污剂可能具有一定的细胞毒性，因此在储存前必须使用无菌 PBS 或蒸馏水进行充分冲洗处理。
本方案的一个局限性在于未对残留的SDS和Triton X-100进行定量检测。这一决定基于我们团队的经验以及相关文献报道，均表明4小时的PBS洗涤已足以有效去除这些物质。此外，我们此前采用该方案进行的细胞培养实验中，未观察到任何细胞毒性的迹象。为了降低方案的成本，我们有意选择不进行残留去垢剂的定量分析。
综上所述，本方案提供了一种制备脱细胞脾基质（DSMs）的可行方法，具有高效、稳定且微创的特点。采用本方案制备的脱细胞脾基质能够保持脾脏固有的结构、组成以及天然的血管网络。此外，该基质可作为细胞植入和三维动态培养的支架，为组织工程肝脏领域的深入研究奠定了基础。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由国家自然科学基金（82000624）和陕西省自然科学基础研究计划（2022JQ-899）资助 & 2021JM-268)，陕西省创新能力支撑计划（2023KJXX-030），陕西省重点研发计划&D 计划大学联合项目-重点项目 (2021GXLH-Z-047)，西安交通大学第一附属医院院内基金 (2021HL-42) & 2021HL-21)
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 麻醉机 | Harvard Apparatus | 台式 | 动物麻醉 |
| 气泡捕集器 | 山东威高集团医用高分子制品股份有限公司 | 孔径：5 μm | 防止气泡产生 |
| 布托啡诺 | TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd | 一种镇痛药 | |
| 止血钳 | 上海医疗器械 有限公司 | J31020 | 手术器械 |
| 肝素化生理盐水 | SPH No.1 生化培养基 & 制药有限公司 | 预防血栓形成 | |
| 异氟烷 | RWD life Science Co. | 麻醉剂：用于麻醉的诱导和维持 | |
| 青霉素-链霉素 | 碧云天生物技术有限公司 | C0222 | 体外使用抗生素以防止微生物污染 |
| 蠕动泵 | 保定雷弗精密泵业有限公司 | BT100-1L | |
| 磷酸盐缓冲液 | 上海 titan 科学有限公司 | 4481228 | 磷酸盐缓冲液 |
| 硅胶管 | 保定雷弗精密泵业有限公司 | 2.4×0.8 mm | |
| 丝线缝合线 | 扬州金环医疗器械厂 | 6-0 和 3-0 | 结扎血管 |
| 十二烷基硫酸钠 | 上海 titan 科学有限公司 | 151-21-3 | 离子型去污剂，可溶解细胞膜和核膜 |
| 注射泵 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | BeneFusion SP5 | 静脉输注 |
| Triton X-100 | 上海 titan 科学有限公司 | 9002-93-1 | 非离子型去污剂，可破坏脂质-脂质、脂质-蛋白质及DNA-蛋白质相互作用 |
| 静脉导管 | B. Braun 公司 | 24G | 插入脾动脉 |
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