本文介绍了一些用于检测内质网（ER）应激及未折叠蛋白反应（UPR）激活的成熟方法，特别侧重于在HIV-1感染中的应用。此外，本文还描述了一系列用于研究内质网应激/UPR对HIV-1复制及病毒颗粒感染性影响的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
病毒感染可因异常蛋白质积聚而引发内质网（ER）应激，进而导致未折叠蛋白反应（UPR）。病毒已进化出多种策略来操控宿主的UPR，但目前文献中对HIV-1感染过程中UPR的调控机制及其功能意义仍缺乏深入理解。在此背景下，本文介绍了我们实验室用于检测T细胞中HIV-1感染期间内质网应激水平和UPR状态的实验方案，以及UPR对病毒复制和感染能力的影响。
硫黄素T（ThT）染色是一种相对较新的方法，通过检测蛋白质聚集体来识别细胞中的内质网应激。本文阐述了在HIV-1感染细胞中进行ThT染色以检测和定量内质网应激的实验方案。此外，还通过常规蛋白质印迹和定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测HIV-1感染细胞中未折叠蛋白反应（UPR）标志物的水平，间接评估内质网应激，这些标志物包括BiP、磷酸化的IRE1、PERK和eIF2α、XBP1的剪接、ATF6的切割以及ATF4、CHOP和GADD34的表达。我们发现ThT荧光信号与UPR激活的指标呈正相关。本文还展示了通过基因敲低实验以及药理学分子的应用，分析内质网应激和UPR调控对HIV-1复制影响的实验方案。UPR对HIV-1基因表达/复制和病毒产生的影响分别通过荧光素酶报告基因检测和p24抗原捕获ELISA进行分析，而对病毒颗粒感染性的影响则通过感染报告细胞的染色来评估。总体而言，这一系列方法为深入理解HIV-1感染过程中未折叠蛋白反应通路及其复杂动态提供了全面的技术支持。
引言
获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的特征是CD4+ T淋巴细胞数量逐渐减少，导致免疫应答进行性衰竭。人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）是引起AIDS的病原体。它是一种有包膜的、正链单股RNA病毒，每个病毒颗粒含有两份RNA拷贝，属于逆转录病毒科。在宿主细胞内高水平表达病毒蛋白会对细胞的蛋白质折叠系统造成过度负担1。内质网（ER）是真核细胞分泌途径中的第一个区室，负责合成、修饰并将蛋白质运送至分泌途径及细胞外靶位点。蛋白质在内质网中经历多种翻译后修饰并折叠成天然构象，包括天冬酰胺连接的糖基化以及分子内和分子间二硫键的形成2。因此，内质网腔内存在高浓度的蛋白质，这些蛋白质极易发生聚集和错误折叠。多种生理状态，如热休克、微生物或病毒感染，以及需要增强蛋白质合成或发生蛋白质突变的情况，都会因内质网中蛋白质积累增加而导致内质网应激，从而破坏内质网腔内的稳态。内质网应激会激活一组高度保守的适应性信号转导通路，即未折叠蛋白反应（UPR）3。UPR通过协调未折叠蛋白负荷与折叠能力，旨在恢复内质网正常的生理状态。这一过程通过增加内质网体积以及内质网驻留的分子伴侣和折叠酶的表达，从而提升内质网的蛋白质折叠能力。同时，UPR还通过在翻译水平上全局性抑制蛋白质合成来降低内质网的蛋白质负荷，并通过上调内质网相关降解（ERAD）途径促进未折叠蛋白从内质网中的清除....
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方案
注意：本实验所用细胞系为 HEK-293T 和 Jurkat J6（一种 CD4+ T 细胞系），购自印度浦那国家细胞科学中心（NCCS）细胞库；TZM-bl 是一种源自 HeLa 的细胞系，其基因组中整合了在 HIV-1 长末端重复序列（LTR）启动子调控下的 β-半乳糖苷酶和荧光素酶基因24，CEM-GFP（另一种 CD4+ T 报告细胞系）25 则购自美国 NIH 艾滋病试剂库。
1. HIV-1 病毒储备液的制备与保存
- HIV-1 病毒储备液的制备
注意：所有涉及 HIV-1 的实验均建议遵循世界卫生组织（WHO）或美国疾病控制与预防中心（CDC）手册中提供的生物安全相关国际指南。病毒的操作及任何涉及活病毒的实验必须在至少 BSL2 级别的防护实验室内的 II 类 A2 型生物安全柜中进行。本实验方案部分描述了使用磷酸钙哺乳动物转染试剂盒生产具有感染性的 HIV-1 病毒颗粒的方法。- 在 II 级 A2 型生物安全柜中，将 HEK-293T 细胞以每 90 mm 培养皿 10 mL 完全培养基（含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素）的 DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）接种，并在 37 °C 组织培养孵箱中培养约 12 小时，使细胞融合度达到 50%–....
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结果
在本研究中，我们描述了一种详细的实验方案，用于研究 体外 T细胞中HIV-1感染引起的内质网应激与未折叠蛋白反应激活图2）。本研究还描述了分析未折叠蛋白反应（UPR）在HIV-1复制及病毒颗粒感染性中功能相关性的方法（图3).
为此，我们通过硫黄素T染色观察细胞内蛋白质聚集体，分析了HIV-1感染所引起的内质网应激。如图4A所示，ThT荧光强度反映了未感染和感染细胞中的蛋白质聚集体情况。同样，作为阳性对照，图4B显示了毒胡萝卜素处理细胞中的ThT染色结果。ThT荧光强度增强表明存在更多的蛋白质聚集体，这与内质网应激增强相关。
此外，为了验证这一观察结果，采用了更为传统的方法，即通过分析未折叠蛋白反应（UPR）标志物来进行验证。首先通过分析UPR主要效应分子IRE1、ATF6.......
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讨论
本实验方案的范围包括：（i）HIV-1 病毒储备液的处理，以及病毒浓度和病毒颗粒感染性的测定；（ii）利用 HIV-1 感染 T 细胞，并评估其对内质网应激及未折叠蛋白反应（UPR）不同标志物的影响；（iii）敲低 UPR 标志物后，分析其对 HIV-1 LTR 驱动的基因活性、病毒产生及病毒颗粒感染性的影响；（iv）使用药理学分子过度激活 UPR，并分析其对 HIV-1 复制的影响。通过本套实验方案，可获得关于 HIV-1 与 UPR 相互作用的全面信息。本研究中列出的实验方案操作简便、成本低廉且高度可靠。
由于未折叠蛋白反应（UPR）是一种对压力敏感的信号通路，相关实验操作较为精细。所有实验均建议避免使用长期传代的细胞，以确保结果的一致性。在所有细胞培养操作中，维持无菌条件至关重要，以防止细菌和酵母污染，因为这些污染可能干扰实验及其结果。此外，在实验过程中处理细胞及其后续培养时，应避免剧烈或长时间的温度变化，并确保起始细胞状态健康且未受应激。否则，这些变化可能给细胞带来额外压力，从而影响实验结果。由于UPR是一种敏感的信号通路，应尽可能固定实验时间点，因为时间点的微小差异也可能.......
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
感谢印度政府生物技术部国家细胞科学中心提供的机构内支持。AT 和 AD 感谢印度政府生物技术部国家细胞科学中心提供的博士研究生研究支持。DM 感谢印度政府科学与工程研究委员会（SERB）授予的 JC Bose 国家奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 丙烯酰胺 | Biorad, USA | 1610107 | |
| 琼脂糖 | G-Biosciences, USA | RC1013 | |
| 过硫酸铵 | Sigma-Aldrich, USA | A3678 | |
| ATF4 抗体 | Cell Signaling Technology, USA | 11815 | Western blot 检测 稀释比例-1:1000 |
| ATF6 抗体 | Abcam, UK | ab122897 | Western blot 检测 稀释比例-1:1000 |
| CHOP 抗体 | Cell Signaling Technology, USA | 2897 | Western blot 检测 稀释比例-1:1000 |
| eIF2α 抗体 | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-11386 | Western blot 检测 稀释比例-1:2000 |
| GADD34 抗体 | Abcam, UK | ab236516 | Western blot 检测 稀释比例-1:1000 |
| GAPDH 抗体 | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-32233 | Western blot 检测 稀释比例-1:3000 |
| HSPA5 抗体 | Cell Signaling Technology, USA | 3177 | Western blot 检测 稀释比例-1:1000 |
| IRE1 抗体 | Cell Signaling Technology, USA | 3294 | Western blot 检测 稀释比例-1:2000 |
| 抗小鼠 HRP 偶联抗体 | Biorad, USA | 1706516 | Western blot 检测 稀释比例-1:4000 |
| 磷酸化 eIF2α 抗体 | Invitrogen, USA | 44-728G | Western blot 检测 稀释比例-1:1000 |
| PERK 抗体 | Cell Signaling Technology, USA | 5683 | Western blot 检测 稀释比例-1:2000 |
| 磷酸化 IRE1 抗体 | Abcam, UK | ab243665 | Western blot 检测 稀释比例-1:1000 |
| 磷酸化 PERK 抗体 | Invitrogen, USA | PA5-40294 | Western blot 检测 稀释比例-1:2000 |
| 抗兔 HRP 偶联抗体 | Biorad, USA | 1706515 | Western blot 检测 稀释比例-1:4000 |
| XBP1 抗体 | Abcam, UK | ab37152 | Western blot 检测 稀释比例-1:1000 |
| 台式高速离心机 | Eppendorf, USA | 5804R | 转子- F-45-30-11 |
| 台式低速离心机 | Eppendorf, USA | 5702R | 转子- A-4-38 |
| 双丙烯酰胺 | Biorad, USA | 1610201 | |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | MP biomedicals, USA | 160069 | |
| Bradford 试剂 | Biorad, USA | 5000006 | |
| CalPhos 哺乳动物转染试剂盒 | Clontech, Takara Bio, USA | 631312 | 病毒储备液制备 |
| CEM-GFP | NIH, AIDS Repository, USA | 3655 | |
| Clarity ECL 底物 | Biorad, USA | 1705061 | 化学发光检测底物 |
| Clarity max ECL 底物 | Biorad, USA | 1705062 | 化学发光检测底物 |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Olympus, Japan | 型号：FV3000 | |
| 细胞离心涂片机 | Thermo Fisher Scientific, USA | ASHA78300003 | |
| DMEM | Invitrogen, USA | 11995073 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich, USA | D2650 | |
| dNTPs | Promega, USA | U1515 | |
| DTT | Invitrogen, USA | R0861 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | 12635 | |
| 溴化乙锭 (EtBr) | Invitrogen, USA | `15585011 | |
| 胎牛血清 | Invitrogen, USA | 16000044 | |
| G418 | Invitrogen, USA | 11811023 | |
| 25% 戊二醛 | Sigma-Aldrich, USA | G6257 | 感染性检测 |
| 甘氨酸 | Thermo Fisher Scientific, USA | Q24755 | |
| HEK-293T | NCCS, India | ||
| HIV-1 感染性分子克隆 pNL4-3 | NIH, AIDS Repository, USA | 114 | |
| 倒置显微镜 | Nikon, Japan | 型号：Eclipse Ti2 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad, USA | 1715124 | |
| Jurkat J6 | NCCS, India | ||
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich, USA | M8266 | 感染性检测 |
| MMLV-RT | Invitrogen, USA | 28025013 | |
| MTT 试剂 | Sigma-Aldrich, USA | M5655 | 细胞活力检测 |
| N,N-二甲基甲酰胺 | Fluka Chemika | 40255 | 感染性检测 |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific, USA | Q27605 | |
| NaF | Sigma-Aldrich, USA | 201154 | |
| NP40 | Invitrogen, USA | 85124 | |
| P24 抗原捕获 ELISA 试剂盒 | ABL, USA | 5421 | |
| PageRuler 预染蛋白 Marker | Sci-fi Biologicals, India | PGPMT078 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich, USA | P6148 | |
| pEGFP-N1 | Clontech, USA | 632515 | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen, USA | 151140122 | |
| 磷酸酶抑制剂 | Sigma-Aldrich, USA | 4906837001 | |
| Phusion 高保真 PCR 预混液（含 GC 缓冲液） | NEB,USA | M05532 | |
| pLKO.1-TRC | Addgene, USA | 10878 | 慢病毒克隆载体 |
| pMD2.G | Addgene, USA | 12259 | VSV-G 包膜载体 |
| PMSF | Sigma-Aldrich, USA | P7626 | |
| 聚乙烯亚胺 (PEI) | Polysciences, Inc., USA | 23966 | |
| 铁氰化钾 | Sigma-Aldrich, USA | 244023 | 感染性检测 |
| 亚铁氰化钾 | Sigma-Aldrich, USA | P3289 | 感染性检测 |
| 蛋白酶抑制剂 | Sigma-Aldrich, USA | 5056489001 | |
| psPAX2 | Addgene, USA | 12260 | 慢病毒包装质粒 |
| 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich, USA | P8833 | 稳定细胞筛选 |
| PVDF 膜 | Biorad, USA | 1620177 | |
| 随机引物 | Invitrogen, USA | 48190011 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen, USA | 22400105 | |
| SDS | Sigma-Aldrich, USA | L3771 | |
| Steady-Glo 底物 | Promega, USA | E2510 | 荧光素酶检测 |
| T4 DNA 连接酶 | Invitrogen, USA | 15224017 | |
| TEMED | Invitrogen, USA | 17919 | |
| 毒胡萝卜素 | Sigma-Aldrich, USA | T9033 | |
| 硫黄素 T | Sigma-Aldrich, USA | 596200 | |
| Tris | Thermo Fisher Scientific, USA | Q15965 | |
| 吐温-100 (Triton-X-100) | Sigma-Aldrich, USA | T8787 | |
| Trizol | Invitrogen, USA | 15596018 | |
| 吐温 20 | Sigma-Aldrich, USA | P1379 | |
| TZM-bl | NIH, AIDS Repository, USA | 8129 | |
| 超速离心机 | Beckman Optima L90K, USA | 330049 | 转子-SW28Ti |
| UltraPure X-gal | Invitrogen, USA | 15520-018 | 感染性检测 |
参考文献
- Levy, J. A. HIV and the Pathogenesis of AIDS. 3rd. , ASM Press. (2007).
- Hebert, D. N., Molinari, M. In and out of the ER: Protein folding, quality control, degradation, and related human diseases. Physiol Rev. 87 (4), 1377-1408 (2007).
- Mori, K.
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