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方法文章

测量HIV-1感染T细胞中的内质网应激与未折叠蛋白反应及其在HIV-1复制中的作用分析

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DOI：

10.3791/66522

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2024年6月14日

 ,  , 
1National Centre for Cell Science, SP Pune University Campus

本文内容

摘要

本文介绍了一些用于检测内质网（ER）应激及未折叠蛋白反应（UPR）激活的成熟方法，特别侧重于在HIV-1感染中的应用。此外，本文还描述了一系列用于研究内质网应激/UPR对HIV-1复制及病毒颗粒感染性影响的实验方案。

摘要

病毒感染可因异常蛋白质积聚而引发内质网（ER）应激，进而导致未折叠蛋白反应（UPR）。病毒已进化出多种策略来操控宿主的UPR，但目前文献中对HIV-1感染过程中UPR的调控机制及其功能意义仍缺乏深入理解。在此背景下，本文介绍了我们实验室用于检测T细胞中HIV-1感染期间内质网应激水平和UPR状态的实验方案，以及UPR对病毒复制和感染能力的影响。

硫黄素T（ThT）染色是一种相对较新的方法，通过检测蛋白质聚集体来识别细胞中的内质网应激。本文阐述了在HIV-1感染细胞中进行ThT染色以检测和定量内质网应激的实验方案。此外，还通过常规蛋白质印迹和定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测HIV-1感染细胞中未折叠蛋白反应（UPR）标志物的水平，间接评估内质网应激，这些标志物包括BiP、磷酸化的IRE1、PERK和eIF2α、XBP1的剪接、ATF6的切割以及ATF4、CHOP和GADD34的表达。我们发现ThT荧光信号与UPR激活的指标呈正相关。本文还展示了通过基因敲低实验以及药理学分子的应用，分析内质网应激和UPR调控对HIV-1复制影响的实验方案。UPR对HIV-1基因表达/复制和病毒产生的影响分别通过荧光素酶报告基因检测和p24抗原捕获ELISA进行分析，而对病毒颗粒感染性的影响则通过感染报告细胞的染色来评估。总体而言，这一系列方法为深入理解HIV-1感染过程中未折叠蛋白反应通路及其复杂动态提供了全面的技术支持。

引言

获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的特征是CD4+ T淋巴细胞数量逐渐减少，导致免疫应答进行性衰竭。人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）是引起AIDS的病原体。它是一种有包膜的、正链单股RNA病毒，每个病毒颗粒含有两份RNA拷贝，属于逆转录病毒科。在宿主细胞内高水平表达病毒蛋白会对细胞的蛋白质折叠系统造成过度负担1。内质网（ER）是真核细胞分泌途径中的第一个区室，负责合成、修饰并将蛋白质运送至分泌途径及细胞外靶位点。蛋白质在内质网中经历多种翻译后修饰并折叠成天然构象，包括天冬酰胺连接的糖基化以及分子内和分子间二硫键的形成2。因此，内质网腔内存在高浓度的蛋白质，这些蛋白质极易发生聚集和错误折叠。多种生理状态，如热休克、微生物或病毒感染，以及需要增强蛋白质合成或发生蛋白质突变的情况，都会因内质网中蛋白质积累增加而导致内质网应激，从而破坏内质网腔内的稳态。内质网应激会激活一组高度保守的适应性信号转导通路，即未折叠蛋白反应（UPR）3。UPR通过协调未折叠蛋白负荷与折叠能力，旨在恢复内质网正常的生理状态。这一过程通过增加内质网体积以及内质网驻留的分子伴侣和折叠酶的表达，从而提升内质网的蛋白质折叠能力。同时，UPR还通过在翻译水平上全局性抑制蛋白质合成来降低内质网的蛋白质负荷，并通过上调内质网相关降解（ERAD）途径促进未折叠蛋白从内质网中的清除4,5。

内质网应激由三种定位于内质网的跨膜蛋白感知：蛋白激酶R（PKR）样内质网激酶（PERK）、激活转录因子6（ATF6）以及肌醇需求酶1型（IRE1）。这些效应分子在正常情况下通过与分子伴侣热休克蛋白家族A（Hsp70）成员5（HSPA5）结合而保持非活性状态，HSPA5也被称为结合蛋白（BiP）或78-kDa葡萄糖调节蛋白（GRP78）。当发生内质网应激并导致未折叠或错误折叠蛋白积累时，HSPA5发生解离，从而激活上述效应分子，进而启动一系列下游靶点的表达，以帮助缓解内质网应激；在极端情况下，则促进细胞死亡6。PERK在与HSPA5解离后发生自磷酸化，其激酶活性被激活7。活化的PERK激酶可磷酸化eIF2α，导致翻译过程受到抑制，从而降低内质网的蛋白质负荷8。然而，在磷酸化真核起始因子2α（eIF2α）存在的情况下，某些特定mRNA上的非翻译开放阅读框会被优先翻译，例如ATF4，进而调控应激诱导基因的表达。ATF4和C/EBP同源蛋白（CHOP）是转录因子，可调控应激诱导基因，并参与调控凋亡及细胞死亡通路9，10。ATF4和CHOP的靶基因之一是生长停滞和DNA损伤诱导蛋白（GADD34），该蛋白与蛋白磷酸酶1共同作用，使磷酸化的eIF2α去磷酸化，从而作为翻译抑制的负反馈调节因子11。在内质网应激条件下，ATF6从HSPA5上解离，暴露出其高尔基体定位信号，促使其转运至高尔基体。在高尔基体中，ATF6被位点1蛋白酶（S1P）和位点2蛋白酶（S2P）切割，释放出剪切形式的ATF6（ATF6 p50）。ATF6 p50随后转入细胞核，诱导一系列参与蛋白质折叠、成熟与分泌以及蛋白质降解相关基因的表达12，13。在内质网应激期间，IRE1从HSPA5上解离，发生多聚化并自磷酸化14。IRE1的磷酸化激活其RNase结构域，特异性介导X-box结合蛋白1（XBP1）mRNA中央区域26个核苷酸的剪接15，16。这一剪接过程产生新的C末端，赋予其转录激活功能，生成具有活性的XBP1s蛋白，这是一种强效的转录因子，可调控多个内质网应激诱导基因的表达17，18。这些转录因子的协同作用启动了旨在恢复内质网稳态的遗传程序。

检测内质网应激和未折叠蛋白反应（UPR）的方法有多种，包括常规的UPR标志物分析方法19,20。各种非常规方法则包括测定UPR的氧化还原状态、内质网腔内的钙离子分布以及评估内质网结构。可利用电子显微镜观察细胞和组织中内质网腔在内质网应激下的扩张程度。然而，该方法耗时较长，且依赖于电子显微镜设备的可及性，而并非每个研究团队都能获得该设备。此外，由于试剂的可获得性限制，测定内质网的钙离子流和氧化还原状态也具有挑战性。而且，这些实验的检测结果非常敏感，可能受到细胞代谢其他因素的影响。

一种强大且简单的监测未折叠蛋白反应（UPR）输出的方法是检测UPR不同信号通路的激活状态，该方法已在多种应激情境下使用数十年。与其它已知方法相比，这些传统的UPR激活检测方法经济、可行，并能更快地提供信息。这些方法包括免疫印迹法，用于在蛋白水平检测UPR标志物的表达，例如IRE1、PERK和eIF2α的磷酸化，以及通过检测ATF6的P50形式来分析ATF6的切割，同时还可检测其他标志物（如HSPA5、剪切型XBP1、ATF4、CHOP和GADD34）的蛋白表达；此外还包括RT-PCR，用于测定mRNA水平以及XBP1 mRNA的剪接情况。

本文介绍了一套经过验证且可靠的实验方案，用于监测 HIV-1 感染细胞中的内质网应激（ER stress）和未折叠蛋白反应（UPR）的激活状态，并确定 UPR 在 HIV-1 复制和感染能力中的功能相关性。这些方案使用易于获取且经济的试剂，可提供关于 UPR 输出结果的有力信息。内质网应激是由于未折叠或错误折叠蛋白的积累所致，这些蛋白易于形成蛋白聚集体21。本文描述了一种在 HIV-1 感染细胞中检测此类蛋白聚集体的方法。硫黄素 T（Thioflavin T）染色是一种相对较新的用于检测和定量蛋白聚集体的方法22。Beriault 和 Werstuck 描述了该技术，用于检测和定量蛋白聚集体，从而评估活细胞中的内质网应激水平。已有研究表明，小分子荧光染料硫黄素 T（ThT）可选择性地结合蛋白聚集体，尤其是淀粉样纤维。

本文描述了使用硫黄素T（ThT）检测和定量HIV-1感染细胞中的内质网应激，并将其与通过测量未折叠蛋白反应（UPR）不同信号通路的活化来监测UPR的传统方法进行关联。

由于目前关于未折叠蛋白反应（UPR）在HIV-1感染过程中作用的综合信息仍然缺乏，本文提供了一套用于研究UPR在HIV-1复制及病毒颗粒感染性中作用的实验方案。这些方案包括利用慢病毒介导的UPR标志物敲低，以及使用药理性内质网应激诱导剂进行处理。本文还展示了可用于检测HIV-1基因表达、病毒产生以及所产生病毒颗粒感染性的多种检测方法，例如基于长末端重复序列（LTR）的荧光素酶检测、p24酶联免疫吸附试验（ELISA）以及β-半乳糖苷酶报告基因染色检测。

利用这些方案中的大部分，我们近期报道了HIV-1感染对T细胞中未折叠蛋白反应（UPR）的功能影响23，该文章的结果表明本文所述方法具有可靠性。因此，本文提供了一套方法，用于全面了解HIV-1与内质网应激及UPR激活之间的相互作用。

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方案

注意：本实验所用细胞系为 HEK-293T 和 Jurkat J6（一种 CD4+ T 细胞系），购自印度浦那国家细胞科学中心（NCCS）细胞库；TZM-bl 是一种源自 HeLa 的细胞系，其基因组中整合了在 HIV-1 长末端重复序列（LTR）启动子调控下的 β-半乳糖苷酶和荧光素酶基因24，CEM-GFP（另一种 CD4+ T 报告细胞系）25 则购自美国 NIH 艾滋病试剂库。

1. HIV-1 病毒储备液的制备与保存

  1. HIV-1 病毒储备液的制备
    注意：所有涉及 HIV-1 的实验均建议遵循世界卫生组织（WHO）或美国疾病控制与预防中心（CDC）手册中提供的生物安全相关国际指南。病毒的操作及任何涉及活病毒的实验必须在至少 BSL2 级别的防护实验室内的 II 类 A2 型生物安全柜中进行。本实验方案部分描述了使用磷酸钙哺乳动物转染试剂盒生产具有感染性的 HIV-1 病毒颗粒的方法。
    1. 在 II 级 A2 型生物安全柜中，将 HEK-293T 细胞以每 90 mm 培养皿 10 mL 完全培养基（含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素）的 DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）接种，并在 37 °C 组织培养孵箱中培养约 12 小时，使细胞融合度达到 50%–60%。
    2. 次日，配制转染混合液：为每块培养板配制溶液 A，其中包含 25 µg pNL4.3（HIV-1 的分子克隆）质粒 DNA、86.8 µL 的 2 M CaCl2，并用无菌水补足至终体积 700 µL；同时为每块培养板配制溶液 B，包含 700 µL 的 2× HEPES 缓冲盐水（HBS）。然后根据所需培养板总数调整计算量。
    3. 在持续涡旋溶液 A 的同时，逐滴加入溶液 B。此时每块培养板的转染混合液体积为 1.4 mL。
      注意：在持续涡旋条件下将溶液 B 逐滴加入溶液 A，可形成理想的转染复合物。
    4. 将该混合物在室温（RT）下孵育约 20 分钟。随后，缓慢逐滴将混合物加入含 9 mL 新鲜完全 DMEM 的各培养板中，并将培养板转移至 CO2 孵箱。8–10 小时后，更换为 10 mL 新鲜完全 DMEM。
    5. 换液后 24 小时，从所有培养板中收集上清液（含病毒颗粒）至锥形管中。使用低速台式离心机（材料表）在 600 ×g 条件下离心 5 分钟，以去除细胞碎片。
    6. 将上清液转移至聚烯烃超速离心管中，并将其放入超速离心机（材料表）的摆动转子中。检查管架重量是否平衡，必要时用无菌培养基调整。
    7. 在 4 °C 条件下，以 1,41,000 × g 离心 2.5 小时。之后，在生物安全柜内小心取出离心管，缓慢倾去上清液。
    8. 向每根离心管中的沉淀（即浓缩后的病毒）加入 1 mL 不完全 RPMI（Roswell Park Memorial Institute）1640 培养基，并剧烈吹打以充分悬浮沉淀。
      注意：超速离心后的沉淀肉眼几乎不可见，因此必须确保将 RPMI 1640 加入管底中央，以便充分悬浮沉淀。
    9. 向 1 mL 病毒悬液中加入 25 µL 的 1 M HEPES（pH 7.4）。将 50 µL 悬液分装至 1.5 mL 离心管中，立即置于 -80 °C 冰箱中长期保存。
  2. 病毒浓度与病毒颗粒感染性的定量
    注意：为计算病毒的感染性，首先需测定其浓度，该步骤通过 p24 抗原捕获 ELISA 完成（按试剂盒说明书操作，此处不详述；参见 材料表）。该过程可获得病毒储备液的浓度（单位为纳克每微升，ng/µL），随后通过 TZM-bl 报告细胞实验进一步确定病毒储备液中具有感染性的病毒颗粒数量26。
    1. 用 500 µL 完全 DMEM 将 0.1 × 106 个 TZM-bl 细胞接种至 24 孔板的每个孔中，置于细胞培养孵箱中培养 10–12 小时。
    2. 确保细胞在开始感染前融合度达到 50%–60%。将原有培养基更换为每孔 250 µL 新鲜完全 DMEM。
      注意：设置一个阳性对照孔，以排除实验操作误差。
    3. 计算用于感染的病毒储备液用量，使每孔分别含有 1 ng、0.1 ng 和 0.01 ng 病毒（每个浓度设复孔）。将相应量的病毒加入各孔，并将培养板置于 37 °C 孵箱中孵育 4 小时。
    4. 用 500 µL 不完全 DMEM 洗涤细胞两次，然后每孔加入 500 µL 完全 DMEM。
    5. 换液后 36 小时，进行 β-半乳糖苷酶（β-gal）染色操作。
      1. 弃去原有培养基，用 1 mL PBS 洗涤细胞两次。每孔加入 500 µL 固定液（含 0.25% 戊二醛的 PBS），在生物安全柜内室温孵育 5–7 分钟以固定细胞。
      2. 按 表 1 所示配制染色液。由于 X-gal 对光敏感，需避光保存。
      3. 用 1 mL PBS 洗涤细胞一次。每孔加入 500 µL 新鲜配制的染色液，避光于 37 °C 孵育 2–18 小时。
      4. 反应结束后，用含 3% 二甲基亚砜（DMSO）的 PBS 洗涤细胞两次，每次 500 µL，然后将细胞置于 500 µL 新鲜 PBS 中保存。
      5. 在显微镜下以 10× 物镜观察并计数 5 个随机视野中的蓝色感染细胞（如 图 1A 所示）。取 5 个视野的平均细胞数，乘以视野系数和稀释倍数，即可定量病毒储备液中具有感染性的病毒颗粒数量。
        注意：对于 24 孔板，视野系数为 75。
组分配制方法所需体积
PBS用10x PBS母液配制1x PBS14 mL
铁氰化钾将0.82 g铁氰化钾和1.06 g亚铁氰化钾溶解于25 mL 1x PBS中0.75 mL
氯化镁在1 mL 1x PBS中配制成1 M溶液15 µL
X-gal将30 mg X-gal溶解于0.6 mL N,N-二甲基甲酰胺中（避光）0.3 mL
总体积 = 15 mL

表1：TZM-bl细胞中β-半乳糖苷酶染色所需组分列表。

2. T细胞系的HIV-1感染

  1. 解冻并培养一种永生化T细胞系。本研究使用CEM-GFP细胞系，在添加了10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和500 µg/mL G418的完全RPMI 1640培养基中进行培养。
  2. 对每个时间点（未感染、24小时、48小时、72小时和96小时）计数并取200万个细胞。立即以100 × g 离心5分钟收集未感染细胞，并加入细胞裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4、0.12 M NaCl、5 mM EDTA、0.5% NP40、0.5 mM NaF、1 mM DTT），同时补充蛋白酶抑制剂混合物、0.5 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）和1×磷酸酶抑制剂（每100万至300万个细胞加入50 µL），或使用Trizol试剂（每100万至300万个细胞使用1 mL）裂解细胞以提取RNA（参见材料表）。
  3. 在室温下，用含聚凝胺（5 µg/mL）的1 mL完全RPMI 1640培养基以100 × g 离心5分钟洗涤细胞一次，然后将细胞重悬于1 mL完全培养基中。
    注：聚凝胺是一种阳离子聚合物，用于增强逆转录病毒在哺乳动物细胞中的感染效率。
  4. 将800万个细胞重悬于1 mL含聚凝胺的完全培养基中。计算感染400万个病毒颗粒所需的病毒储存液体积，加入病毒原液，并用完全培养基补足至总体积2 mL，使感染复数（MOI）为0.5。
  5. 将细胞置于37 °C的CO2培养箱中孵育4小时，期间每隔30–45分钟轻轻敲击培养容器。
  6. 4小时后，在生物安全柜内离心收集细胞，并小心弃去上清液，按照规范方法妥善处理。
    注：从本步骤开始，所有细胞离心条件均为室温下100 × g 离心5分钟。
  7. 用1 mL不完全培养基洗涤细胞两次，然后将细胞重悬于8 mL完全培养基中，调整细胞密度为100万个细胞/mL。
  8. 在6孔组织培养板中，按所需孔数接种等量细胞，并将培养板置于维持在37 °C的CO2培养箱中培养。
  9. 在接下来的4天内，每隔24小时加入细胞裂解缓冲液收集细胞样本，同时收集上清液并立即转移至-80 °C冰箱冷冻保存。
  10. 为检测是否发生感染，对所有时间点进行p24抗原捕获ELISA检测。根据不同时间点合理稀释样本，即早期时间点稀释倍数较低，后期逐渐提高，稀释范围为1:50至1:500。将检测结果绘制成图表，以显示感染进程（图1B）。

3. 使用硫黄素T染色法检测内质网应激

  1. 取100万个未感染的细胞和0.5 MOI感染的CEM-GFP细胞（感染72小时后收集），分别加入200 µL含4%多聚甲醛的PBS溶液，室温固定20分钟。
  2. 在100 ×g条件下离心5分钟收集细胞，加入500 µL 0.1 M甘氨酸处理5分钟，随后用500 µL PBS洗涤两次，最后将细胞重悬于100 µL PBS中。
  3. 组装玻璃载片、滤纸卡和样品室，将100 µL重悬细胞加入样品室中，在细胞离心机（材料表）中以1000 × g离心4分钟，使细胞贴附于载片上。
    注意：若细胞悬液过稀，经细胞离心后载片上的细胞固定量将不足；若细胞悬液浓度过高，则细胞易发生聚集，导致分布不均。
  4. 用滴加的含0.1% Triton-X-100的PBS溶液对细胞进行通透处理10分钟（用量以覆盖细胞贴附区域为宜），随后以滴加PBS的方式洗涤两次，并倾斜载片用纸巾吸去PBS。
  5. 加入10 µL 5 µM刚果红T（Thioflavin T），孵育30分钟。
    注意：ThT孵育后无需洗涤。
  6. 使用5 µL封片剂（80%甘油v/v，20% PBS v/v，含8 mg/mL 1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷[DABCO]）封片，加盖盖玻片，并用指甲油密封边缘，静置使载片干燥。
    注意：所有步骤中均需确保细胞不干燥。
  7. 使用共聚焦显微镜（见材料表）配备63倍甘油浸没物镜采集固定细胞的共聚焦图像。调整以下激发和发射波长参数：GFP（激发494 nm，发射519 nm）和ThT（激发458 nm，发射480–520 nm）。
    注意：为避免通道串色，各荧光通道应依次成像，而非同时采集。由于CEM-GFP细胞中的GFP受HIV-1 LTR启动子调控，HIV-1感染后启动表达，因此GFP信号作为HIV-1感染的指示标志25。
  8. 在进行阈值分析定量前，将荧光图像转换为8位图像。使用Image J等软件手动定量每个细胞的荧光强度（约50个细胞）27。以每个细胞的荧光强度为Y轴，分别对应未感染与感染组别绘制散点图。
  9. 为验证本方案的有效性，可设置阳性对照，例如本实验中采用已知内质网应激诱导剂毒胡萝卜素（Thapsigargin）处理28。取100万个CEM-GFP细胞，分别加入1 µL DMSO（溶剂对照）和100 nM Thapsigargin，处理12小时。
  10. 收集细胞后，按照感染样本的相同步骤（步骤3.1–3.8）进行ThT染色。
    注意：对于这些样本，无需检测GFP荧光，因此共聚焦显微镜仅采集ThT荧光信号。

4. 确定多种未折叠蛋白反应标志物的活化与表达

注意：为检测未折叠蛋白反应（UPR）标志物的表达水平，采用两种方法：免疫印迹法和逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）。进行免疫印迹时，于感染后不同时间点（感染后24小时、48小时、72小时和96小时）收集0.5 MOI HIV-1感染的CEM-GFP细胞，并将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液中（如步骤2.2所述）。 alternatively，进行RT-PCR时，使用Trizol试剂裂解细胞沉淀（每100万至300万细胞使用1 mL）（参见材料表）。重悬于裂解缓冲液或Trizol试剂中的细胞样品可保存于-80 °C，待后续使用。

  1. 利用免疫印迹法分析未折叠蛋白反应（UPR）标志物。
    1. 将重悬的细胞在裂解缓冲液中冰上孵育45分钟，期间使用涡旋振荡器间歇混匀。
    2. 使用台式高速离心机在18000 × g 条件下离心15分钟，沉淀细胞（参见材料表）。收集上清液至新离心管中。
    3. 使用Bradford法或类似试剂测定各样品中的蛋白质浓度。
    4. 取等浓度的蛋白质样品，用Laemmli缓冲液（6×缓冲液：250 mM Tris-Cl pH 6.8，10% SDS，30%甘油，0.02%溴酚蓝；5% β-巯基乙醇）制备蛋白样品。
      注：每种UPR标志物的免疫印迹分析至少使用60–80 µg蛋白质。
    5. 将蛋白样品在96 °C下煮沸5分钟，短暂离心。
    6. 在10%–12% SDS-PAGE凝胶上分离蛋白样品，并将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（参见材料表）。
    7. 用5%脱脂奶粉或牛血清白蛋白（BSA）封闭1–2小时，用TBST（20 mM Tris pH 7.4，0.137 M NaCl，0.1% Tween 20）洗涤两次，然后在摇床上加入针对UPR标志物的特异性一抗（参见材料表），4 °C孵育过夜。次日用TBST洗涤印迹膜两次后，加入相应的二抗孵育1.5小时。
    8. 再次用TBST洗涤印迹膜，并使用化学发光底物（参见材料表）在Western印迹成像仪中显影蛋白条带。
  2. RT-PCR
    1. 使用Trizol试剂从细胞中提取总RNA（参见材料表）。
    2. 使用Moloney鼠白血病病毒逆转录酶（MMLV-RT）以等浓度RNA制备cDNA（参见材料表）。
    3. 使用基因特异性引物（表2）通过qRT-PCR分析HSPA5、剪接型XBP1、ATF4、CHOP和GADD34的mRNA表达水平变化。简要步骤如下：配制10 µL反应体系，包含cDNA模板（100 ng）、5 µL SYBR Green染料（参见材料表）及每对基因特异性寡核苷酸引物各10 pmol，用无菌H2O补足体积。
    4. 在实时PCR仪上运行反应程序：95 °C预变性3分钟，随后进行40个循环（95 °C 30秒，55 °C 30秒，72 °C 30秒），最后进行熔解曲线分析。相对于内参基因（例如β-Actin）计算目标基因表达的倍数变化：
      倍数变化 = 2-Δ(ΔCT)
      其中 ΔCT = CT（目标基因）− CT（内参基因）
      且 Δ(ΔCT) = ΔCT（处理组）− ΔCT（对照组）
    5. 为进一步确认XBP1的剪接情况，对未感染和感染72小时的样品进行半定量RT-PCR。
      ​注：通过跨越剪接位点的RT-PCR检测XBP1 mRNA的剪接。
    6. 使用高保真PCR预混液（参见材料表）及XBP1引物（表2）扩增cDNA，反应条件如下：98 °C 30秒（1个循环），随后进行5个循环（98 °C 15秒，65*Δ-5 °C 30秒，72 °C 30秒），再进行30个循环（98 °C 15秒，55 °C 30秒，72 °C 30秒），最后72 °C延伸10分钟，4 °C保存。
    7. 在含有50 ng/mL溴化乙锭的2.5%琼脂糖凝胶上分离扩增产物，并在凝胶成像系统中观察。剪接型XBP1条带比未剪接型小26个核苷酸。

5. UPR 标志物的敲低及 HIV-1 LTR 驱动的基因表达与病毒产生的分析

  1. 制备用于敲低UPR标志物的shRNA载体
    1. 使用pLKO.1-TRC载体骨架（慢病毒克隆载体）构建shRNA载体29。
    2. 针对每个基因（IRE1、PERK、ATF6和HSPA5）构建两个shRNA载体。靶向相应基因mRNA的正义链和反义链寡核苷酸由RNAi联盟设计（https://www.broadinstitute.org/rnai-consortium/rnai-consortium-shrna-library）（表3）。
      注意：以类似方式，也可为其他UPR标志物构建shRNA载体。
    3. 将引物（正向和反向引物各100 nM）在95 °C下退火，随后逐渐冷却至室温。
    4. 然后使用T4 DNA连接酶（见材料表）将其连接至pLKO.1载体的Age1和EcoRI位点。通过DNA测序确认序列。
      注意：靶向LacZ基因的shRNA载体用作非靶向对照。
  2. 在HEK-293T细胞中敲低PERK、ATF6、IRE1和HSPA5，进行荧光素酶检测及p24 ELISA
    1. 在50 µL无血清培养基中，将shRNA载体（0.9 µg）与转染试剂（如聚乙烯亚胺PEI，每1 µg DNA使用3 µL PEI）（见材料表）混合，涡旋混匀，室温孵育20分钟。
    2. 从融合的HEK-293T细胞培养瓶中消化细胞，并将约0.25 x 106个细胞与转染混合物共同接种至24孔板中，总体积为125 µL，在37 °C、CO2培养箱中孵育6小时。该方法称为反向转染，即细胞与转染混合物同时接种。
    3. 6小时后，向各孔中加入125 µL完全培养基，并重悬细胞以确保均匀分布。
      注意：在基因敲低实验中，反向转染（步骤5.2.1–5.2.3）对shRNA和siRNA均具有更高的转染效率。
    4. 24小时后，进行第二次转染。在50 µL不完全培养基中，将pNL4-3（100 ng）、pLTR-Luc（100 ng）和pEGFP-N1（50 ng）（pNL4-3:pLTR-Luc:pEGFPN1 = 1:1:0.5）与PEI（每1 µg DNA使用3 µL PEI）混合，涡旋混匀，室温孵育20分钟。更换原有培养基为250 µL新鲜不完全培养基，然后将混合物加入细胞中。
      ​注意：实验室先前通过将pU3RIII30,31中的LTR亚克隆至pGL3basic中，构建了HIV-1 LTR的报告载体32。使用pEGFP-N1表达GFP以校正转染效率32。
    5. 转染后6小时，更换为500 µL完全DMEM培养基。36小时后收集细胞，用于免疫印迹和荧光素酶检测。
    6. 进行荧光素酶检测时，离心收集细胞，重悬于市售的荧光素酶底物（50 µL）中（见材料表）。将重悬的细胞裂解液加入不透光的96孔板中，孵育10–15分钟。使用化学发光仪读取荧光素酶信号。同时在相同样品中检测GFP荧光，以微孔板多功能读板仪测定（激发波长：494 nm，发射波长：519 nm），用于校正荧光素酶读数。
    7. 以Y轴表示荧光素酶单位/GFP作图。
      注意：应检测相应UPR标志物的敲低效果，可通过基因特异性抗体或引物分别进行免疫印迹或qRT-PCR分析。
    8. 收集上清液，按前述方法进行p24 ELISA检测。
  3. 构建稳定敲低UPR标志物的细胞系并进行HIV-1感染
    1. 在6孔板中接种HEK-293T细胞，使用PEI（DNA:PEI = 1 µg:3 µL）共转染相应的shRNA载体（1 µg）、pMD2.G（VSV-G包膜载体）（0.75 µg）和psPAX2（慢病毒包装质粒）（0.25 µg）（见材料表），以制备慢病毒颗粒。在100 µL不完全DMEM中配制混合物，室温孵育20分钟，然后加入至已接种的HEK-293T细胞的1.8 mL完全培养基中。
      注意：转染前至少12小时在6孔板中接种HEK-293T细胞，使其形态良好且融合度达约60–70%。
    2. 转染24小时后，向每孔加入1 mL完全DMEM培养基。
    3. 48小时后收集上清液，储存于-80 °C冰箱，并进行p24 ELISA检测以确认上清液中存在病毒。使用该粗提慢病毒上清液转导J6细胞。
    4. 在6孔板中将200万个细胞与等体积的慢病毒上清液（500 µL）共同孵育（分别对应对照组和基因特异性敲低组），并加入含polybrene（5 µg/mL）的新鲜完全RPMI 1640培养基，使总体积达到2 mL。
    5. 24小时后，向每孔加入嘌呤霉素（1 µg/mL）以筛选稳定细胞系。添加嘌呤霉素后，每隔24小时离心收集细胞，并更换为含嘌呤霉素的2 mL新鲜培养基。
    6. 持续操作直至无细胞死亡（约1周）。存活细胞即为具有目标基因稳定敲低的细胞。
      注意：可在不同时间点定期检测相应基因的敲低情况，最终在含嘌呤霉素的培养基中仅见存活细胞时，通过免疫印迹或qRT-PCR确认敲低效果。
    7. 按照第2节所述方法，用0.5 MOI的HIV-1感染LacZ对照组和基因特异性敲低细胞，并在感染后48小时收集细胞。
    8. 收集各样品的上清液，按前述方法进行p24 ELISA检测，并处理细胞样本通过免疫印迹检测敲低水平。

6. 使用内质网应激诱导剂处理并分析其对 HIV-1 复制的影响

注意：为了确定在 HIV-1 复制期间过度激活未折叠蛋白反应（UPR）的影响，可使用药理学诱导分子毒胡萝卜素（Thapsigargin）。

  1. 测定毒胡萝卜素处理后的细胞存活率。
    注意：毒胡萝卜素的细胞毒性通过 MTT 试剂（见材料表）进行测定。
    1. 在含有 100 µL 完全 RPMI 1640 培养基的 96 孔板中，每孔接种 25,000–30,000 个 CEM-GFP 细胞。向培养基中加入 100 nM 毒胡萝卜素，并在 37 °C 培养箱中孵育。
      注意：以 1 µL DMSO 处理的细胞作为溶剂对照。
    2. 48 小时后，每孔加入 10 µL MTT（5 mg/mL），在 37 °C、5% CO2 条件下避光孵育 4 小时，以形成甲臜结晶。
    3. 4 小时后，使用 100 µL 异丙醇溶解结晶，形成紫色溶液，并用分光光度计在 570 nm 处测定吸光度。
    4. 根据以下公式计算细胞存活率
      % 细胞存活率 = (对照组OD570 －处理组OD570) / 对照组OD570 × 100
  2. 毒胡萝卜素预处理及通过 p24 ELISA 分析 HIV-1 感染进程。
    1. 在含有 1 mL 完全 RPMI 1640 培养基的 12 孔板中接种 100 万个 CEM-GFP 细胞，在 37 °C、CO2 培养箱中用 100 nM 毒胡萝卜素或 1 µL DMSO（溶剂对照）处理 12 小时。12 小时后，用完全 RPMI 1640 培养基洗涤细胞，并按先前所述方法以 0.5 MOI 的 HIV-1 进行感染。
    2. 在感染后不同时间点（如 24 小时、48 小时和 72 小时）收集细胞，用于免疫印迹分析。
    3. 收集各样本的上清液，并按先前所述方法进行 p24 ELISA 检测。
    4. 以样本中 p24 浓度为 Y 轴，相应时间点为 X 轴，绘制图表。
    5. 通过免疫印迹检测 UPR 相关标志物水平，分析毒胡萝卜素处理诱导的内质网应激。本研究采用 HSPA5 作为标志物。

7. 采用 TZM-bl β-半乳糖苷酶感染性检测法确定未折叠蛋白反应对病毒颗粒感染性的影响

注意：为了理解未折叠蛋白反应（UPR）在病毒颗粒感染性中的作用，可根据p24 ELISA测定的p24浓度，使用基因敲低以及噻唑烷处理后的上清液，按照第1.2节所述进行TZM-bl β-半乳糖苷酶感染性检测。

  1. 用各样本相同浓度的p24感染TZM-bl细胞，并进行β-半乳糖苷酶染色。在10倍显微镜下随机选取5个视野，计数其中呈蓝色的感染细胞。
  2. 对上述步骤中每个样本的5个视野计数结果取平均值。
  3. 按以下公式计算倍数变化：
    倍数变化 = 检测样本中蓝色细胞的平均数量 / 对照样本中蓝色细胞的平均数量。

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结果

在本研究中，我们描述了一种详细的实验方案，用于研究 体外 T细胞中HIV-1感染引起的内质网应激与未折叠蛋白反应激活图2）。本研究还描述了分析未折叠蛋白反应（UPR）在HIV-1复制及病毒颗粒感染性中功能相关性的方法（图3).

为此，我们通过硫黄素T染色观察细胞内蛋白聚集体，分析了HIV-1感染所引起的内质网应激。如图所示 图4AThT 的强度代表未感染和感染细胞中的蛋白质聚集体。同样，作为阳性对照， 图 4B 显示经毒胡萝卜素（Thapsigargin）处理细胞的硫磺素T（ThT）染色结果。增强的ThT荧光强度提示存在更多的蛋白质聚集体，这与内质网应激的增强相关。

此外，为了验证这一观察结果，采用了更为传统的方法，即分析未折叠蛋白反应（UPR）标志物。首先通过分析UPR主...

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讨论

本实验方案的范围包括：（i）HIV-1 病毒储备液的处理，以及病毒浓度和病毒颗粒感染性的测定；（ii）利用 HIV-1 感染 T 细胞，并评估其对内质网应激及未折叠蛋白反应（UPR）不同标志物的影响；（iii）敲低 UPR 标志物后，分析其对 HIV-1 LTR 驱动的基因活性、病毒产生及病毒颗粒感染性的影响；（iv）使用药理学分子过度激活 UPR，并分析其对 HIV-1 复制的影响。通过本套实验方案，可获得关于 HIV-1 与 UPR 相互作用的全面信息。本研究中列出的实验方案操作简便、成本低廉且高度可靠。

由于未折叠蛋白反应（UPR）是一种对压力敏感的信号通路，相关实验操作较为精细。所有实验均建议避免使用长期传代的细胞，以确保结果的一致性。在所有细胞培养操作中，维持无菌条件至关重要，以防止细菌和酵母污染，因为这些污染可能干扰实验及其结果。此外，在实验过程中处理细胞及其后续培养时，应避免剧烈或长时间的温度变化，并确保起始细胞状态健康且未受应激。否则，这些变化可能给细胞带来额外压力，从而影响实验结果。由于UPR是一种敏感的信号通路，应尽可能固定实验时间点，因为时间点的微小差异也可能...

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披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

感谢印度政府生物技术部国家细胞科学中心提供的机构内支持。AT 和 AD 感谢印度政府生物技术部国家细胞科学中心提供的博士研究生研究支持。DM 感谢印度政府科学与工程研究委员会（SERB）授予的 JC Bose 国家奖学金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丙烯酰胺Biorad, USA1610107
琼脂糖G-Biosciences, USARC1013
过硫酸铵Sigma-Aldrich, USAA3678
ATF4 抗体Cell Signaling Technology, USA11815Western blot 检测 稀释比例-1:1000
ATF6 抗体Abcam, UKab122897Western blot 检测 稀释比例-1:1000
CHOP 抗体Cell Signaling Technology, USA2897Western blot 检测 稀释比例-1:1000
eIF2α 抗体Santa Cruz Biotechnology, USAsc-11386Western blot 检测 稀释比例-1:2000 
GADD34 抗体Abcam, UKab236516Western blot 检测 稀释比例-1:1000
GAPDH 抗体Santa Cruz Biotechnology, USAsc-32233Western blot 检测 稀释比例-1:3000 
HSPA5 抗体Cell Signaling Technology, USA3177Western blot 检测 稀释比例-1:1000
IRE1 抗体Cell Signaling Technology, USA3294Western blot 检测 稀释比例-1:2000
抗小鼠 HRP 偶联抗体 Biorad, USA1706516Western blot 检测 稀释比例-1:4000
磷酸化 eIF2α 抗体Invitrogen, USA44-728GWestern blot 检测 稀释比例-1:1000
PERK 抗体Cell Signaling Technology, USA5683Western blot 检测 稀释比例-1:2000
磷酸化 IRE1 抗体Abcam, UKab243665Western blot 检测 稀释比例-1:1000
磷酸化 PERK 抗体Invitrogen, USAPA5-40294Western blot 检测 稀释比例-1:2000
抗兔 HRP 偶联抗体Biorad, USA1706515Western blot 检测 稀释比例-1:4000
XBP1 抗体Abcam, UKab37152Western blot 检测 稀释比例-1:1000
台式高速离心机Eppendorf, USA5804R转子- F-45-30-11
台式低速离心机Eppendorf, USA5702R转子- A-4-38
双丙烯酰胺Biorad, USA1610201
牛血清白蛋白 (BSA)MP biomedicals, USA160069
Bradford 试剂Biorad, USA5000006
CalPhos 哺乳动物转染试剂盒Clontech, Takara Bio, USA631312病毒储备液制备
CEM-GFPNIH, AIDS Repository, USA3655
Clarity ECL 底物Biorad, USA1705061化学发光检测底物
Clarity max ECL 底物Biorad, USA1705062化学发光检测底物
共聚焦激光扫描显微镜Olympus, Japan型号：FV3000
细胞离心涂片机Thermo Fisher Scientific, USAASHA78300003
DMEMInvitrogen, USA11995073
DMSOSigma-Aldrich, USAD2650
dNTPsPromega, USAU1515
DTTInvitrogen, USAR0861
EDTAInvitrogen, USA12635
溴化乙锭 (EtBr)Invitrogen, USA`15585011
胎牛血清Invitrogen, USA16000044
G418Invitrogen, USA11811023
25% 戊二醛Sigma-Aldrich, USAG6257感染性检测
甘氨酸Thermo Fisher Scientific, USAQ24755
HEK-293TNCCS, India
HIV-1 感染性分子克隆 pNL4-3NIH, AIDS Repository, USA114
倒置显微镜Nikon, Japan型号：Eclipse Ti2
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad, USA1715124
Jurkat J6NCCS, India
氯化镁Sigma-Aldrich, USAM8266感染性检测
MMLV-RT Invitrogen, USA28025013
MTT 试剂Sigma-Aldrich, USAM5655细胞活力检测
N,N-二甲基甲酰胺Fluka Chemika40255感染性检测
NaClThermo Fisher Scientific, USAQ27605
NaFSigma-Aldrich, USA201154
NP40Invitrogen, USA85124
P24 抗原捕获 ELISA 试剂盒ABL, USA5421
PageRuler 预染蛋白 MarkerSci-fi Biologicals, IndiaPGPMT078
多聚甲醛Sigma-Aldrich, USAP6148
pEGFP-N1Clontech, USA632515
青霉素/链霉素Invitrogen, USA151140122
磷酸酶抑制剂Sigma-Aldrich, USA4906837001
Phusion 高保真 PCR 预混液（含 GC 缓冲液）NEB,USAM05532
pLKO.1-TRCAddgene, USA10878慢病毒克隆载体
pMD2.GAddgene, USA12259VSV-G 包膜载体
PMSFSigma-Aldrich, USAP7626
聚乙烯亚胺 (PEI) Polysciences, Inc., USA23966
铁氰化钾Sigma-Aldrich, USA244023感染性检测
亚铁氰化钾Sigma-Aldrich, USAP3289感染性检测
蛋白酶抑制剂Sigma-Aldrich, USA 5056489001
psPAX2Addgene, USA12260慢病毒包装质粒
嘌呤霉素Sigma-Aldrich, USAP8833稳定细胞筛选
PVDF 膜Biorad, USA1620177
随机引物Invitrogen, USA48190011
RPMI 1640Invitrogen, USA22400105
SDSSigma-Aldrich, USAL3771
Steady-Glo 底物Promega, USAE2510荧光素酶检测
T4 DNA 连接酶Invitrogen, USA15224017
TEMEDInvitrogen, USA17919
毒胡萝卜素Sigma-Aldrich, USAT9033
硫黄素 TSigma-Aldrich, USA596200
TrisThermo Fisher Scientific, USAQ15965
吐温-100 (Triton-X-100)Sigma-Aldrich, USAT8787
TrizolInvitrogen, USA15596018
吐温 20Sigma-Aldrich, USAP1379
TZM-blNIH, AIDS Repository, USA8129
超速离心机Beckman Optima L90K, USA330049转子-SW28Ti
UltraPure X-galInvitrogen, USA15520-018感染性检测

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