本文提供了一种人源重组蛋白 flap 内切酶 1（FEN1）的亲和纯化方法，该蛋白带有 6X-组氨酸标签。该方案利用两种不同的固定化金属离子柱对带标签的蛋白进行纯化。
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本文内容
摘要
摘要
对蛋白质进行功能表征需要大量高纯度的蛋白质表达与纯化，以开展生化检测。快速蛋白液相色谱（FPLC）系统可实现复杂蛋白质混合物的高分辨率分离。通过调节FPLC中的多种参数，例如选择合适的纯化介质、控制蛋白质样品的温度、调节样品在介质上的流速以及洗脱速率，可有效保持蛋白质的稳定性与功能活性。在本实验方案中，我们将展示FPLC系统在纯化于细菌培养物中表达的6X-His标签 flap endonuclease 1（FEN1）蛋白方面的广泛应用性。为提高蛋白质纯化效率，我们将重点关注多个关键因素，包括色谱柱的正确装填与准备、使用进样环进行样品注入、样品上柱时的流速控制以及洗脱参数的优化。最后，将分析层析图谱以鉴定富含目标蛋白的组分，并讨论重组蛋白长期保存的注意事项。优化蛋白质纯化方法对于提升蛋白质分析的精确性与可靠性至关重要。
引言
理解细胞生物学的方法多种多样。其中一种方法是采用自上而下的策略，即在某个基因中引入遗传突变，随后评估模式生物中由此产生的表型变化。相反，还原论方法则首先阐明特定蛋白质的分子机制及其酶学功能，并表征其与其他细胞组分的相互作用，进而评估该蛋白质对生物通路的影响。尽管每种研究方法都有其固有的优势和局限性，但要全面理解一个生物通路，仍需开展跨学科的研究工作。
DNA作为生命的遗传蓝图，过去七十多年来，人们对DNA复制及基因组维持机制的研究一直充满浓厚兴趣。在DNA复制领域开展的研究已获得大量关于多种复制蛋白各自结构与功能的数据。这些研究涵盖复制机制的解析与生物化学活性检测，其可行性依赖于复制蛋白的纯化，从而得以在体外对这些蛋白进行精细深入的分析 体外 环境。因此，蛋白质纯化成为大多数致力于揭示DNA复制机制的研究工作中不可或缺且普遍使用的技术。
本文介绍了一种从细菌细胞中过表达并纯化带有6X-组氨酸标签的DNA复制蛋白的方法。该目标蛋白为人源 flap 内切酶1（FEN1），是一种具有结构特异性的核酸酶，在滞后链DNA复制中发挥关键作用，同时也参与碱基切除修复（BER）等重要的DNA修复通路1,2,3。FEN1的主要功能是切割....
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方案
1. 样品制备
- 为纯化重组FEN1蛋白，按照Ononye等人的先前描述，在BL21(DE3)细胞中表达构建体（pET-FCH-FEN1）8。
- 用1%的过夜培养物接种LB培养基（表1），在37 °C下培养细胞至OD达到0.6。
- 加入0.4 M异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导，并继续培养3小时。
- 在4 °C下以5,000 × g离心15分钟收集细胞。将沉淀物储存于-80°C冰箱中。
- 在纯化当天，从-80 °C冰箱中取出细胞沉淀，置于冰上融化，并用100 mL裂解缓冲液（表1）重悬沉淀。
注意：操作过程中细胞裂解液应始终置于冰上，以防止蛋白降解。一旦融化后，整个纯化过程必须在同一天内完成。细胞裂解液不得在冰箱中过夜存放。
- 将悬浮液转移至250 mL烧杯中，在冰上进行超声处理，设置为35%振幅，工作30秒，间歇30秒，持续15分钟。
注意：请参考仪器制造商的设置以确定合适的振幅。 - 将超声处理后的样品转移至离心管中，在4 °C下以27,000 × g离心30分钟，获得澄清的裂解液。将细胞裂解液置于4 °C冰箱中的冰上，直至上样。
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结果
表达hFEN1的BL21 (DE3)细胞裂解液分别通过预平衡的Ni-NTA和TALON树脂。Ni-NTA树脂由Ni2+离子活化，具有高结合容量。结果显示，与TALON树脂相比，Ni-NTA树脂获得的FEN1蛋白产量更高（图7）。已知Ni-NTA树脂还会非特异性结合其他染色体表达的蛋白质。通过钴基树脂纯化的样品虽然纯度较高，但得率低于Ni-NTA树脂。与许多其他DNA结合蛋白类似，FEN1进一步通过凝胶过滤树脂以去除杂质。hFEN1可在43 kDa位置被识别。
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讨论
亲和层析是一种广泛用于纯化DNA结合蛋白的技术。固定化金属离子亲和层析（IMAC）是亲和层析的一种特定类型，利用金属离子捕获肽序列中的组氨酸残基。因此，通常将"6X-His标签"或"多聚组氨酸标签"连接到待纯化蛋白的N端或C端。镍和钴是最常用的金属离子，它们与纯化过程中常用的BME和DTT等试剂的兼容性有所不同。尽管已有在1 mM BME或DTT浓度下完成纯化的报道，但这些试剂的使用仍可能不可靠。在平衡过程中可能观察到不兼容现象。如果流经树脂的缓冲液呈现棕色，表明金属离子发生了氧化，可能导致金属离子从树脂上脱落。这会显著降低树脂的结合能力。
为了确保蛋白质的高纯度和高得率，应优先促进金属离子与His标签之间的亲和相互作用，避免其他可能的电荷相互作用。这将确保所有蛋白质在一次洗脱中完成，而不是在洗脱的不同阶段逐步洗脱。为实现这一目标，蛋白质在纯化过程中应带有极低的净电荷。如果缓冲液的pH值接近目标蛋白质的等电点，则可使蛋白质的电荷保持在较低水平。由于FEN1的等电点约为8.8，因此我们使用的缓冲液pH值维持在8。
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披露
作者不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。
致谢
本工作由美国国家科学基金会（1929346）和美国癌症协会（RSG-21-028-01）的资助项目支持。我们还要感谢 Balakrishnan 实验室成员提供的有益讨论。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4x Laemmli 样品缓冲液 | BioRad | 1610747 | |
| 乙酸 | Merck | UN2789 | |
| β-巯基乙醇（BME） | Sigma | M-6250 | |
| Chromlab 软件版本 6.1.27.0 | BioRad | 用于操作 NGC 系统 | |
| Complete MINI 蛋白酶抑制剂片剂 | Roche | 11836153001 | |
| 考马斯亮蓝 R | Sigma | B0149 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Dot Scientific | DSD11000 | |
| Econo-Column 玻璃层析柱 | BioRad | 7371512 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Dot Scientific | DSE57020 | |
| 流路适配器 | BioRad | 7380014 | |
| 甘油 | Dot Scientific | DSG22020 | |
| 咪唑 | Dot Scientific | DSI52000 | |
| 甲醇 | Fisher Scientific | A412 | |
| Mini PROTEAN TGX 凝胶 | BioRad | 4561084 | |
| NGC 层析系统 | BioRad | 自动化液相层析系统 | |
| Ni-NTA 琼脂糖 | Qiagen | 1018244 | |
| 苯甲基磺酰氟 | Dot Scientific | DSP20270 | |
| PreScission Plus 蛋白双色标准品 | BioRad | 1610374 | |
| 氯化钠 | Dot Scientific | DSS23020 | |
| TALON 金属亲和树脂 | Takara | 635502 | |
| Tris 碱 | DST60040 |
参考文献
- Balakrishnan, L., Bambara, R. A. Flap endonuclease 1. Annu Rev Biochem. 82, 119-138 (2013).
- Asagoshi, K. FEN1 functions in long patch base excision repair under conditions of oxidative stress in vertebrate cells. Mol Cancer Res. 8 (2), 204-215 (2010). ....
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