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解析糖-蛋白质相互作用：核磁共振（NMR）大显身手

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DOI：

10.3791/66530

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2024年5月17日

 ,  ,  ,  , 
1CIC bioGUNE, Basque Research and Technology Alliance (BRTA), 2lkerbasque, Basque Foundation for Science, 3Centro de Investigacion Biomedica En Red de Enfermedades Respiratorias

本文内容

摘要

本文介绍了一种实验方案，详细阐述了用于表征溶液中蛋白质-聚糖相互作用的一系列核磁共振（NMR）实验的样品制备、数据采集、处理与分析方法。文中概述了目前常用的基于配体和基于蛋白质的研究方法，这些方法无疑将推动结构糖生物学和分子识别研究领域的发展。

摘要

糖类与蛋白质的相互作用调控着众多与健康和疾病相关的生物学事件。事实上，这些识别事件的发生及其生物学后果与双方分子的三维结构、动态特性以及它们在相应细胞区室中的呈现方式密切相关。核磁共振（NMR）技术在解析这些特性方面具有独特优势，目前已发展并应用了多种基于NMR的方法来监测糖类与其受体之间的结合事件。本实验方案概述了两种在NMR糖生物学领域中最为强大的NMR技术——1H-饱和转移差谱（STD）和1H,15N-异核单量子相干（HSQC）滴定实验——的数据采集、处理与分析流程。这两种方法分别从糖类和蛋白质的角度提供互补信息，联合使用时可构成一套强有力的工具，用于阐明分子识别过程中的结构与动态特征。这一综合策略有助于加深对糖类-蛋白质相互作用的理解，并推动化学生物学领域相关研究的进展。

引言

糖类分子的分子识别对于许多与健康和疾病相关的过程至关重要。生物受体（如凝集素、抗体、酶）对糖类的特异性和选择性在很大程度上取决于焓（CH-π 和范德华力、氢键、静电作用）与熵（疏水性、动态变化、溶剂化-去溶剂化）各组分之间复杂平衡的调节1。

鉴于聚糖具有高度的化学多样性和动态特性，核磁共振（NMR）方法已被广泛用于解析聚糖相互作用超过25年2，因为这些方法能够以原子分辨率提供分子识别事件的精确细节信息3,4，即使在其他方法无法获得所需相互作用证据的情况下亦能实现。关键在于，NMR技术具有高度的灵活性，能够在不同时间尺度上研究原子水平的动态过程，是目前研究溶液中聚糖结构、构象和动力学特性的最佳技术。然而，解析这些信息可能是一个相当复杂的过程，需要采用明确的策略并结合细致的数据分析5。

核磁共振（NMR）技术具有多样性，实际上有多种方法可用于解析聚糖-蛋白质相互作用6。本文介绍了目前用于解析聚糖-受体相互作用的两种基本NMR方法7,8，重点阐述如何解析关键聚糖表位及其蛋白质结合位点的结构特征9。

在任何分子识别事件中，当受体与特定配体结合时，会发生一种化学交换过程，该过程会影响结合双方的多个核磁共振（NMR）参数10。因此，从NMR的角度来看，这种相互作用既可以从糖类配体的角度进行监测，也可以从蛋白质受体的角度进行观察11。一般来说，蛋白质受体是一种较大的生物大分子（具有较慢的旋转运动，时间尺度在纳秒级别，因此横向弛豫较快），而相互作用的糖类则可被视为中等或较小尺寸的分子（具有较快的旋转运动，时间尺度在皮秒级别，横向弛豫较慢）12。从常规角度来看，糖类的NMR信号较窄，而受体的信号则较宽13。

基于配体的核磁共振（NMR）方法依赖于许多糖类NMR参数在从游离态转变为结合态时发生的显著变化14。饱和转移差（STD-NMR）是最常用的实验性NMR技术，用于评估多种糖类结合特性15，从推断溶液状态下是否存在结合，到确定糖类的结合表位；即与蛋白质受体接触的配体原子16。

或者，基于受体的核磁共振（NMR）方法通过监测在糖类存在下蛋白受体信号相对于其无配体状态（apo state）所发生的变化来开展研究17。这类方法主要聚焦于分析蛋白信号在两种状态之间的化学位移扰动。最常采用的实验是1H-15N HSQC实验，或其TROSY替代方法18。

两种方法的结合使得核磁共振技术可应用于多种多样的体系，这些体系表现出广泛的亲和力范围。然而，与基于配体的方法不同，基于受体的核磁共振方法需要获得相对大量的可溶性、非聚集态、稳定同位素标记（15N）的蛋白质。

本文描述了这两种方法，并强调了它们各自的优点和缺点。需要注意的是，本实验方案中所述的基本步骤仅作为布鲁克（Bruker）波谱仪使用示例，因此命令和参数名称均与TopSpin（布鲁克波谱仪的控制软件）中所使用的保持一致。

方案

1. 饱和转移差NMR（STD-NMR）

注意：以下步骤概述了获取、处理和分析 STD-NMR 实验的基本流程。这些步骤旨在示例该技术在检测配体结合以及阐明配体结合表位方面的应用。如需更深入理解 NMR 实验的设计与采集，请参阅随 NMR 仪器提供的相应制造商手册。

  1. 采集
    1. 制备含有蛋白质-配体复合物的样品。采用10:1至100:1的糖链：凝集素摩尔比，蛋白质浓度范围为0.01至0.2 mM。对于相互作用的 h在pH 7.4的氘代磷酸盐缓冲液中，使用50:1的蛋白质:配体比例进行Galectin-7与LacNAc的结合实验。
      注意：蛋白质受体应保持高纯度，并可溶于所选缓冲液中（对于STD-NMR实验，建议使用相应缓冲液的氘代版本，以减少可能的 1H NMR信号干扰）。使用分光光度计在280 nm处测量吸光度，提前检查蛋白质浓度。
    2. 从配制好的溶液中，用移液器吸取总体积0.6 mL转移至一支5 mm核磁管中。
    3. 在所需温度下准备核磁共振（NMR）仪器（常见实验温度范围介于 10 °C 和 45 °C）。使用温度控制监视器打开 edte 命令并设定所需温度。对于 h半乳糖凝集素-7/LacNAc 研究，温度设定为 25 °C.
    4. 生成一个包含以下内容的新数据集 zg 脉冲序列
      1. 对于一个简单的操作，打开一个已有实验并输入 edc 命令。此时将出现一个对话框，需定义实验的标题、特征（样品规格、溶剂）以及一些实验参数。
      2. 如果需要对原始脉冲序列进行修改，需浏览通过 无血清 （参数）和 AcquPars （采集参数）窗口。此时，从波谱仪的程序库中选择所需的脉冲程序。
      3. 对于一个标准 1H NMR 谱，选择 zg 从可用列表中选择脉冲序列。
        注意：对于含水量较高的样品，可能需要使用水峰抑制技术以提高信噪比。建议采用具有优异抑制效果且能控制残余信号相位的脉冲序列，例如包含激发塑形模块的 zgesgp 序列。有关水峰抑制技术的类型及其主要特性的更多信息，请参阅仪器制造商提供的核磁共振教程。
    5. 通过启动样品气动升降装置将核磁共振样品插入探头中。使用 ej 命令，将样品置于磁铁顶部，并通过使用 ij 命令
      注意： 使用自动进样器将样品注入磁体时，使用以下命令 sx 随后是位置编号 n，对应 NMR 管在自动进样器样品盘中的位置。
    6. 通过输入命令锁定溶剂信号 锁定 然后从菜单中选择合适的溶剂。
    7. 样品插入探头后，使用自动模块完成调谐和匹配过程 atma 或手动模块 atmm.
    8. 通过以下步骤启动自动匀场 topshim gui 命令。这将打开一个图形界面，其中将选择并启动匀场维度1D。
      注意：为尽量减少因微小磁场或温度变化引起的匀场不稳定性， 自动匀场 可为实验采集激活。这可以通过访问 BSMS 控制窗口并点击 自动匀场变为绿色高亮表示 自动匀场 已激活。请注意，使用时 自动匀场，潜在的样品不稳定问题可能未被察觉。因此，在此情况下应谨慎操作。 自动匀场 被采用。
    9. 确定 1H 90° 脉冲。这可以通过自动方式完成 脉冲校准 命令
    10. 修改各项参数 AcquPars 窗口。对于常规 1氢核磁共振谱（1H NMR），设置扫描次数（NS）为32，设定所需谱宽（SW）为 ca. 12 ppm.
      注意： zgesgp 脉冲序列包含一个用于溶剂抑制的模块，以消除残余的HDO信号，该信号应位于谱图中央。为此，O1必须准确定义 AcquPars.
    11. 将接收器增益设置为通过自动指令避免溢出 rga.
    12. 现在，获取标准品 1H NMR 谱图，使用 zg 命令
    13. 采集完成后，通过以下步骤处理谱图 efp 命令。使用基线和相位校正进行处理 TopSpin 菜单栏
      注意： 1来自糖链和蛋白质的 H NMR 信号被观察到（图1建议对所获得的核磁共振谱进行详细分析，以实施 STD NMR 实验，具体步骤见 1.1.14 节。
    14. 创建新数据集，并以与前述相同的方式上传将要使用的 STD NMR 脉冲序列 1H NMR 实验见第 1.1.4 节。在 Bruker 仪器中，脉冲程序目录中提供了多种不同的脉冲序列，均以命名形式存在 stddiffXXX最简单的一种（标准差差异) 不包含任何水信号抑制方案或蛋白质抑制滤波器。
      1. 对于含有显著 H2O 含量，选择其中一种 stddiffgp19 或 stddiffesgp 序列，其中包括水门控（Watergate）或激发塑形模块。当谱图中存在强烈的蛋白质核磁共振（NMR）信号作为背景时，应选择 stddiffXXX.3 序列。在每种情况下，针对每个水抑制模块优化相应的特定参数（例如，watergate方案中的d19）。
    15. 为STD NMR实验定义偏共振频率和共振频率。在AcquPars参数的频率列表中查找。 已建立 窗下 FQ2LIST 进入。需将定义的共振频率和非共振频率（单位：Hz）手动输入列表中，并以新名称保存。该新列表将用于STD-NMR实验。
      1. 选择无糖类信号的共振频率区域，通常在谱图中约 δ(1H) 0 或 6.6 ppm，适用于典型的聚糖（图1）。将离共振频率设置在不显示任何配体或蛋白质质子的区域。可安全地设为 +18000 或 -18000 Hz。
    16. 定义在饱和时间内使用的脉冲形状 AcquPars 参数的 已建立 窗口
      注意：有多种可能的选择。可安全使用高斯形或Eburp形， 90° 选择性脉冲宽度为50 ms。
    17. 设置相应的参数 AcquPars 部分。
      1. 设置 1H 90° 脉冲长度。
      2. 设定整形脉冲的功率值（通过估算确定） 形状 工具）。
      3. 设置总饱和时间，通常可采用1 s至4 s之间的值。
      4. 将弛豫延迟设置为 3 s。
      5. 将扫描次数（NS）设为8的倍数。通常设置为256、512或1024，以在每个频率处获得适当的信噪比，且成倍数成对增加。
      6. 将伪扫描次数（DS）设置为 8。
      7. 将F2中的点数设置为16k、32k或64k。
        注意：F2 中增加数据点数量将提高分辨率和信噪比。因此，强烈建议使用不少于 16k 的数据点。
      8. 设置F1中的点数。这是指要使用的频率数量，本例中为2（共振频率和非共振频率）。
        注意：按照惯例，F2 指直接维，即直接采样自由感应衰减（FID）信号的维度，而 F1 表示间接维。
      9. 将接收增益（RG）设置为避免自动指令下发生溢出 rga.
    18. 使用以下命令计算整个实验所需的时间 实验.
    19. 通过以下步骤发送实验以进行数据采集 zg 命令
    20. 实验开始数分钟后，务必检查实验运行是否正常。
  2. 处理
    注意：应用上述方案后可获得伪二维谱。行数对应于所用频率的数量，通常为两个：共振频率和非共振频率。
    1. 处理第一次实验的 fid。
      1. 对第1个fid信号进行傅里叶变换（通过 efp 命令），然后选择处理后谱图的存储位置（选择 procno 编号）。或者，使用 rser 1 读取第一个 fid 的命令。
      2. 然后，通过调整线宽展宽因子 磅 命令（通常为 3-5 Hz），以及相位。要手动调整相位，请点击 过程 标签，然后 调节相位 子菜单。通过单击并拖动相应的按钮执行零阶和一阶校正。保存相位校正结果。此外，通过命令执行基线校正 abs.
    2. 读取第二次实验的 fid，并进行傅里叶变换（通过 efp 使用相同的线宽展宽因子进行傅里叶变换（command），并采用相同的相位参数和基线校正进行相位调节，将处理后的谱图以不同的编号保存。
    3. 使用多重功能读取两个已处理的光谱（命令： .md）并使用多视图界面上提供的按钮进行相减（离共振 - 共振）Δ）。新的谱图是STD NMR谱图，将使用不同的代码保存。
    4. 将STD NMR谱图与去共振谱图进行叠加。
      1. 打开非共振谱图（fid 1）并输入 .md 打开多显示窗口的命令。然后，上传STD谱图。
      2. 比较STD NMR谱图中信号的频率和强度（自动显示在右上角）。这可提供有关靠近蛋白质的质子及其相对接近程度的所需信息。相对强度越高，表明其与蛋白质的距离越近。图2).
    5. 使用相应的软件测量非共振实验中的强度（积分值）。在 TopSpin 中，进入 分析 > 整合. 定义区域并将积分写入文件（I0).
    6. 使用相同的参数测量STD NMR实验中的强度（积分），并将结果记录在文件中（ISTD).
    7. 使用以下公式计算每个质子信号的 STD 值：
      STD = (ISTD)/I0.
      注意：使用信号积分法计算STD值时，要求质子信号充分分离。当出现信号重叠（如寡糖类物质）时，可通过评估STD谱与离共振谱之间的信号强度比来确定STD值。
    8. 将相对STD以百分比形式计算。为此，将非共振照射谱与STD NMR谱中信号强度差异最大的质子设为100%。据此计算其他质子的相对STD强度。
      注意：对STD数据的正确分析，特别是确定配体结合表位，需要完成全部归属 1配体的H信号。因此，强烈建议在采集STD谱图之前完成此步骤。

2. 1H-15N HSQC 实验

注意：以下步骤详细说明了如何利用1H-15N HSQC实验，监测受体（凝集素）的1H和15N核磁共振信号化学位移随配体（寡糖）浓度逐步增加而发生的变化19。基于所提取数据的化学位移扰动（CSP）分析，对于鉴定结合伙伴、绘制蛋白质结合界面以及确定结合亲和力均具有重要价值。如需更深入理解核磁共振实验的设计与数据采集，请参考核磁共振仪器配套的制造商操作手册。

  1. Acquisition and processing
    1. 制备含有目标凝集素的样品。确保受体蛋白的每个氨基酸残基（包括主链和侧链）均实现完全 15N 标记。 15在骨架和侧链的每个氨基酸残基中均实现完全 15N 标记。通常，为检测谱图中水可交换的 HN 交叉峰，使用 90:10 的 H2O:D2O 混合物配制缓冲溶液。2O: D2O 来配制缓冲溶液。所需凝集素浓度范围为 0.05 至 0.2 mM，具体取决于 1515N标记的受体与所需的信噪比。
      注意：在整个实验过程中，蛋白质应保持稳定，在核磁共振管内无可见沉淀物生成。此外，蛋白质应纯净且可溶于所选缓冲液中。 1H and 15HSQC谱图中每个交叉峰的 \(^{15}\text{N}\) 归属应预先完成，以便每个交叉峰均能通过对应于特定氨基酸残基的标签进行识别。
    2. 取 0.6 mL 该制备样品，转移至 5 mm NMR 管中。
    3. 将核磁共振仪器设定至所需温度。参见步骤 1.1.3 并执行相同操作。
    4. 创建新数据集。参见步骤 1.1.4 并重复相应操作。
    5. 将 NMR 样品按步骤 1.1.5 所述插入探头。
    6. 锁定溶剂信号。要启动锁定程序，请使用命令 lock 并从菜单中选择合适的溶剂。锁场信号可在锁场窗口中追踪。调节锁场增益，使锁场信号在锁场窗口中清晰可见。
    7. 自动完成调谐与匹配过程（通过命令 atma或手动（ atmm 命令将打开 ATM 控制窗口以调整摆动曲线）。
    8. 使用 TopShim 工具设置最佳匀场。输入命令 topshim gui. See instructions in step 1.1.8.
    9. 测定 1H 90° 脉冲长度（如步骤1.1.9所述）与偏置频率（命令 o1calib 将运行一个交互式 O1 校准程序，获取偏置频率）。在使用溶剂抑制方案的实验中，后一个参数至关重要。
    10. 如第 1.1.4 节所述创建新数据集。为减少或消除 H2O 信号的干扰，请使用脉冲序列 zgesgp.
    11. 通过修改“AcquPars”窗口中的各项参数来设置实验。 AcquPars window.
      1. 设置 1H 90° 输入先前测定的 ¹H 90° 脉冲长度和偏置频率 (o1)，并将扫描次数 (NS) 设为 32，谱宽 (SW) 设为约 12 ppm。
      2. 使用 Topspin 菜单栏中的 Shape 工具确定整形脉冲的功率水平。 Shape Topspin 菜单栏中提供的 Shape 工具。
      3. 使用自动命令 rga 设置接收器增益。 rga.
    12. 使用 `zg` 命令启动实验进行采集。 zg 命令并处理所得的自由感应衰减信号，以获取 1H NMR spectrum.
    13. 创建用于采集的新数据集。 1H-15N HSQC NMR 实验。在 AcquPars 选项卡中，选择脉冲程序 hsqcetfpf3gp 脉冲程序目录中可用的
    14. 设置实验。使用命令加载默认的波形、功率及时间参数。 getprosol然后，更新 1H 90° pulse length and offset.
    15. 定义以下参数。
      1. 将弛豫延迟时间设置为 1-5 秒。
      2. 将扫描次数设置为4的倍数。通常，为获得适当的信噪比，可将其设定为8、16、32或64次。
      3. 将预扫描次数设置为 128。
      4. 将 F2 维的点数设置为 1k、2k 或 4k。
      5. 设置 F1 维的点数：即 t1 增量的数量。1 设定 F1 的点数：即待使用的 t1 增量数。根据谱宽的不同，该数值通常在 128 至 256 之间。
      6. 将谱窗中心在 15N 维度至 δ 将 15N 维度的谱窗中心调整至 δ 117 ppm，并将相应的谱宽设置为 36 ppm。这些参数需针对每个具体体系进行优化。
      7. 设置接收器增益以避免溢出（使用 `rga` 命令）。 rga command)
    16. 计算实验总耗时。典型的实验时间约为1小时。
    17. Type zg 发送实验指令以启动数据采集。
      **注意：** 实验开始数分钟后，务必检查其是否运行正常。
    18. 使用命令处理 FID xfb使用命令执行基线校正 abs2 并进行相位校正。 Process 选项卡。如需手动调相，请点击 adjust phase 子菜单，随后从二维谱图中选取若干交叉峰。接着，通过点击并拖动相应按钮，依次对行与列施加零阶和一阶相位校正。保存相位校正结果。
    19. 保存所得二维谱图。
    20. 配制高浓度的配体储备液。典型浓度为 50-100 mM。
    21. 从高浓度聚糖储备液中，吸取相应体积（数微升）转移至含有受体的核磁管中，以达到所需的蛋白质：配体摩尔比，并记录谱图。
      注意：此步骤启动滴定系列，即将配体滴定至蛋白质样品中。必须针对每个具体案例确定合适的蛋白质与配体比例。若结合亲和力完全未知，建议在初始滴定点使用亚化学计量的配体量。
    22. 对重新制备的样品执行步骤 2.1.1 至 2.1.19。
    23. 对具有递增蛋白质-配体比例的样品，重复步骤2.1.21和2.1.22。
      注意：滴定系列数据的精确拟合需要采集多个 1H-15N-HSQC 实验，涵盖广泛的蛋白质-配体比例范围，包括实现蛋白质饱和所需的比例。
  2. Analysis
    1. 使用合适的软件可视化脱辅基物种处理后的二维 HSQC 谱图：TopSpin、MestReNova 和 CCPNMR 均为适用于处理 NMR 数据的程序。
      注意：这是该蛋白质的指纹图谱。观测到的 1H and 15N化学位移取决于每个氨基酸所处的化学环境，而该环境与蛋白质的三维结构密切相关。此谱图被称为蛋白质指纹谱。一张分散良好的二维 1H-15在 1H-15N HSQC 谱图中，所有交叉峰均呈现均匀的强度，这强烈表明存在一个折叠良好的蛋白质。19.
    2. 生成列表。 1H and 15所有交叉峰的 N 频率。使用辅助软件，例如 CCPNMR 程序20可辅助此过程。
    3. 将第一或第二滴定点的谱图叠加至脱辅基蛋白的谱图上。
      1. 为此，请打开对应于载脂蛋白状态的二维谱图，点击 Multiple display 选项卡，然后添加第二个二维谱。通过目视检查两个谱图，可获得配体与蛋白质之间是否存在相互作用的信息。
        ​**注意**：从蛋白质'从结合的角度来看，结合事件的存在会直接参与识别过程的氨基酸化学环境发生变化，并伴随化学位移扰动（CSP）。
    4. 针对每个滴定点重复步骤 2.2.2 和 2.2.3，生成化学位移扰动值列表。 1H and 15不同谱图中所有交叉峰对应的 15N 频率，这些谱图对应不同的蛋白质-配体摩尔比。
      **注意：** 每个滴定点的化学位移无需进行任何新的交叉峰归属即可测量。在凝集素-聚糖相互作用中常见的快交换机制下，只需追踪整个滴定过程中峰的渐进移动即可。
    5. 请确认，在最后一个滴定点时，化学位移扰动相对于前一次添加已基本消失。这一现象表明，蛋白质结合位点已被配体饱和，且配体处于高度过量状态。
    6. 使用以下公式计算最大化学位移扰动 (maxCSP)：
      figure-protocol-1
      ΔH and ΔδN 化学位移差异是否在 1H and 15分别对应无配体状态与最终滴定点之间的 N 个频率。
    7. 在二维图中，以垂直 y 轴绘制最大化学位移扰动 (maxCSP)，以水平 x 轴绘制对应的氨基酸残基。
    8. 对蛋白质结合态与游离态之间化学位移扰动最大的氨基酸残基进行目视检查。这些残基极有可能属于结合位点或位于其邻近区域。
    9. 若该蛋白质的三维结构已知，请使用 PyMOL 或 BIOVIA Discovery Studio 等适当软件打开相应的 PDB 文件。这些分子可视化程序在结构生物学应用中广泛使用。选择显示出最高 maxCSP（高于标准偏差两倍以上）的残基，并用特定颜色标记，以定位推测的结合位点。
    10. 在快交换机制下，估算解离常数（KD) 根据观测到的化学位移扰动 (CSP) 的非线性最小二乘拟合 1H-15N HSQC 交叉峰在各时间点Δδobs) versus 该点处特定蛋白质 [P] 与配体 [L] 的浓度：
      figure-protocol-2
      **注意：** 此方程可应用于那些显示清晰、孤立信号的交叉峰。将所得数值进行平均，以提供对 K 的估算。D.

结果

在此，我们介绍一种利用 1H-STD 核磁共振及 1H-15N HSQC实验以揭示凝集素与小寡糖结合相互作用的细节。通过LacNAc分子识别分析所获得的结果 h半乳糖凝集素-7（Galectin-7）hGal-7）被包含在内，作为该实验方案成功实施以及这些NMR方法在研究分子识别过程精细细节方面有效性的示例说明。 图3 显示 1LacNAc 相互作用的 H-STD NMR 谱 hGal-7。STD NMR 信号的存在表明发生了结合（图3A）。此外，只有那些与蛋白质密切接触的质子所产生的信号才会显现，从而能够确定结合表位。图3B). 图4 重点展示了 1H-15蛋白质的N HSQC谱可作为其指纹图谱， 图5 说明了……的应用 1H-15N异核单量子相干（HSQC）滴定实验，用于确定化学位移扰动 hGalectin-7 骨架酰胺基团在结合 LacNAc 时的变化。这些数据不仅揭示了相互作用的存在，还明确了该凝集素的结合界面。 图6 展示了如何通过滴定数据分析来估算 LacNAc 的结合亲和力 h半乳糖凝集素-7，其浓度处于高微摩尔范围。该发现与采用其他技术获得的结果一致。

figure-results-1
图 1：共振频率的选择。 显示的是在 pH 7.4 的氘代磷酸盐缓冲液中 LacNAc:hGal-7 50:1 比例的 1H-NMR 谱图。配体（LacNAc）的信号集中在 2.0–5.2 ppm 区域。饱和频率经过仔细选择，以确保在 1–2 ppm 范围内无配体质子信号，从而实现对蛋白质质子的选择性照射。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-2
图 2：STD NMR 实验。 STD 实验的示意图：第一个谱图（离共振）作为参考，而第二个谱图（在共振）中对蛋白质进行饱和。饱和效应在蛋白质内部高效传播，并传递给与蛋白质紧密接触的配体质子。所得的差谱（STD 谱）仅显示那些经历过饱和的共振信号。通过分析 STD 实验，可实现结合糖的表位作图。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-3
图 3：从配体角度分析结合情况。 （A）LacNAc 与 hGal-7 相互作用的去共振谱和 1H STD-NMR 谱叠加图。在 STD 谱中，仅显示与蛋白质密切接触的质子对应的信号。配体的 1H 共振信号归属标注于去共振谱中。（B）将相对 STD 强度映射至 LacNAc 的化学结构并以颜色标注。请点击此处查看此图的放大版本。

figure-results-4
图4：蛋白的 1H-15N HSQC 谱图代表其指纹图谱。（A）游离态下100 µM hGal-7 的 1H-15N HSQC 谱图。谱图在25 °C下采集。部分NH交叉峰标注了相应氨基酸的标签。（B）每个NH对均表现出独特的化学位移，该位移取决于化学环境，因而取决于蛋白的三维结构。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-5
图5：从蛋白质角度进行的结合分析。（A）显示了将LacNAc滴定至hGal-7溶液中所记录的1H-15N HSQC谱图的叠加结果。通过观察谱图中多个交叉峰发生的化学位移变化，可明显看出存在相互作用。（B）根据LacNAc（15当量）滴定至hGal-7所得数据，计算出的主链酰胺信号最大化学位移扰动（maxCSP）图谱。（C）根据化学位移扰动（CSP）分析，hGal-7中扰动最显著的氨基酸残基被映射到5gal PDB结构上。在三维模型中，红色区域表示CSP值超过2σ，粉红色区域表示CSP值介于1σ至2σ之间。这些着色区域很可能代表了结合位点。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-6
图6：基于1H-15N HSQC 滴定实验的KD测定。 （A）根据体系在NMR时间尺度下的化学交换速率（快速、中等或慢速），1H-15N HSQC 谱图滴定模式的示意图。LacNAc与hGal-7 相互作用表现为快速交换模式。（B）通过CSP分析在不同配体浓度下获得的拟合曲线及KD估算结果，模型体系为hGal-7 与LacNAc二糖。报告的KD值为20个不同氨基酸数据的平均值，并包含相应的误差范围；（C）1H,15N-HSQC 谱图片段，显示滴定过程中选定交叉峰的化学位移变化。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

饱和转移差值核磁共振（Saturation transfer difference NMR，STD-NMR）已成为研究配体-蛋白质相互作用中最常用且最灵活的核磁共振方法。如上所述，该方法基于饱和转移现象，实验设置包括采集两个一维（1D）谱图 1H谱：在共振时¬ 以及 ¬离共振光谱。在共振实验期间，通过在一定时间内（饱和时间通常为1-3秒）施加一串低功率射频脉冲，实现对蛋白质特定质子的饱和。为了避免对配体产生直接饱和，需优化饱和脉冲的频率和持续时间，以选择性地照射蛋白质的特定质子；即脉冲应施加在无配体信号的频率位置，并具有适当的持续时间（图1）。对于50毫秒的饱和脉冲，通常应使饱和区域与最近的配体信号之间保持1 ppm的差异。一般而言，对蛋白质脂肪族区域施加选择性饱和脉冲可获得更强的饱和效应。如果配体分子不含芳香信号，也可选择照射芳香族质子（6–7 ppm）。这对于天然存在的糖类尤为有用，因为它们不含芳香基团。一旦蛋白质的特定区域被选择性照射，饱和效应将通过偶极相互作用在蛋白质内部传播 1H-1H交叉弛豫（自旋扩散）。最终，饱和效应到达结合位点处的蛋白质质子，并进一步传递给与其紧密接触（r < 5 Å通过分子间作用与受体 1H-1H NOE。显然，被饱和的配体质子信号强度会降低。在接收到饱和效应后，由于结合动力学的作用，瞬时结合的配体（需满足快速交换条件）发生解离，饱和信息因而累积于游离状态中。由于该过程，核磁共振共振频率处的谱图呈现出减弱的信号图2).

为了清晰展示结合态糖类1H核的信号强度变化，需在相同条件下采集一个对照质子核磁共振谱（离共振谱），其中饱和脉冲施加在远离任何受体或糖类信号的位置（通常在40–100 ppm之间）。将离共振谱与共振谱相减后得到的一维差谱仅显示配体中信号强度发生改变的1H核信号：即那些距离受体结合位点足够近、能够接收到磁化转移的质子信号（图2）。

然而，并非所有 1结合态碳水化合物中的H核接收到相同程度的饱和。理论上，磁化从受体向结合配体的转移具有距离依赖性（1/r6）。这意味着在糖链中传递的饱和度强度 1H核包含配体质子与受体质子之间空间接近性的信息，且质子与受体越接近，饱和转移差（STD）NMR信号强度越大。因此，STD NMR实验还可用于确定碳水化合物的结合表位图2 和 图3因为位于蛋白质表面附近的配体质子信号强度高于不直接参与结合的质子。

该实验适用于弱至中等亲和力的体系，极少适用于低 µM 或 nM 范围内高亲和力的体系。实际上，该方法要求解离速率在弛豫时间尺度上较快；否则，在配体解离之前，饱和转移信息会因弛豫而丢失。

另一方面，基于蛋白质的核磁共振（NMR）实验能够以氨基酸水平的精度揭示配体-蛋白质相互作用，而无需解析原子分辨率的结构。该方法可直接在溶液中检测分子识别现象，无需共结晶。化学位移扰动（CSP）分析作图在发现配体和绘制蛋白质结合位点方面具有极强的能力（图4 和 图5）。该方法适用于毫摩尔（mM）至纳摩尔（nM）范围内的各种亲和力，即使对于在化学位移时间尺度上交换速率较慢的体系也同样适用21。

然而，由于弛豫问题，该方法可能不适用于分子量超过30-40 kDa的蛋白质。此时可采用TROSY方法18，尤其是与蛋白质氘代技术联用时效果更佳。此外，蛋白质应均匀标记15N（并另准备一份同时标记13C和15N的样品，以完成必要的骨架归属）。因此，应优化包括相应表达系统在内的蛋白质表达条件，以获得毫克量级的蛋白质。倾向于寡聚化或聚集的蛋白质也不适用于此类分析。本研究中用于采集NMR数据的仪器为配备TCI低温探头的Bruker 800 MHz谱仪。若使用低于600 MHz的仪器或无低温探头的设备，实施该方法将极具挑战性。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢西班牙国家研究局（Agencia Estatal de Investigación）提供的塞韦罗·奥乔亚卓越中心认证 CEX2021-001136-S（由 MCIN/AEI/10.13039/501100011033 资助）以及CIBERES（西班牙卡洛斯三世健康研究所（ISCIII，西班牙马德里）的一项倡议）。 同时感谢欧盟委员会对 GLYCOTWINNING 项目的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5 mm Shigemi 微量管套装，带垫圈CortecNet SASS30BMS-005B
α-乳糖-琼脂糖Sigma-Aldrich 公司ímica S.L.7634-5ML
氯化铵（15 N，99%）LC-0179-N-50GTracer Tecnologí作为分析ítics S.L
氨苄青霉素（钠盐） Melford Laboratories LTDA40040
BIOVIA Discovery Studio BIOVIA，达索系统è间期
BL21(DE3) 化学感受态细胞 默克生命科学有限公司CMC0014-40X40UL
离心贝克曼库尔特Allegra X-22R
D2O 剑桥同位素实验室公司DLM-4-1000
培养箱EppendorfInnova 42
IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷） ß-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷)VWR国际欧罗实验室有限公司VW437144N
LacNAcElicitylGLY008
Luria Bertani (LB) 培养基默克生命科学有限责任公司3397-1KG
5000 mL 锥形瓶 VWR International Eurolab S.L.214-1137
PBS 10x伯乐（Bio-Rad）1610780
PyMOLPyMOL 分子图形系统版本 2.0 Schrödinger
超声波破碎仪声学 & Materials, Inc.VC 505
超导核磁共振磁体布鲁克600 MHz AVANCE III
超导核磁共振磁体Bruker800 MHz AVANCE III

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解析糖-蛋白质相互作用：核磁共振（NMR）大显身手
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