本文描述了一种在人工脂质膜上以高时空精度产生光调控且可逆的蛋白质图案的实验方案。该方法包括在模型膜上对固定化的蛋白质iLID（改进型光诱导二聚体）进行局部光激活，在蓝光照射下，iLID可与其伴侣蛋白Nano（野生型SspB）结合。
本文内容
摘要
摘要
在特定时间将蛋白质精确地定位于细胞膜并使其活化，会引发多种细胞过程，包括细胞极化、迁移和分裂。因此，在合成细胞中重现和控制此类过程时，必须具备以亚细胞分辨率和高时间精度将蛋白质招募至模型膜的方法。本文描述了一种在脂质膜上以高时空精度实现光调控可逆蛋白质图案化的方法。为此，我们将可光控开关的蛋白质 iLID（改进型光诱导二聚体）固定在支撑脂双层（SLB）以及巨大单层囊泡（GUV）的外膜上。在局部蓝光照射下，iLID 会与其伴侣蛋白 Nano（野生型 SspB）结合，从而将任何与 Nano 融合的目标蛋白（POI）从溶液中招募至膜上的光照区域。该结合在黑暗中可逆，从而实现目标蛋白的动态结合与释放。总体而言，这是一种灵活且多功能的方法，可通过蓝光以高时空精度调控蛋白质的定位。
引言
亚细胞区域中细胞膜上蛋白质模式的形成引发了多种生物学过程，包括细胞迁移、分裂以及局部的细胞间通讯1,2。这些蛋白质模式在空间和时间上受到调控，并具有高度动态性。在合成细胞中重现此类蛋白质模式，对于模拟由此产生的细胞过程以及深入理解分子层面的调控机制至关重要。与活细胞膜中观察到的现象类似，在人工膜上构建蛋白质模式的方法必须能够捕捉其动态特性，并实现精确的时空控制。
在各种刺激因素中，光因其能够提供最高的时空控制能力以及多种额外优势而尤为突出3。通过光调控，可在任意期望的时间对特定区域进行精确照射，操作简便且精度无与伦比。此外，光具有高度可调性，光强和脉冲持续时间均可调节。同时，可见光对生物分子（包括蛋白质）无害，并且可以利用不同波长分别调控多种功能。因此，基于可见光的响应策略成为在空间和时间上实现蛋白质模式可控且生物正交调控的有前景途径4,5,6。利用来自光遗传学的可光控蛋白对——作为光诱导二聚化工具——可简便地将 特定蛋白质招募至膜上。特别是，已成功在人工膜上利用以下系统构建出蛋白质图案：由蓝光触发的iLID（改进型光诱导二聚体，基于来自 Avena sativa的可光控LOV2结构域）与Nano（野生型SspB）之间的相互作用7,8、蓝光诱导的SpyTag系统（BLISS）9、对绿光响应的 蛋白四聚体CarH10，以及红光诱导的PhyB与PIF6之间的相互作用11。
已有研究表明，利用蓝光可对模型膜上的蛋白质进行光图案化，其原理是基于iLID 与Nano5之间可光控开关的相互作用7。iLID/Nano相互作用在黑暗条件下可逆，具有高度特异性，并可在生理条件下发挥作用。将iLID锚定在脂质膜模型（如巨大单层囊泡（GUVs）或支撑脂双层（SLBs））上，可实现Nano在光照下被招募至这些膜结构，并在避光后发生可逆解离。值得注意的是，我们发现将一个无序结构域引入iLID的N端（由此获得一种名为disiLID的蛋白），作为与模型脂质膜连接的分子 tether，能够增强Nano的招募效率以及回复动力学8。
通过利用 disiLID/Nano 相互作用，我们开发了一种在 SLB 和 GUV 外膜上生成目标蛋白（POI）纳米融合蛋白高对比度图案的方法。该方法可在几分钟内实现具有优异空间和时间分辨率以及高可逆性的蛋白图案化。本详细方案阐述了在人工膜上局部招募蛋白的流程。具体而言，该过程通过生物素-链霉亲和素（SAv）相互作用，将生物素标记的 disiLID 固定在 SLB 和 GUV 上实现。随后，在蓝光照射下，荧光标记的 Nano（mOrange-Nano）被招募至这些经 disiLID 功能化的膜上。我们的实验方案为实现膜上蛋白的局部富集提供了一种简便且可灵活调整的方法。重要的是，该方法不仅限于文中报道的 SLB 和 GUV 界面或 mOrange-Nano；还可拓展至其他经 disiLID 功能化的材料以及与 Nano 融合的蛋白。
方案
1. 实验准备
- 按照先前报道的方法7,8表达并纯化生物素化disiLID（b-disiLID）和mOrange-Nano（参见材料表）。
- 在玻璃小瓶中配制具有选定脂质组成和浓度的脂质混合物。首先，将脂质溶解于氯仿中，得到终浓度为1 mg/mL的脂质溶液。
- 混合脂质，使其组成为94.9 mol% 2-油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DOPC）、5 mol% 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(生物素基)钠盐（DOPE-生物素）和0.1 mol% 1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青（DiD）（参见材料表）。
注：可根据需要调整脂质混合物的比例、DOPE-生物素的浓度和/或使用不同的膜染料。推荐使用的DOPE-生物素浓度（5 mol%）可在后续步骤中形成高密度的链霉亲和素（SAv）层。
- 混合脂质，使其组成为94.9 mol% 2-油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DOPC）、5 mol% 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(生物素基)钠盐（DOPE-生物素）和0.1 mol% 1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青（DiD）（参见材料表）。
- 按照先前报道的方法7,8,12制备小单层囊泡（SUVs）。本研究建议制备直径≤100 nm的SUVs。
- 本研究采用超声处理法。首先，在玻璃小瓶中用氮气流吹扫氯仿溶液，同时旋转小瓶，以形成均匀的脂质薄膜。随后，在真空条件下至少去除残留氯仿1小时。
- 将干燥的脂膜在超纯水中通过涡旋振荡重新水化，最终脂质浓度为1 mg/mL。最后，对所得溶液超声处理10分钟，直至溶液由浑浊变为澄清。
注：将脂质混合物储存于微量离心管中，置于冰箱中最多可保存2周。也可采用其他SUV制备方法（如挤出法），只要最终SUV的尺寸≤100 nm即可。
- 将干燥的脂膜在超纯水中通过涡旋振荡重新水化，最终脂质浓度为1 mg/mL。最后，对所得溶液超声处理10分钟，直至溶液由浑浊变为澄清。
2. mOrange-Nano 在功能化 SLB 上对 disiLID 的募集
- 在 µ-slide 18 孔玻璃底培养板（参见材料表）的每个孔中加入 150 µL 的 2 M NaOH，并在室温下孵育 1 小时。随后去除 NaOH，并先用 150 µL 超纯 水将各孔洗涤 3–5 次，再用含 10 mM CaCl2 的缓冲液（10 mM Tris pH 7.4，100 mM NaCl）洗涤 3 次，每次 150 µL。
- 向含有 150 µL 含 10 mM CaCl2 缓冲液的孔中加入 15 µL 新鲜配制的小单层囊泡（SUVs）（储备浓度为 1 mg/mL 水溶液），使 SUVs 在缓冲液中稀释约 10 倍。室温孵育 30 分钟。孵育结束后，将形成生物素化的固相支持脂双层（biotinylated-SLBs）。
- 用不含 CaCl2 的缓冲液（10 mM Tris pH 7.4，100 mM NaCl）对 SLBs 进行至少 7 次洗涤，每次先移除溶液，再加入新鲜缓冲液。建议每次洗涤使用 80 µL 缓冲液。
注意：通过移液器将新鲜溶液反复吹打数次（不接触表面）可实现 SLBs 的最佳洗涤效果。对新形成的 SLBs 所在孔进行移液操作时应轻柔，以减少小气泡的产生，避免损伤 SLBs。自此之后，各孔应始终保持足够的缓冲液体积，防止 SLBs 干燥。 - 为进一步利用 SAv 对生物素化 SLBs 进行功能化修饰，加入 SAv 溶液至终浓度为 250 nM，在室温下孵育 30 分钟。随后通过至少 5 次缓冲液（10 mM Tris pH 7.4，100 mM NaCl）洗涤，去除未结合的过量 SAv。
- 自此开始，将样品置于保护性红光下，以避免光控开关蛋白发生非预期的光激活。向孔中加入 b-disiILD（参见材料表），使其终浓度达到 1 µM。室温孵育 30 分钟后，通过缓冲液至少洗涤 5 次，去除未结合的过量蛋白。
- 加入 mOrange-Nano（参见材料表），使其终浓度为 200 nM，并用铝箔包裹样品以避光保存。
- 将 µ-slide 置于荧光显微镜下并调整成像参数。设置 552 nm 激光用于激发 mOrange-Nano，调节发射波长范围以优化 mOrange 信号。使用 488 nm 激光并以 2.58 秒间隔的光脉冲实现 disiLID 的光激活。
3. GUV 的制备
- 在超纯水中配制含100 mM蔗糖的5% (w/v) 聚乙烯醇（PVA，参见材料表）（分子量：145 000 g/mol）溶液，于80 °C、400 rpm条件下搅拌过夜。
- 用氯仿配制所需组成的脂质溶液（终浓度为10 mg/mL）。本方法推荐的组成为：10 mg/mL POPC、10 mol% 1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油)（POPG）、2 mol% DOPE-生物素和1 mol% DiD（参见材料表）。
- 采用水合技术制备GUVs7,8。首先，用移液枪头将40 µL已配制的PVA溶液均匀涂布于60 mm × 24 mm的玻璃片表面，形成一层均匀的薄膜。随后，在50 °C下干燥30分钟。
- 用针头将5 µL脂质溶液涂布在PVA薄膜上，并在30 °C下干燥1小时。
- 使用间隔片（约40 mm × 24 mm × 2 mm，参见材料表）和另一片玻璃片，在已功能化的玻璃片上组装一个密闭腔室。
- 向腔室内加入1 mL再水合缓冲液（10 mM Tris pH 7.4，100 mM NaCl），在室温下孵育1小时以形成GUVs。1小时后，将腔室倒置，并用移液枪头轻轻敲击玻璃表面。
- 小心移除一侧的玻璃片以打开腔室，用移液器收集GUVs。
- 将溶液转移至塑料离心管中，静置2小时使GUVs沉降。
4. mOrange-Nano 向 disiLID 功能化 GUVs 的募集
- 将SAv溶液加入 freshly harvested GUVs 中，室温下静置30分钟。
注意：以下步骤应在保护性红光下进行，以避免disiLID发生光激活。 - 向GUVs溶液中加入1 µM的b-disiLID，并将样品置于暗处30分钟，用铝箔覆盖。
- 用150 µL BSA溶液（3% w/v，溶于水）预处理µ-slide 18孔玻璃底培养皿，处理10分钟。随后吸除BSA溶液，并用150 µL超纯水清洗各孔3次。
- 向孔中加入145 µL缓冲液（10 mM Tris pH 7.4，100 mM NaCl）中的200 nM mOrange-Nano。
- 接着，向溶液中加入5 µL带有b-disiLID修饰的GUVs，静置约15分钟，使GUVs沉降。
- 将µ-slide置于共聚焦显微镜下。在552 nm激发以观察mOrange（λex = 557 nm；λem = 576 nm）的荧光信号，在638 nm激发以观察GUV膜中DiD（λex = 644 nm；λem = 665 nm）的荧光信号。每5.3秒施加一次蓝光脉冲（488 nm，强度1%）以触发mOrange-Nano的募集，从而最小化非预期的光漂白效应。
注意：激发波长可根据所使用的显微镜类型进行调整。其他显微镜常用的激发波长包括532 nm或561 nm，以及633 nm、647 nm、639 nm或640 nm激光。
结果
所述实验步骤可用于在合成膜上形成支持性脂双层（SLB），以招募mOrange-Nano。在功能化修饰有b-disiLID的支持性脂双层（SLB）上，形成定义明确的mOrange-Nano图案，如图1A所示。当以488 nm蓝光照射SLB上一个方形区域（24 µm × 24 µm）作为感兴趣区域（ROI）时，在200秒内，可在mOrange通道（红色显示）观察到该区域内荧光信号迅速增强。所形成的图案边缘清晰锐利（图1B），表明对光激活区域具有高度空间控制性。当蓝光照射中断时，该相互作用迅速且完全可逆。该方法还允许在多次光照循环中形成图案（图2）。交替进行约200秒蓝光照射与200秒黑暗处理，可在选定区域实现mOrange-Nano的多次可逆招募，且每次形成的图案中荧光强度变化（Δ intensity）具有可比性。
图3展示了GUVs制备过程的示意图。同时观察到mOrange-Nano在GUVs上的招募现象。结果显示，置于避光环境中的GUVs不表现出mOrange荧光信号（图4A）。当GUVs被蓝光整体照射时，可观察到mOrange荧光信号，并与GUV膜染料（DiD）共定位。当停止光照后，该相互作用迅速逆转。对GUV膜上mOrange荧光强度随时间变化的定量分析表明，蛋白质的招募快速且高效，同时具有完全的可逆性（图4B）。
图 1：用 b-disiLID 功能化的 SLB 的荧光显微镜图像。 在 ROI 区域局部蓝光（488 nm）照射前（A）和照射期间（B）存在 mOrange-Nano 时的荧光图像。比例尺 = 20 µm。（C）在用 b-disiLID 功能化的 SLB 上，于 ROI 区域测得的 mOrange 荧光强度（t = 200 s）。该图改编自 Di Iorio 等人8。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：在修饰有b-disiLID的SLB上，mOrange在ROI区域经历三个招募周期的荧光强度变化。 每次光激活后，ROI区域内的mOrange-Nano荧光均增强。荧光信号在120秒内达到饱和，并在随后的120秒内几乎降至背景水平。在多个蓝光/黑暗循环中未观察到图案质量的下降。该图改编自Di Iorio 等人8。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：采用温和水化法制备大单层囊泡（GUVs）的示意图。 该示意图展示了多个制备步骤以及使用两张载玻片和一个间隔片构建的样品室结构。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：蓝光依赖性 mOrange-Nano 在 GUV 膜上的募集作用的荧光显微镜检测结果。（A）在 mOrange-Nano 存在下，功能化修饰了 disiLID 的 GUV 的荧光图像。绿色显示 GUV 的膜染料信号，红色显示在蓝光照射前、照射期间及照射后的 mOrange 荧光信号。比例尺 = 10 µm。（B）GUV 膜上 mOrange 荧光强度随时间的变化。光照开始后，脂质膜上的 mOrange 荧光信号（红色曲线）在 60 秒内达到最大强度，荧光强度增加 5.9 倍；停止光照后，mOrange 荧光在 60 秒内下降至接近光照前水平（恢复率达 90%）。该图改编自 Di Iorio 等人8。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
我们描述了一种利用光可切换蛋白disiLID8在模型膜（如支撑脂双层和巨大单层囊泡）上实现mOrange-Nano蛋白局部募集的方法。影响图案质量的因素包括蛋白质的质量以及支撑脂双层（SLBs）和巨大单层囊泡（GUVs）的制备质量。
为了在表达和纯化后确保良好的蛋白质质量，首先需要评估 disiLID 的光开关特性。为此，必须测定 FMN 辅因子在黑暗条件下以及蓝光照射后的吸收光谱。预期 disiLID 的紫外-可见吸收光谱在黑暗中会显示出 FMN 辅因子特征性的三重峰，该峰在蓝光照射后显著降低，并在避光条件下恢复13。这种光开关行为对于后续步骤中实现可重复且可逆的招募至关重要。在样品制备过程中使用保护性红光，并尽量减少 disiLID 暴露于外界光照，有助于提高实验的性能。
另一个关键步骤，或许也是最重要的一步，是形成完整的支撑脂双层膜（SLB）。膜中存在缺陷和/或形成不均一的SLB（例如出现多层结构或斑块状SLB）将影响蛋白质图案的质量。因此，对于缺乏经验的操作者，建议通过使用膜染料（如DiD和DiO）对小单层囊泡（SUVs）进行标记，从而制备荧光标记的SLB。通过这种方法，可利用荧光显微镜对SLB的性质和质量进行充分表征。荧光漂白恢复（FRAP）测量是评估SLB质量的典型方法，通过检测膜的流动性来判断其完整性。此外，对于生物素化的SLB（如本方案中所述），可使用荧光标记的链霉亲和素（SAv，例如., Atto 488-SAv 可用于可视化并评估支撑脂双层膜（SLBs）的质量。
实验方案的第一部分描述了在支持性脂双层（SLB）上形成图案的过程。为确保最佳结果，需将mOrange-Nano加入SLB中，并将样品在避光条件下孵育15分钟。在光激活过程中，对感兴趣区域（ROI）的选择不受特定尺寸限制。然而，必须调节激光强度和曝光时间，以减少荧光蛋白发生非预期的光漂白。
该方法不仅限于生物素标记的蛋白质，也可采用其他方法将disiLID锚定在支持性脂双层（SLB）上。例如，可表达带有His标签的disiLID，并将其锚定在含有Ni-NTA的SLB上。然而，关键是要用不同的标签分别标记Nano和disiLID，以避免蛋白质在SLB上的相互置换。该方法还允许颠倒蛋白质的顺序，从而先在SLB上功能化固定Nano，再通过蓝光照射招募disiLID（或与disiLID融合的蛋白质）。
为了实现对蛋白质定位的动态控制，需要能够反复地将蛋白质可逆地定位到选定区域。为实现这一目标，溶液中Nano的浓度（200 nM）是获得高可逆性的关键参数。
另一个问题是 Nano 被招募至 disiLID 功能化的 GUV 表面。与在 SLB 上进行蛋白质图案化的情况类似，该方法可扩展应用于不同的膜功能化策略。在本方案中，整个 GUV 被蓝光照射，以在 GUV 全表面招募 mOrange-Nano。然而，选择位于 GUV 膜上的小范围 ROI 应能实现蛋白质在更局限区域内的精确定位。
该方法的局限性仅在于用于成像纳米颗粒在SUV或GUV膜上募集所选用的荧光染料。特别是应避免使用激发光谱位于蓝光范围的荧光染料，因为这类染料的使用会干扰(dis)iLID的光激活。因此，建议在此类实验中选用激发光谱位于绿光或红光范围的荧光染料（例如mOrange或Cy5）。
disiLID 设计提供了一种简单且可适应的方法，用于增强蛋白质在膜上的局部募集，并拓宽了光遗传学中 iLID 和 Nano 的动态响应范围4。这些方法主要关注将 Nano 募集到模拟膜（如脂双层和 GUVs）上。然而，该策略可拓展至细胞中多种光遗传学工具，其中（dis）iLID 或 Nano 被连接至膜结构。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由欧洲研究理事会（ERC）启动基金ARTIST（#757593 S.V.W.）资助。DDI感谢亚历山大·冯·洪堡基金会提供的博士后奖学金。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| µ-载玻片 18 孔板 | Ibidi | 81817 | 用于支撑脂双层（SLB）的制备 |
| 25 µL 微量注射器 | Hamilton | 型号 702 N | 用于脂质混合物的配制以及将脂质溶液铺展在聚乙烯醇（PVA）层上 |
| 生物素帽PE（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(帽-生物素)）（钠盐） | Avanti Polar Lipids | 870273C | 用于小单层囊泡（SUVs）的制备 |
| CaCl2（氯化钙） | Sigma-Aldrich | C5670 | 用于支撑脂双层（SLB）的形成 |
| 盖玻片 24 mm × 60 mm | Engelbrecht | K12460 | 用于大单层囊泡（GUVs）的形成 |
| DiD（1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'- 四甲基吲哚二碳菁） | Thermo Fisher Scientific | D7757 | 膜染料 |
| disiLID | 序列：MGGSGLNDIFEAQKIEWHEGGSH HHHHHGSMAATELRGVVGPGPAA IAALGGGGAGPPVGGGGGRGDA GPGSGAASGTVVAAAAGGPGPG AGGVAAAGPPAPPTGGSGGSGA GGSGSAGEFLATTLERIEKNFVIT DPRLPDNPIIFASDSFLQLTEYSR EEILGRNCRFLQGPETDRATVRK IRDAIDNQTEVTVQLINYTKSGKK FWNVFHLQPMRDYKGDVQYFIG VQLDGTERLHGAAEREAVMLIKK TAFQIAEAANDENYF | ||
| DOPC（1,2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱） | Avanti Polar Lipids | 850375P | 用于小单层囊泡（SUVs）的脂质组成 |
| Eppendorf Protein LoBind 微量离心管 | Merk | EP0030108116-100EA | 用于收集新制备的大单层囊泡（GUVs） |
| mOrange-Nano | 序列：MRGSHHHHHHGSKIEEGKLVI WINGDKGYNGLAEVGKKFEKDT GIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATG DGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLA EITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYN GKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNP KTWEEIPALDKELKAKGKSALM FNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKY ENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTF LVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFN KGETAMTINGPWAWSNIDTSKVN YGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSA GINAASPNKELAKEFLENYLLTDE GLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELA KDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQM SAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEA LKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGI EGTTENLYFQGSVSKGEENNMAI IKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIE GEGEGRPYEGFQTAKLKVTKGG PLPFAWDILSPQFTYGSKAYVKH PADIPDYFKLSFPEGFKWERVMN FEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYK VKLRGTNFPSDGPVMQKKTMG WEASSERMYPEDGALKGEIKMR LKLKDGGHYTSEVKTTYKAKKPV QLPGAYIVGIKLDITSHNEDYTIVE QYERAEGRHSTGGMDELYKGG SGTSSPKRPKLLREYYDWLVDN SFTPYLVVDATYLGVNVPVEYVK DGQIVLNLSASATGNLQLTNDFIQ FNARFKGVSRELYIPMGAALAIYA RENGDGVMFEPEEIYDELNIG | ||
| NaCl（氯化钠） | Sigma-Aldrich | S9888 | 用于缓冲液配制 |
| NaOH（氢氧化钠） | Sigma-Aldrich | 1064980500 | 用于支撑脂双层（SLB）形成过程中的表面活化 |
| POPC（1-棕榈酰基-2- 油酰基磷脂酰胆碱） | Avanti Polar Lipids | 850457C | 用于大单层囊泡（GUVs）的脂质组成 |
| PVA（聚乙烯醇）完全水解 | Sigma-Aldrich | 8148940101 | 用于大单层囊泡（GUVs）的形成 |
| SP8 共聚焦激光扫描显微镜 | Leica | ||
| 链霉亲和素 | TermoFisher | 434301 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | 84097 | 用于大单层囊泡（GUVs）的形成 |
| Tris 盐酸盐 | Sigma-Aldrich | 10812846001 | 用于缓冲液配制 |
参考文献
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