本文介绍了一种基于悬浮培养HEK293细胞的腺相关病毒（AAV）生产方案，该方法利用商业供应商提供的可用于研究目的的组分，减少了病毒载体生产所需的时间和劳动投入。
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本文内容
摘要
摘要
腺相关病毒载体（AAVs）是研究中枢神经系统（CNS）的有力工具。新型衣壳如 AAV.PHP.eB 可通过尾静脉注射在小鼠中实现 CNS 的广泛转导。为达到相当的转导效率，需使用至少 1 x 1011 基因拷贝数/小鼠）相比，直接注射到中枢神经系统实质中所需的剂量更低。在我们课题组中，AAV的制备（包括AAV.PHP.eB）依赖于贴壁培养的HEK293T细胞和三质粒共转染法。采用贴壁细胞获得高产量AAV的过程需要大量人力和材料投入。这一限制促使我们开发了一种基于锥形管的悬浮细胞培养方案。我们将贴壁细胞生产的AAV与悬浮培养法生产的AAV进行了比较，并对比了使用聚乙烯亚胺（Polyethylenimine）或TransIt转染试剂进行悬浮培养的效果。AAV载体通过碘克沙醇梯度超速离心法纯化，随后使用离心过滤装置进行缓冲液置换和浓缩。采用贴壁培养方法，我们平均获得了2.6 × 1012 总基因组拷贝数（GC），而悬浮法和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine）获得的结果为7.7 × 1012 GC 总量，而 TransIt 产生了 2.4 × 1013 GC 总量。两者之间没有差异 体内 与贴壁细胞系统相比，悬浮细胞系统生产的载体的转导效率。综上所述，本文介绍了一种基于悬浮培养HEK293细胞的AAV生产方案，该方案可显著减少载体生产所需的时间和劳动投入，同时使用商业供应商提供的用于科研目的的组分，可获得高出3至9倍的产量。
引言
腺相关病毒（AAV）于1965年被发现，此后已广泛应用于多种研究领域1。在神经科学研究中，AAV被用于研究基因和神经元功能、绘制神经环路图谱，或构建疾病动物模型2。传统上，这些应用通常通过直接注射到目标部位实现，因为大多数天然血清型无法穿过血脑屏障，或需要高剂量才能穿透1,2,3。
随着AAV.PHP.B4以及下一代衣壳（如AAV.PHP.eB5和AAV.CAP-B106）的发现，现已可通过简单的全身性注射靶向中枢神经系统（CNS）。空间定位图谱揭示了AAV.PHP.eB在细胞水平上所靶向的细胞类型6,7。结合特定的启动子/增强子，这些衣壳为神经科学家提供了广泛的研究机会，使其能够通过无创的AAV递送方式研究基因与脑功能4,8。
与AAV9（通常为4 × 1012基因组拷贝（GC）/小鼠）相比，AAV.PHP.eB所需的剂量较低（通常为1至5 × 1011基因组拷贝（GC）/小鼠）7，但相较于直接注射策略（通常为1 × 109 GC/µL注射），仍需制备更多的病毒载体。大多数天然血清型可通过经典的贴壁细胞培养系统结合碘克沙醇纯化方法进行生产9,10,11,12。然而，对于AAV.PHP.eB而言，该方法需要耗费大量人力进行细胞培养与转染，才能获得一次实验所需的足够载体量8。因此，开发了在锥形管中进行悬浮细胞培养以生产AAV的方法。容量可达300 mL的锥形管结构紧凑，可节省培养箱空间和塑料耗材。与在15 cm培养皿上的贴壁细胞相比，悬浮细胞更易于大规模培养和操作。本方案中的转染组分保持不变，因此先前用于贴壁细胞系统的质粒可直接用于基于悬浮细胞的本方案。该方案已成功转移至实验室其他研究人员，并已成功应用于多种衣壳和载体构建体的制备。
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方案
所有实验操作均经荷兰皇家科学院（KNAW）机构动物护理与使用委员会批准，并符合项目编号 AVD8010020199126 下的荷兰动物实验法。在图1中，提供了完整实验流程的示意图。从细胞接种到腺相关病毒（AAV）纯化，该流程共需6天完成。
1. 试剂准备
- 质粒纯化
- 按照生产商说明进行质粒提取，并进行若干调整以确保质粒的无菌性。
- 使用无菌蒸馏水和纯乙醇配制70%乙醇。
- 在异丙醇离心步骤后，将质粒置于超净台中干燥，向离心管中加入无菌70%乙醇。乙醇沉淀后，再次在超净台中干燥质粒，并用无菌蒸馏水重悬质粒。注意使用无菌的微量离心管。
- 取部分样品用于定量、限制性酶切分析，以及必要时进行测序。建议检查反向末端重复序列（ITRs）的完整性，因为突变可能对产量产生负面影响。将样品浓度调整至1 µg/µL。
- 10倍Tween裂解缓冲液的配制
- 将30.3 g Tris缓冲液和2.033 g MgCl2·6H2O溶解于400 mL无菌蒸馏水中，调节pH至8.0，并加水定容至450 mL。
- 保持Tween 20无菌状态，在超净台中向缓冲液中加入50 mL Tween 20，并使用0.2 µm真空滤器过滤除菌。
- 碘克沙醇稀释液的配制
- 碘克沙醇溶液的初始浓度为60%。使用该原液配制15%、25%和40%的溶液。
- 配制15%溶液：将60 mL 60%碘克沙醇溶液与48 mL 5 M NaCl和48 mL PBS-MK（含5 mM MgCl2和12.5 mM KCl的5倍PBS）混合，再用蒸馏水定容至240 mL。
- 配制25%溶液：将67 mL 60%碘克沙醇溶液与32 mL PBS-MK混合，用蒸馏水定容至160 mL，充分混匀后加入1.6 mL酚红溶液。
- 配制40%溶液：将160 mL 60%碘克沙醇溶液与48 mL PBS-MK混合，用蒸馏水定容至240 mL。配制60%溶液时，向100 mL 60%碘克沙醇溶液中加入1 mL酚红溶液。
- 含5%蔗糖的PBS溶液
- 将25 g蔗糖加入500 mL不含钙和镁的DPBS瓶中，充分振荡溶解，使用0.2 µm瓶式真空滤器过滤除菌。
- 聚乙二醇（PEG）8000溶液
- 将400 g PEG 8000和24 g NaCl溶于无菌蒸馏水中，定容至1000 mL。加热搅拌至完全溶解，用pH试纸调节pH至7.4。
- 使用0.2 µm瓶式真空滤器过滤除菌，得到40% PEG 8000溶液。注意由于溶液黏度较高，过滤过程耗时较长，过滤后储存于4 ˚C。
2. HEK293 悬浮细胞的培养
- 使用浸有70%乙醇的擦拭布进行清洁。清洁生物安全柜，并准备和清洁细胞培养所需的所有材料。
- 将30 mL悬浮细胞培养基预热至37℃ °C，置于50 mL锥形培养管中。从液氮中取出病毒生产细胞，迅速在37 °C 水浴中。在冻存管即将完全解冻前，用浸有70%乙醇的擦拭纸清洁管体，并将冻存管转移至生物安全柜中。
注意：此处所用病毒生产细胞的详细信息见于 材料表. - 迅速将细胞转移至预热的50 mL锥形培养管中。在37℃摇床培养箱中培养细胞。 °C，80% 湿度，8% CO₂2, 200 转/分钟（RPM），振荡直径为 50 毫米。当细胞活力高于 90% 且细胞密度高于 1–3 × 10⁶ 个细胞/毫升时进行传代。6 细胞/毫升
注意：所使用的摇床振幅为50 mm；若振幅不同，应相应调整培养条件。 - 在解冻后3-4天传代细胞。检查培养管是否有污染迹象；例如，真菌污染会呈现有色（黑色或绿色）环状物。
- 准备 400 µ每份样品使用1 mL移液条加入0.4%台盼蓝溶液。
- 快速从培养箱中取出悬浮细胞。立即吸取500 µ用1 mL移液器从管中吸出L。轻轻吹打混匀。
- 加入100 µ将细胞悬液1 L加入预先准备好的台盼蓝管中。轻轻颠倒混匀，切勿使用移液器吹打混匀，以免导致细胞死亡。将细胞放回培养箱继续培养。
- 取 50 µ取10 μL经台盼蓝处理的细胞悬液，加入血细胞计数板。计数总活细胞数，并计算次日传代或转染所需的细胞悬液和培养基体积。
- 将培养基在培养箱中预热10–15分钟。将细胞悬液加入预热的培养基中，然后放回培养箱。若计划连续传代培养3天（即周一至周四），接种密度设为0.5 × 10⁶ cells/mL。6 细胞/mL；若需传代培养4天（即周四至周一），设定为0.3 × 106 细胞/毫升
注意：根据制造商说明，病毒生产细胞每26小时倍增一次，细胞密度应维持在3.5 × 106 和 5.5 x 106 传代前。细胞最多可传代至第20代。
3. 转染
- 第1天
- 转染前24 h，将1 × 106 每毫升培养基中3×10⁸个细胞，在300 mL培养基中。
- 第2天
- 将培养基、质粒和转染试剂 warming 至室温。具体配制用量参见 表 1.
- 轻轻涡旋质粒和试剂。将质粒加入已准备好的培养基中，涡旋混匀。加入转染试剂，短暂涡旋。此后步骤中不得震荡混合物。室温孵育30分钟。
- 同时，对第1天制备的细胞进行计数。细胞数量应在2至2.5 × 106 每毫升细胞数 > 95% 存活率。
- 孵育后，将转染混合物逐滴加入细胞中，同时轻轻摇动管子。孵育72-96小时。
4. 收获细胞
- 第5天
- 加入33 mL 10倍浓缩的细胞裂解缓冲液（500 mM Tris pH 8，10% Tween 20，20 mM MgCl2），轻轻振荡混匀，于37 °C振荡孵育1.5小时。
- 在4 °C下以3428 × g离心60分钟。使用0.45 µm PES真空滤器过滤以澄清细胞裂解液，使澄清后的裂解液保留在滤器容器中。
注意：过滤后可选步骤：取50 µL样品用于定量PCR（Q-PCR）。 - 向360 mL过滤后的细胞裂解液中加入90 mL 40% PEG 8000溶液。
- 用70%乙醇清洗搅拌子后加入样品中，在冰上或冷室中以300 RPM搅拌1小时。随后在4 °C静置过夜。
注意：已测试1至72小时的孵育时间。过长的孵育时间会对总蛋白沉淀产生不利影响。
5. 碘克沙醇纯化
- 第6天
- 将全部经 PEG 沉淀的培养物体积样品转移至一个洁净的大锥形管中，在 2820 × g 以及 4°15 分钟，4 °C
- 弃去上清液，将聚乙二醇沉淀物重悬于15 mL含钙和镁的DPBS中。沉淀物难以重悬，需耐心仔细操作。
- 将重悬的部分转移至一个洁净的50 mL离心管中。聚乙二醇（PEG）将残留在生物反应器管的管壁上。再加入额外的10 mL溶液，注意收集所有PEG沉淀物。将全部液体转移至一个50 mL容器中，总体积为25–30 mL。
- 加入40 µDNaseI（10 U/μL）µL）。置于培养箱中孵育 1 小时 37 分钟°C.
注意：DNase 孵育后可选步骤：取 50 µQ-PCR 用样品的升数。 - 使用氯化物溶液清洗用于聚乙二醇沉淀的搅拌子，随后用70%乙醇冲洗。将搅拌子保存在70%乙醇中，以备下次实验使用。
- 使用玻璃巴斯德吸管，将15.5 mL浓缩的细胞裂解液加入每个25 mm × 89 mm的聚烯烃管中。加入细胞裂解液后，更换为新的玻璃巴斯德吸管。
- 从15%到60%依次加入碘克沙醇溶液：将9 mL 15%碘克沙醇溶液轻轻注入细胞裂解液下方。随后加入5 mL 25%和40%碘克沙醇溶液，最后加入5 mL 60%碘克沙醇溶液。
- 使用含有钙镁的DPBS通过注射器加满离心管，以去除大部分气泡，注意不要扰动碘克沙醇层。使用电动封管机密封离心管。
- 在非摆动转子中离心，4°C 下 490,000 × g 离心 1 小时 10 分钟 g 16时 °在超速离心机中离心。从超速离心机中取出，将离心管装入金属夹具中，并准备好收集管。在生物安全柜中打开转子，以防离心过程中发生泄漏。
- 准备一个50 mL离心管（用于弃去转子管），一个15 mL离心管（用于收集病毒），一个5 mL注射器，以及每个梯度所需的30G和19G针头。
- 用30G针头在管盖顶部刺一个小孔，针头留在原位。在注射器上安装一个19G针头。
- 在40%/60%界面下方小心穿刺试管，该界面可通过酚红指示剂观察到。确保针头斜面朝向40%层。
- 用非惯用手从管子顶部取下30G针头。针头斜面朝上，缓慢吸取病毒/碘克沙醇溶液，目标吸取量为3 mL至4.5 mL。当吸至约一半并深入40%/清晰层时，将针头旋转至斜面朝下，继续吸取，以避免从蛋白层中收集样品。
- 用非惯用手握住50 mL离心管，小心拔出针头，同时将针头放入50 mL离心管中并丢弃。用DPBS将AAV/碘克沙醇悬浮液稀释5倍，定容至15 mL。
- 转移至离心过滤管中，在3428 × g, 4 °4 ℃ 下离心 10 分钟。弃去滤液；轻轻取出滤器支架，将底部容器中的液体倒入废液瓶。向滤液中加入 15 mL PBS-5% 蔗糖溶液，重悬。
- 3428 × g 离心 g 4 ℃时 ˚C 下孵育 20 分钟。至少重复缓冲液置换 3 次。储存病毒（约 150–250 µL）于 4 ℃ °C（PHP.B 变体最长 3 个月）或分装为 50 µL 等分试样，于 -80 保存 °长期保存于 C。
注意：PHP.B 衣壳变体对冻融敏感，因此应避免冻融。 - 按照先前方案中所述进行滴定10.
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结果
大多数学术实验室使用贴壁的HEK293T细胞进行AAV生产8,9。当需要少量AAV用于直接注射时，这种方法效果相对较好；但若使用AAV.PHP.eB等全身性衣壳实现相似的转导效率，则需要高100倍的滴度（至少1 × 1011 GC/小鼠）。
本方案建立了在锥形管中悬浮培养HEK293细胞生产腺相关病毒（AAV）的方法。小规模培养可在50 mL管中进行，大规模培养则使用600 mL管。针对特定摇床（见材料表），可使用一种支架，最多可同时培养16根大管。该支架需与专用于50 mL管的特殊插件配合使用（图2A）。该系统显著缩短了本方案中细胞培养和转染阶段的操作时间。初始生产实验采用表达荧光素酶和绿色荧光蛋白（GFP）的报告基因质粒进行10,11
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讨论
系统性给予 AAV 是一种强大的工具 将基因转移至中枢神经系统；然而，腺相关病毒（AAV）的生产过程成本高昂且费时费力。通过使用悬浮细胞，相较于在15 cm培养皿中贴壁培养HEK293T细胞，可减少人力投入和塑料耗材的使用。2 培养板。此外，本实验所采用的锥形管易于操作，并能最大限度地利用实验室空间。该方案由两名研究人员建立，随后被实验室其他人员推广应用。三位独立研究人员进行的一系列生产实验平均每次制备的病毒载体足以注射6至7只小鼠。
此前已有文献描述过HEK293悬浮细胞的使用13,14。然而，该文献中所述的悬浮细胞系并未对科研用途免费开放，这为学术研究人员应用所述方法带来了瓶颈。本实验方案中描述的悬浮细胞系可免费用于科研目的。悬浮细胞的培养采用锥形管而非锥形瓶，以节省空间和时间。使用锥形瓶最多可同时培养4个反应，而使用锥形管则可同时培养12个反应。锥形管可直接转移至离心机中进行收获。
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披露
Mirus 公司为初步测试提供了 TransIT 试剂的免费样品，后续实验所用试剂则为自行购买。作者没有其他需要申报的相互竞争的经济利益。
致谢
本工作由荷兰皇家艺术与科学学院（KNAW）研究基金和Start2Cure（0-TI-01）资助。我们感谢Leisha Kopp在本实验方案建立过程中提供的意见和建议。图示使用Biorender制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 39 mL，快速密封圆底聚丙烯管，25 x 89 mm - 50个/包 | Beckman Coulter | 342414 | |
| 600 mL 锥形管适配器，用于 S-4x1000 转子 | eppendorf | 5920701002 | |
| 适配板，适用于 16 个 600 mL 生物反应器 | Infors HT/ TPP | 587633 | |
| 防气溶胶盖，用于 750 mL 圆形桶 | eppendorf | 5820747005 | |
| 离心机 5920 R G，230 V，50-60 Hz，包含 S-4x1000 转子、圆形桶及 15 mL/50 mL 锥形管适配器 | eppendorf | 5948000315 | |
| 蒸馏水 | Gibco | 15230147 | |
| DNase I 重组，RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DNase I 重组，RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| 含钙、镁的 DPBS | Gibco | 14040091 | |
| 无钙、无镁的 DPBS | Gibco | 14190144 | |
| Fisherbrand 一次性 PES 滤器单元 0.2 µm | Fisher | FB12566504 | |
| Fisherbrand 一次性 PES 滤器单元 0.45 µm | Fisher | FB12566505 | |
| 50 mL 培养管支架，也适用于 Falcon 管 | Infors HT/ TPP | 31362 | |
| 600 mL 细胞培养管支架 | Infors HT/ TPP | 66129 | |
| 培养箱 Minitron 50 mm | Infors HT | 500043 | |
| LV-MAX 生产培养基 | Gibco | A3583401 | |
| N-Tray 通用型 | Infors HT/ TPP | 31321 | |
| OptiPrep - 碘克沙醇 | Serumwerk bernburg | 1893 | |
| PEI MAX - 转染级线性聚乙烯亚胺盐酸盐（分子量 40,000） | Poly-sciences | 24765-100 | |
| 酚红溶液 | Sigma-Aldrich | 72420100 | |
| 聚乙二醇 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| TransIT-VirusGEN | Mirus | Mir 6706 | |
| 台盼蓝溶液，0.4% | Gibco | 5250061 | |
| TubeSpin 生物反应器-50 mL | TTP | 87050 | |
| TubeSpin 生物反应器-600 mL | TTP | 87600 | |
| 病毒生产细胞 | Gibco | A35347 | |
| Vivaspin 20 超滤管，截留分子量 100,000 | Cytvia | 28932363 |
参考文献
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重印与许可
