离体加压淋巴管中绝对胞质游离 Ca2+ 浓度与相应收缩力的实时评估

摘要

本方案描述了一种同时测量细胞质游离钙离子浓度［Ca²⁺］的方法²⁺]_i 以及实时测量收缩性淋巴管的管径，随后计算绝对钙浓度²⁺ 浓度以及收缩力/节律性参数。该方案可用于研究 Ca²⁺ 在多种实验条件下收缩动力学的变化。

摘要

淋巴管系统现在常被称为"第三循环"，广泛分布于多种重要器官系统中。淋巴管系统主要的机械功能是将细胞外间隙的液体回输至中心静脉导管。淋巴液的运输依赖于淋巴管（LVs）自发的节律性收缩。LV的收缩主要受细胞质中游离钙离子浓度（[Ca²⁺]_i）周期性升降的调控。

本文介绍了一种在离体加压的淋巴管（LVs）中实时同步计算[Ca²⁺]_i绝对浓度变化和血管收缩性/节律性变化的方法。利用分离的大鼠肠系膜淋巴管，我们研究了药物添加后[Ca²⁺]_i和收缩性/节律性的变化。将离体淋巴管负载比率型Ca²⁺感应探针Fura-2AM，并结合视频显微镜与边缘检测软件，连续实时采集[Ca²⁺]_i 和管径的测量数据。

每个左心室（LV）的Fura-2AM信号均根据每条血管的最小和最大信号进行校准，并用于计算绝对[Ca²⁺]_i。利用直径测量值计算收缩参数（振幅、舒张末期直径、收缩末期直径、计算血流量）和节律性参数（频率、收缩时间、舒张时间），并与绝对[Ca²⁺]_i测量值进行关联分析。

引言

淋巴管系统存在于多种器官系统中，包括脑、心脏、肺、肾和肠系膜^1,2,3,4,5,6，其功能是将组织间隙液（淋巴液）推动至中心静脉导管，以维持体液稳态^7,8,9,10。该系统起始于血管毛细床内的盲端淋巴毛细管，随后汇入集合淋巴管（LVs）。集合淋巴管由两层细胞构成：内层为内皮细胞，外层为淋巴管肌细胞（LMCs）^10,11。淋巴液的运输依赖于外在力量（例如新淋巴液的形成、动脉搏动、中心静脉压波动）和内在力量共同作用¹²。

淋巴转运的内在驱动力是收集性淋巴管（LVs）的自发节律性收缩，这也是大多数研究淋巴功能的课题所关注的重点。这种内在的淋巴泵功能主要由细胞质内游离Ca²⁺浓度的周期性升降所调控。²⁺ ([Ca²⁺]_i）。LMC细胞质膜的自发去极化会激活电压门控 "L型" Ca²⁺ (Ca_v1.x) 通道引发 Ca²⁺ 流入及随后的左心室节律性收缩^8,9,10。这一作用通过阻断Ca_v1.x 与特定试剂（如硝苯地平）作用，可抑制左心室收缩并引起血管扩张^13,14. 胞内钙离子浓度[Ca²⁺]_i 或 "Ca²⁺ 刺突" 由 Ca 介导的 LMCs 中_v1.x 型通道也可能动员细胞内 Ca²⁺ 通过激活三磷酸肌醇（IP₃)受体和肌浆网（SR）上的兰尼碱受体（RyRs）^15,16,17,18. 目前的证据表明IP₃ 受体贡献更多的Ca²⁺ 与RyRs相比，对正常左心室收缩所必需^{15,16,19,20,21}；然而，在病理条件下或对药物干预的反应中，兰尼碱受体（RyRs）可能发挥一定作用^17,18。此外，Ca²⁺的激活²⁺激活的K⁺ 通道²² 和ATP敏感性钾（K_ATP通道^23,24 可使LMC膜超极化并抑制其自发性收缩活动。

在集合淋巴管（LVs）中，还有许多其他离子通道和蛋白质可能调控Ca²⁺动态。利用实时研究药理学试剂对Ca²⁺变化及血管收缩性的响应的方法，对于理解这些潜在的调控因子至关重要。先前已有研究描述了使用Fura-2测量LV内[Ca²⁺]_i相对变化的方法²⁵。由于Fura-2与Ca²⁺的解离常数已知²⁶，因此可以计算出Ca²⁺的实际浓度，这扩展了该方法的应用范围，并为Ca²⁺信号传导、膜兴奋性以及收缩机制提供了更深入的见解²⁷，同时也允许在不同实验组之间进行基线比较。后一种方法已在心肌细胞中应用²⁸，因此也可被适配用于LVs。本文介绍了一种改进的方法，结合上述两种方法，可在离体加压的LVs中连续、实时地测量并计算绝对[Ca²⁺]_i的变化以及血管收缩性/节律性。我们还提供了经尼卡地平处理后的LVs的代表性实验结果。

方案

购自商业供应商的9至13周龄雄性Sprague-Dawley大鼠。到达后，所有大鼠均饲养并维持于阿肯色大学医学科学分校（UAMS）实验动物医学部（DLAM）设施中，给予标准实验室饮食，并置于25 ^oC、12小时光照:12小时黑暗循环条件下。所有操作均依照UAMS机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的动物使用方案#4127进行。

1. 肠系膜淋巴管的解剖与插管

注意：在分离肠系膜淋巴管之前，必须先设置好灌流室，以确保灌流过程中无中断或泄漏，避免影响实验的进行。

1. 灌流浴槽准备
   1. 从商业供应商处购买硼硅酸盐玻璃微管（外径 1.2 mm，内径 0.68 mm，拉制后尖端外径为 75–100 µm）。将微管（又称套管）切割并抛光至约 1–2 cm 长度，以便安装到离体血管灌流室中。
   2. 使用聚乙烯管将血管灌流室中每个安装好的玻璃套管分别连接到独立的压力传感器，该传感器与独立的重力驱动压力调节器串联。
      注意：根据研究设计的不同，可独立调节流入压和流出压。 图1 详细展示了该装置。
   3. 用生理盐溶液（PSS；119 mM NaCl；24 mM NaHCO₃；11 mM 葡萄糖；4.7 mM KCl；1.2 mM KH₂PO₄；1.6 mM CaCl₂；1.2 mM MgSO₄）填充灌流室（5 mL）、玻璃微移液管以及独立的重力驱动压力调节器，并连接聚乙烯管。₃；1.17 mM NaH₂PO₄；4.7 mM KCl；1.17 mM MgSO₄₄；5.5 mM C₆H₁₂O₆ （葡萄糖）；0.026 mM C₁₀H₁₆N₂O₈ （EDTA）；以及 1.6 mM CaCl₂）且无任何气泡。然后夹紧压力装置，使套管针不处于加压状态。
      注意：该溶液的 pH 值约为 7.5。通过使用 CO₂ 在灌流浴中维持 7.4 的 pH 值。₂ 气泡作用于PSS中的碳酸氢盐缓冲系统，具体操作如步骤1.3.7所述。此处使用EDTA以螯合过量的Ca²⁺ 离子
2. 结的制备
   1. 在显微镜下使用编织丝线缝合线（8-0 规格）打双重外科结。关键步骤如图所示 图2.
      1. 分离单根细丝。
      2. 使用两把Dumont #5镊子，其尖端为微钝型；用其中一把镊子在另一把镊子的尖端绕成双环。
      3. 用环形镊子夹住缝线的游离端，将其穿过两个线环，注意不要将结完全拉紧，需留出一个小开口。
      4. 使用Vanna弹簧剪从两侧剪除多余的缝线。稍后利用这些线结将左心室固定在插管上。
         注意：请勿使用同一把镊子进行解剖或插管操作，因为在打结过程中更容易损坏镊子尖端。
3. 肠系膜淋巴管的分离与插管
   1. 使用5%异氟烷（1.5 L/min氧气）对动物进行深度麻醉₂ 过量麻醉后断头放血处死。
   2. 沿腹壁中线做纵行切口，暴露肠系膜，然后在幽门括约肌下方以及盲肠上方约2-3 cm处剪断连接，并剪断与直肠的连接，以分离完整的肠系膜，用于后续肠系膜淋巴管的解剖。
   3. 将解剖得到的完整肠系膜用200 mL冰冻的PSS洗涤，然后转移至含冰冻PSS的硅胶衬里（8-10 mm）培养皿（100 mm）中，并固定。
   4. 在体视显微镜下，使用解剖用Dumont #5 Inox精细镊子和Vanna弹簧剪，将二級腸系膜淋巴管從周圍脂肪和結締組織中分離。為便於在淋巴管從組織中取出後識別其兩端，可在淋巴管近端保留一小塊脂肪。
   5. 将解剖出的左心室转移至血管灌流室，套在玻璃插管上进行插管。
   6. 使用两把预先磨尖的Dumont #5 Inox精细镊子（直头，0.05 × 0.01 mm），将淋巴管远端连接至P1插管（流入端），近端连接至P2插管（流出端），以模拟淋巴液流动方向。
      注意：P1 和 P2 套管相同，仅在连接左心室（LV）的末端位置上不同。使用镊尖完全贴合且无损伤的镊子至关重要，以便于夹住纤细的血管壁。
      1. 将一个预先打好的结滑至每根玻璃套管上，以便后续将血管固定在套管上。
      2. 利用一小块脂肪组织帮助确定左心室方向，首先将远端套入P1。
      3. 将结滑至套管末端并收紧以固定左心室，注意不要过度拧紧而折断套管尖端。
      4. 在灌注室内将左心室压力加压至4-5 mm Hg。
         注意：在本实验中，我们将P1和P2压力设定为相等；然而，根据具体实验条件，可分别调节每根套管的压力，以诱导剪切应力或回流。
      5. 重复步骤 1.3.6.1–1.3.6.4，将左心室近端插管至 P2。
   7. 将通有7%二氧化碳（CO₂）的鼓泡石放入₂)/93% 氧气（O₂）₂在浴槽中维持生理 pH。
   8. 将腔室连接至温度调节器，并将其设定为37 ^oC，使LVs达到平衡并产生稳定、自发的收缩（约30分钟）。
      注意： 图1 详细展示了该装置。

2. 左心室中[Ca²⁺]_i绝对浓度的测定

1. 离体灌注淋巴管的Fura-2AM染色
   1. 在自发性收缩出现后（来自步骤1.3.8），于避光条件下，将左心室组织（LVs）与Fura-2-乙酰甲酯（Fura-2AM；2 µM 或 10 µL/5 mL）及普鲁尼克酸（PA；0.02% W/V 或 5 µL/5 mL 的20% PA）共同孵育30分钟。
      注意：加入Fura-2AM后，所有后续步骤均须在避光条件下进行。
   2. 30分钟后，使用负压真空完全吸出灌流室中的溶液，并用温度匹配的（37℃）新溶液替换，重复此过程3次。 ^oC) 无试剂PSS。
      注意：此操作应迅速完成，以尽量减少左心室暴露在空气中的时间。建议双手操作，例如，右手操作真空装置，左手更换新的无试剂PSS。
   3. 洗涤后，将LVs在避光条件下孵育15分钟，以去除过量指示剂并完成去酯化。
2. 捕捉 Ca²⁺ 荧光与血管直径
   1. 将培养室转移至倒置荧光显微镜载物台上，显微镜配备LED光源、20倍S Fluor物镜、细胞定位适配器和高速CMOS视频摄像系统，可实现每秒15帧的逐帧荧光图像采集。
      注意：此工作流程设置的示意图如下所示 图3钙²⁺ 可使用帧速率为每秒15帧或更高的CCD相机捕获信号。
   2. 将显微镜连接至配备成像软件的计算机，以记录荧光信号和边缘检测。
      注意：所提及的软件还支持同步压力记录；但本文未包含该操作。
   3. 打开LED光源和荧光系统接口。
      注意：此处描述的软件操作说明适用于所引用的软件，但也可使用其他软件获取该数据。
   4. 开放软件（IonWizard）。
   5. 下 文件 标签，选择 新.
   6. 下 收集 标签，选择 实验.
   7. 加载所需的实验模板并点击 好的.
      注意：您需要设置一个包含待测参数的实验模板。有关模板设置的说明，请参见软件手册。²⁹.
   8. 调整屏幕上的轨迹以观察 血管直径，分子 (340 信号)， 分母 （380 信号），以及 比率 按降序排列。
   9. 根据需要调整 y 轴刻度，以帮助观察曲线轨迹。
      1. 下 轨迹，选择 编辑用户限制确保取消勾选“自动限制”。
      2. 选择您希望调整的参数，输入坐标轴的最小值和最大值，然后选择 好的.
   10. 开始实验，请点击 开始 （位于屏幕底部）。
   11. 为了同时测量左心室（LV）直径，使用成像系统内置的边缘检测软件，该软件可生成在3 Hz条件下的左心室收缩轨迹。利用这些测量值分析第3节所述及图示的收缩性和节律性参数 图4.
       1. 务必调整光照，使左心室壁呈现为暗线。
       2. 选择一个无脂肪和碎片的感兴趣区域（ROI）。实验开始后，不要移动该ROI。
       3. 确保设定的阈值能够在整个收缩周期中持续检测到血管壁边缘。
   12. 进行荧光测量时，打开光电倍增管（PMT）。
   13. 使用LED照明器，以50 ms曝光交替采用340 nm和380 nm波长激发Fura-2这一比率型指示剂，并在整个成像视野中以15 Hz频率采集510 nm处的发射光谱。
       注意：为了获得可重复的 Ca²⁺ 测量。
   14. 通过以下步骤测量信噪比：首先，将左心室（LV）置于视野中央，获取340和380的荧光信号（信号值）；随后，使用载物台操纵器将视野移至灌流槽边缘无血管的区域（注意避开硅胶衬边，或清除槽内任何碎片），采集背景信号。
       注意：每次进行 Ca 检测时，必须返回血管的原始节段进行定位²⁺ 测量。
   15. 用温度匹配的无试剂PSS更换灌流液，以去除浴液中过量的指示剂。可能需要多次更换灌流液才能完全清除过量的Fura-2，因此请重复此步骤，直至信号与背景的比值达到约10:1。
   16. 记录基础Fura-2荧光信号及自发性收缩约30分钟，随后给予尼卡地平（NIF；0.1–100 nM）累积浓度反应，该药物为电压依赖性Ca²⁺通道阻滞剂_v1.x 拮抗剂。获取每种药物浓度的背景测量值。
   17. 每次实验结束时，用温度匹配的 Ca 溶液冲洗 LV²⁺-游离PSS以获得最低的Fura-2荧光信号（R_分钟) 以及在无 Ca 条件下 LV 的最大直径²⁺务必测量背景值。
       注意：Ca²⁺无钙PSS的成分与PSS相同，但不含CaCl₂₂，EDTA 被替换为 1 mM EGTA（C₁₄H₂₄N₂O₁₀)（pH ~7.5）。
   18. 更换灌流液为温度匹配的含 10 mM Ca 的 PSS²⁺ 和离子霉素（10 µM IONO），一种Ca²⁺ 离子载体，以获得最大Fura-2荧光信号（R_最大值) 和在钙饱和条件下LV的最小直径²⁺务必测量背景值。
3. 测量绝对[Ca²⁺]_i​
   1. 使用 R_分钟 和 R_最大值 校准340 nm与380 nm波长的比值，并计算胞质游离Ca²⁺的绝对浓度²⁺ 浓度（[Ca²⁺]_i).
   2. 计算细胞质游离Ca²⁺的绝对浓度²⁺ 浓度（[Ca²⁺]_i）使用公式（1)²⁶:
           (1)
      其中 K_d = 225 nM（Fura-2 的解离常数）²⁶，R = 340/380 比值，R_分钟 无 Ca 时的 340/380 比值²⁺，R_最大 = 饱和钙条件下的340/380比值²⁺ 条件，S_自由 无钙条件下380信号²⁺，S_结合的 = 380 信号与饱和 Ca²⁺ 条件
      注意：所有荧光信号均已校正背景荧光。
   3. 图5 是钙的一个示例²⁺ 记录所监测参数的轨迹。定义基线 Ca²⁺ 最低静息Ca²⁺ 在Ca之前²⁺ 尖峰和峰值钙²⁺ 作为最高的Ca²⁺ 在 Ca 期间实现²⁺ 峰电位。振幅是峰值与基线Ca之间的差值²⁺. 除Ca频率外，所有参数均直接从成像软件导出²⁺ 尖峰，需在离线状态下计算为Ca的数目²⁺ 峰/秒。以下是参考软件中获取这些参数的关键步骤。
      注意：整个轨迹可导出为 .txt 文件，所有参数均可在您选择的软件中进行分析或计算。
   4. 对于 R_分钟，突出显示分子轨迹中对应于Ca期间背景的部分²⁺无PSS。此时将打开一个对话框，提供该部分轨迹的数值。
   5. 下 操作步骤，选择 常数.
   6. 选择 钙-数值背景 并输入上一步中的分子和分母背景数值。点击 好的.
   7. 突出显示比率轨迹中对应于 Ca 期间最低比率的部分²⁺无PSS。这是R_分钟。同时记录此部分的分母值；此值为 S_自由.
   8. 重复步骤 2.3.4 至 2.3.7，针对 R 进行_最大 和 S_结合的 与高 Ca 对应的迹线区段²⁺ 游离PSS和最高比例
   9. 下 操作，选择 常数.
   10. 选择 钙-钙校准 并输入所列出的数值 公式 1. 点击 好的.
   11. 按照步骤2.2.8中所述调整其中一个屏幕上的波形，以便能够看清 钙-数值相减钙.
   12. 执行单调瞬态分析以获取其余参数，具体操作步骤详见软件手册。³⁰.
   13. 或者，以下情况 导出，选择 当前示踪.
   14. 选择要导出 .txt 文件的位置，然后单击 好的.
       注意：请确保单击要导出的单个轨迹。您可以导出整个轨迹或轨迹的选定部分。

3. 左心室收缩力和节律性的测量

1. 成像系统中集成的边缘检测软件会生成用于左心室直径测量的收缩轨迹，具体方法如上所述。利用这些测量数据来分析收缩性和节律性参数。 图4 是一条示例性收缩曲线，详细说明了需要记录的收缩参数。通过成像软件中的“单相瞬时分析”功能，直接从直径曲线上导出所有参数³⁰，但收缩频率、计算流量和间隔需离线计算。
   注意：整个轨迹可导出为 .txt 文件，所有参数均可使用以下公式在您选择的软件中进行分析或计算。
2. EDD、ESD、振幅、频率和计算的血流测量值
   1. 测量左心室在节律性自发收缩过程中所能达到的最大和最小直径（分别为舒张末期直径 [EDD] 和收缩末期直径 [ESD]）。
   2. 将收缩幅度（AMP）计算为EDD与ESD之间的差值。
   3. 以每次测量时间段（单位：s）内的收缩次数计算频率。
   4. 使用公式（计算每微米的计算流量2):
      计算血流量 = π/4(EDD²- 电外科设备²)F      (2)
      其中EDD² 静息状态下的血管横截面积，ESD² = 收缩期间血管横截面积的测量值，F = 收缩频率/秒
3. 节律性：收缩与舒张时间：
   1. 左心室节律性的其他测量指标包括收缩时间和舒张时间。
   2. 将收缩时间定义为左心室（LV）每次收缩达到收缩末期容积（ESD）所需的时间。
   3. 将舒张时间定义为左心室（LV）每次舒张达到舒张末期直径（EDD）所需的时间，该参数可整体反映与绝对[Ca²⁺]_i 在特定时间范围内。
   4. 根据公式（计算时间间隔（ΔT）3).
      Δt = t2 _(ESD2)- t1 _(ESD1) (3)

结果

左心室的收缩力及其对胞质游离钙的影响²⁺ ([Ca²⁺]_i) 在暴露于不同浓度的硝苯地平（NIF；0.1–100 nM）后，对分离的大鼠肠系膜淋巴管中的LVs进行了评估（图6）。参数包括 Ca²⁺ 峰电位幅度，基线 Ca²⁺，以及Ca峰值²⁺，随着向灌注室中逐步添加NIF，表现出浓度依赖性降低图7A）。同时，收缩参数（如收缩幅度和计算流量）也表现出逐步下降的趋势（图7B）。使用NIF后，EDD直径略有增加图7B钙²⁺ 峰电位频率和收缩频率呈现出“全或无”的反应。然而，这种效应在某一左心室（LV）于10 nM时即已出现，而所有左心室在100 nM时均已停止收缩。因此，合并的数据生成的曲线呈现出类似梯度浓度反应的特征。该结果与先前在其他制备方法（如钢丝法和压力肌动描记术）中使用NIF作用于左心室的研究报道一致。^13,14）。曼哈顿图展示了节律性指标（包括节律间隔、收缩时间和舒张时间）的各个LV响应情况。图7C）。这种数据呈现方式可帮助研究人员区分出此类全或无的反应或收缩节律的变异性，从而为潜在机制提供进一步的见解。最终，收缩幅度和频率的降低导致计算出的孤立淋巴管内流量减少，后者可作为淋巴管功能的替代性指标 体内 功能。总体而言，左心室收缩力的下降与[Ca²⁺]_i我们的研究结果提供了直接证据，表明在100 nM浓度范围内，NIF有效抑制了收缩及[Ca²⁺]_i 通过拮抗 Ca 抑制 LVs 中的振荡_v1.x通道存在于淋巴肌细胞（LMCs）中。

图1：离体血管腔装置示意图。 血管灌注实验采用配备温度调节器的离体血管腔装置。通过PSS储液罐利用重力控制压力。压力由连接在流入端（P1）和流出端（P2）套管上的压力传感器进行监测。缩写：PSS = 生理盐溶液。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：打结准备步骤概览。（A）在解剖显微镜下使用一根三股丝线缝合线制备双环，（B）抓住自由端并将其穿过两个环，（C）从两端拉紧结以保持一个小开口，以及（D）从两侧剪除多余的纤维，蓝色框内显示一个可直接使用的完整双单结。比例尺 = 1.5 mm。请点击此处查看此图的放大版本。

图3：数据采集实验流程示意图。 采用5%异氟烷麻醉一只健康大鼠后进行断头以清除躯干血液。行正中切口暴露并分离肠系膜。将分离的肠系膜置于冰冻的生理盐溶液（PSS）中铺展，剥离淋巴管（LV）周围脂肪组织后，在独立的血管灌流腔室中进行插管。将腔室置于倒置显微镜载物台上，使用20倍物镜。以340 nm和380 nm波长的光交替激发血管，利用CCD相机在510 nm处采集发射荧光光谱。连接显微镜的计算机通过荧光采集和边缘检测成像软件生成收缩和Ca²⁺变化轨迹。比例尺 = 1 mm。缩写：PSS = 生理盐溶液；LV = 淋巴管；CCD = 电荷耦合器件。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：代表性淋巴管（LV）收缩轨迹。（A）在生理盐溶液（PSS）中，用 Ca²⁺ 成像指示剂 Fura 2 AM 负载的灌注淋巴管（LV）直径变化的记录示例；（B）放大轨迹，显示与血管收缩性相关的所有参数：EDD、ESD、AMP 和频率。这些数值用于计算节律性和流量。缩略语：PSS = 生理盐溶液；LV = 淋巴管；EDD = 舒张末期直径；ESD = 收缩末期直径；AMP = 振幅。请点击此处查看此图的放大版本。

图5：左心室Ca²⁺成像的代表性轨迹。（A）在PSS中灌注并负载Fura-2的左心室绝对[Ca²⁺]_i变化的示例记录；（B）放大轨迹，以显示与[Ca²⁺]_i相关的所有参数（峰值、幅度和基线）（未进行背景校正）。缩写：PSS = 生理盐溶液。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：淋巴管收缩力与Ca²⁺成像概览。 代表性曲线显示了在生理盐溶液（PSS）基础状态、钙通道阻滞剂尼群地平（nifedipine，一种Ca_v1.x (Ca²⁺)通道拮抗剂）浓度反应条件下，（A）血管直径、（B）340/380比值以及（C）细胞内[Ca²⁺]_i的动态变化，包括R_min和R_max。缩写：PSS = 生理盐溶液；LV = 淋巴管；NIF = 尼群地平；R_min = 最小Fura-2荧光信号；R_max = 最大Fura-2荧光信号。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 7：尼卡地平阻断左心室中的 Ca²⁺ 振荡及其相应的收缩性。 （A）加入电压依赖性 Ca_v1.x (Ca²⁺) 通道拮抗剂尼卡地平后，Ca²⁺ 信号（n = 3）和（B）收缩参数（n = 3）呈浓度依赖性降低。（C）代表性曼哈顿图显示收缩间平均时间间隔（Δt）以及收缩和舒张时间。数据以均值 ± 标准误表示。缩写：PSS = 生理盐溶液；LV = 淋巴管；NIF = 尼卡地平；EDD = 舒张末期内径；AMP = 振幅。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

由于淋巴管（LVs）结构脆弱且尺寸微小，在解剖和插管过程中必须格外小心。即使对血管造成轻微损伤，也可能导致淋巴管无法存活，或引发细胞内钙离子浓度（[Ca²⁺]_i）瞬变的异常。在整个实验过程中，保持激发条件的一致性同样至关重要，以确保对照组与处理组之间[Ca²⁺]_i]测量结果具有可比性。若未能维持统一的设置，则存在显著高估或低估同一批次实验中不同血管[Ca²⁺]_i]水平的风险。同样，在每次实验过程中，准确识别并持续监测同一血管区域也极为重要。

使用比率型荧光探针 Fura-2AM 可校正因组织厚度不均、荧光探针分布/泄漏或光漂白等因素引起的荧光信号波动，这些问题在单波长染料应用中较为常见。³¹ 这使得本实验方案中所述的连续监测成为可能。然而，由于 Fura-2 通过螯合 Ca²⁺ 起作用，可能会导致淋巴管（LV）过载，从而减少可用于收缩或药物反应的胞内 [Ca²⁺]_i 浓度。在此类情况下，仍可观察到 Ca²⁺ 峰值信号，但节律性收缩可能消失。淋巴管长度的变化也可能导致这一现象。尽管这些 Ca²⁺ 测量结果可能仍然有效，但在重复实验中可能需要降低 Fura-2AM 的浓度，以成功同时获得 Ca²⁺ 和管径的测量数据。本研究的结果仅包含在基线状态下同时存在 Ca²⁺ 峰值信号和节律性收缩的淋巴管样本。

测量 R_分钟 和 R_最大 是计算绝对[Ca²⁺]_i。因为 R_分钟 应为无 Ca 时的 Fura-2 比值²⁺，已向 Ca 中添加了高浓度 EGTA²⁺-free PSS 以确保螯合任何残留的 Ca²⁺. 初始研究在 Ca 存在 EDTA 的情况下进行²⁺-无PSS，这导致血管出现零星收缩，并伴随相应的Ca²⁺ 尖峰。对于 R_最大值，高浓度的 Ca²⁺ 已将离子载体离子霉素（ionomycin）添加至PSS中，以最大程度提高[Ca²⁺]_i 信号。高 Ca²⁺ 溶液可能会析出沉淀，可能需要从PSS中去除EDTA。重要的是，这些额外的R测量_分钟 和 R_最大值 提供评估生理学相关[Ca²⁺]_i，可提供有关膜兴奋性和收缩性机制的信息²⁷ 以及允许与仅报告 Fura-2 的 340/380 比值的方案相比，在实验组之间进行基线比较。未能获得足够的 R_分钟 和 R_最大 数值排除了计算绝对[Ca²⁺]_i.

由于淋巴管（LVs）具有收缩特性，该方法只能测量整体Ca²⁺水平，而无法检测在去神经或麻痹血管中可观察到的局部Ca²⁺释放事件³²。然而，与使用麻痹血管或单个细胞的方法相比，该方法在将绝对[Ca²⁺]_i动态变化与收缩功能相关联方面具有优势^28,32。采用此方法时，通常假设所测得的Ca²⁺信号主要来源于淋巴管平滑肌细胞。但需注意的是，这些分离的LVs中也存在内皮细胞，可能对总体Ca²⁺信号有所贡献³³。该贡献可通过使用已去除内皮的LVs进行估算³⁴。此外，在LV收缩过程中，血管壁可能在收缩周期中轻微地进出焦平面，因此应使用较短的血管节段，并将其适度拉紧，但避免过度拉伸血管。

除了在集合淋巴管（LVs）中的应用外，该方法还可用于研究来自其他血管床的分离血管，包括小动脉和静脉，并在神经生物学及其他血管生物学分支中具有潜在应用前景。探索作用于不同信号转导通路的各种激动剂或拮抗剂的影响，是研究潜在Ca²⁺动态机制的另一途径。此外，该技术也可用于对来自相应动物的对照样本与处理样本进行比较研究。更重要的是，该方法可适应于细胞水平的研究，例如在分离的淋巴管平滑肌细胞中应用，仅需对灌流室和显微镜物镜进行 минималь的调整。总之，该方法提供了与集合淋巴管收缩性和节律性相关的全局Ca²⁺动态的生理学相关见解，并为评估可能调控集合淋巴管Ca²⁺动态的因素提供了可靠的手段。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
20x S 荧光物镜	美国奥林巴斯公司（宾夕法尼亚州森特瓦利，美国）	UPlanSApo
硼硅酸盐玻璃微移液管	Living Systems Instrumentation（美国佛蒙特州伯灵顿）	GCP-75-100
氯化钙（CaCl2）	Fisher Bioreagents（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）	BP510-500
二氧化碳（CO2）	nexAir（美国田纳西州孟菲斯）	UN3156
解剖镊	Fine Science Tools（美国加利福尼亚州福斯特城）	11254-20
EDTA（C10H16N2O8）	Fisher Bioreagents（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）	BP118-500
EGTA（C14H24N2O10）	Fisher Bioreagents（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）	O2783-100
Fura-2AM	Invitrogen（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）	F1221
葡萄糖（C6H12O6）	Fisher Bioreagents（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）	D16-500
重力供液式压力调节器	实验室自制
加热装置	Living Systems Instrumentation（美国佛蒙特州伯灵顿）	TC-09S
成像软件	IonOptix（美国马萨诸塞州韦斯特伍德）
倒置荧光显微镜	美国奥林巴斯公司（宾夕法尼亚州森特瓦利，美国）	IX73
Ionomycin	Invitrogen（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）	I24222
IonOptix 细胞固定适配器	IonOptix（美国马萨诸塞州韦斯特伍德）	665 DXR
异氟烷	Piramal Critical Care（特伦甘纳，印度）	NDC 66794-017-10
离体血管灌流室	Living Systems Instrumentation（美国佛蒙特州伯灵顿）	CH-1
打结钳	Fine Science Tools（美国加利福尼亚州福斯特市）	11253-20
LED光源	美国奥林巴斯公司（宾夕法尼亚州森特瓦利，美国）	TL4
硫酸镁（MgSO4）	Acros Organics（美国新泽西州）	213115000
MyoCam-S3 快速 CMOS 视频系统	IonOptix（美国马萨诸塞州韦斯特伍德）	MCS300
硝苯地平	Sigma（美国密苏里州圣路易斯）	N7634
眼科缝线
氧气（O₂）	nexAir（美国田纳西州孟菲斯）	UN1072
泊洛沙姆酸	Sigma（美国密苏里州圣路易斯）	P2443
氯化钾（KCl）	Fisher Bioreagents（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）	BP366-500
压力监测系统	Living Systems Instrumentation（美国佛蒙特州伯灵顿）	PM-4
压力传感器	Living Systems Instrumentation（美国佛蒙特州伯灵顿）	PT-F
硅胶衬里培养皿	实验室自制
碳酸氢钠（NaHCO₃）	Fisher Bioreagents（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）	BP328-500
氯化钠（NaCl）	Fisher Bioreagents（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）	BP358-212
磷酸二氢钠（NaH2PO4）	Fisher Bioreagents（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）	BP329-500
Sprague-Dawley 大鼠	Envigo RMS（印第安纳波利斯，印第安纳州，美国）	雄性	9-13 周龄
体视显微镜	徕卡显微系统公司（德国韦茨拉尔）	S9D
万纳斯弹簧剪	Fine Science Tools（美国加利福尼亚州福斯特城）	15000-03