本方案详细阐述了预先包埋免疫电镜技术的各个步骤，重点在于研究视网膜中的突触环路和蛋白质定位。
本文内容
摘要
摘要
视网膜由多种细胞构成，形成多样化的神经元回路，这些回路构成了视觉通路的第一阶段。每种回路都具有独特的特征和不同的神经递质，从而决定其功能角色和生理意义。由于视网膜结构中包含复杂的细胞类型，其神经元回路的复杂性为研究带来了挑战。为了更深入地研究视网膜回路及其相互作用（例如视锥细胞通路与视杆细胞通路之间的联系），以及分子的精确定位（如神经递质或神经肽），例如在小鼠视网膜中检测P物质样免疫反应性的存在，我们采用了预包埋免疫电镜（immuno-EM）技术来探索突触连接与组织结构。该方法使我们能够精确定位特定的细胞间突触连接和分子分布位置，从而在探索其功能机制方面发挥指导作用。本文详细描述了实验方案、所用试剂及具体操作步骤，包括（1）视网膜固定制备，（2）预包埋免疫染色，以及（3）后固定与包埋。
引言
视网膜中神经元回路的复杂性为研究带来了挑战，这源于其结构内存在多种多样的细胞类型1,2。首要步骤是确定不同细胞之间的突触连接，并明确特定神经递质或神经肽的细胞定位。随着分子生物学的发展引入了新的蛋白质，精确确定这些蛋白在视网膜中的定位对于理解其功能、分析视网膜回路及突触连接变得至关重要3,4,5。
由于光学显微镜的分辨率有限，电子显微镜（EM）常用于检测神经细胞的亚细胞结构。EM 有多种分类，其中常规透射电子显微镜（TEM）用于观察细胞超微结构6,7,8,9。免疫电子显微镜（immuno-EM）结合了电子显微镜的空间分辨率和抗体特异性结合蛋白质的化学识别能力10，是研究视网膜中突触连接和亚细胞蛋白定位的最优且唯一方法11,12。
免疫电镜技术可根据包埋与抗体孵育的顺序分为包埋前和包埋后方法。与包埋后方法相比，包埋前方法能够实现大范围和长距离的鉴定13,14,15，是研究轴突和树突等细胞过程的理想方法。此外，该技术具有信号强、视野广的优点，有利于对细胞质中蛋白质表达和分子定位进行系统性研究。该方法在确保化学标记结构在整个细胞质、细胞或视网膜中均可见方面尤为有价值。
然而，与包埋前免疫电镜法相比，包埋后免疫电镜法的渗透或扩散能力较低，灵敏度也相对较低16,17。简而言之，如果目标是研究特定神经递质在细胞质或突触终末中的定位，应优先选用包埋前免疫电镜法；相反，若要鉴定膜受体的定位，则更推荐使用包埋后免疫胶体金电镜法。
鉴于上述考虑，我们选择采用包埋前免疫电镜技术深入研究视网膜环路，包括视锥与视杆通路之间的相互作用，以及分子定位，例如P物质样免疫反应性（SP-IR）在小鼠视网膜中的分布及其突触组织结构。
方案
动物的护理和操作均经温州医科大学伦理委员会根据ARVO指南批准。本研究使用成年小鼠（C57BL/6J，雄性和雌性，8至12周龄）。实验所需的仪器和试剂列于材料表中。
1. 视网膜固定的准备工作
- 准备以下材料和工具：解剖显微镜、两把尖端极细的镊子、剪刀、1 mL 注射器针头（针头规格：G26）以及滤纸。
- 通过腹腔注射2,2,2-三溴乙醇（剂量为每克体重0.25 mg）对小鼠进行深度麻醉。随后，将小鼠断头并切开头部16。
- 使用弯头剪刀摘除眼球，并将其置于含有4%多聚甲醛-0.2%苦味酸的0.1 M磷酸盐缓冲液（PB；pH 7.4）的玻璃培养皿中。
- 在解剖显微镜下，用1 mL注射器针头在角膜缘处打孔，然后沿孔处用剪刀剪除眼前段。接着，用镊子将晶状体从视网膜内表面移除。
- 使用两把镊子小心剥离巩膜，直至视网膜完全从眼杯中分离（即与脉络膜完全分离的杯状视网膜组织）。随后，将视网膜切成四块。
- 将这些组织片段在0.1 M PB（pH 7.4）中的4%多聚甲醛-0.2%苦味酸溶液中室温（RT）固定2小时，然后于4 °C条件下在0.1 M PB（pH 10.4）中的4%多聚甲醛溶液中过夜转移固定。
2. 包埋前免疫染色
- 用 0.01 M PBS（pH 7.4）洗涤视网膜组织，每次 10 分钟，共洗涤 6 次，随后将组织在含 1% 硼氢化钠（NaBH4）的 0.01 M PBS（pH 7.4）中孵育 30 分钟。
- 用 0.01 M PBS（pH 7.4）至少洗涤视网膜切片 6 次。同时，用滤纸去除玻璃体，然后使用双刃剃须刀片将视网膜切成 100–300 µm 的小片。
- 在室温下用含 5% 正常山羊血清（NGS）的 0.1 M PB（pH 7.4）封闭 1 小时后，将视网膜切片置于含一抗（兔抗 PKCα 抗体，1:80；兔抗 SP 抗体，1:100）和 2% NGS 的 0.01 M PBS（pH 7.4）中，在摇床上室温孵育 2 小时，随后在 4 °C 摇床上继续孵育 96 小时（5 天）。
- 用 0.01 M PBS（pH 7.4）洗涤 6 次，每次 10 分钟，然后将视网膜切片在含二抗（如羊抗兔 IgG，1:200）和 2% NGS 的 0.01 M PBS（pH 7.4）中，于摇床上室温孵育 2 小时，接着在 4 °C 摇床上孵育 48 小时（2 天）。
注意：在对照实验中，二抗单独使用。 - 用 0.01 M PBS（pH 7.4）将视网膜条带洗涤 6 次，每次 10 分钟，然后与 ABC 试剂盒中的试剂 A 和试剂 B（均按 1:100 稀释于 0.01 M PBS，pH 7.4）在 4 °C 孵育 2 天。（试剂 A 和试剂 B 均用 0.01 M PBS 稀释，例如：A 溶液 6 μl，B 溶液 6 μl，0.01 M PBS 588 μl，总体积 600 μl）。
- 用 0.05 M Tris 缓冲液（pH 7.2）将视网膜条带洗涤 3 次，每次 10 分钟。然后在室温下用 DAB 试剂盒中的 5% 试剂 1 和 5% 试剂 3 溶于蒸馏水中预孵育 1 小时。（例如比例：试剂 1 50 μl，试剂 3 50 μl，蒸馏水 900 μl，总体积 1000 μl）。
- 用 DAB 对视网膜条带进行染色。依次加入 DAB 试剂盒中三个试管的等体积溶液（试剂 1-试剂 2-试剂 3），在解剖显微镜下观察染色情况。当细胞呈现棕褐色时停止染色，该过程持续 10–20 分钟。
- 用 0.05 M Tris 缓冲液（pH 7.2）将视网膜条带洗涤 3 次，每次 10 分钟，然后用 0.01 M PBS 洗涤 6 次，每次 10 分钟。
3. 后固定与包埋
- 将视网膜条在2%戊二醛中室温（RT）固定1-2小时，然后用0.01 M PBS（pH 7.4）洗涤六次，每次10分钟。
- 将视网膜条在0.1 M PB中的1%四氧化锇（OsO4）中室温孵育1小时，并置于避光处。
- 用蒸馏水（ddH2O）洗涤六次，每次10分钟，然后将视网膜组织在醋酸铀酰中室温孵育1小时，并置于避光处以染色。
- 将视网膜组织依次置于50%、70%、80%和90%的丙酮溶液中，各10分钟，然后在100%丙酮中处理两次，每次10分钟。
- 将视网膜组织浸入含有等体积醋酸铀酰和环氧树脂的混合液中，在37 °C干燥烘箱中孵育1小时，随后在醋酸铀酰与树脂（1:4）的混合液中于37 °C干燥烘箱中过夜。
- 用牙签轻轻将视网膜组织转移至新树脂中，在45 °C干燥烘箱中孵育1小时，然后将定向的视网膜条包埋于包埋板的树脂中。
- 将样品先置于45 °C干燥烘箱中3小时，再置于65 °C干燥烘箱中48小时。
- 将包埋块修整为梯形，用超薄切片机切成1 µm厚的切片，用甲苯胺蓝染色，并在光学显微镜下预筛感兴趣的区域。
- 将超薄切片（70-90 nm）收集于铜网上，用透射电子显微镜观察。
结果
图1展示了未孵育针对蛋白激酶Cα（PKCα）或SP的一抗的对照实验示例，其中未发现免疫反应性（IR）。
图2展示了小鼠视网膜中蛋白激酶Cα（PKCα）的免疫反应性。PKCα是视网膜中所有视杆双极细胞（RBC）的标记物18。在电子显微镜（EM）水平上，可通过二氨基联苯胺（DAB）反应产物的高电子密度来识别具有PKCα免疫反应性的RBC。图2A显示了一个PKCα阳性的RBC树突与外丛状层（OPL）中的视杆细胞终末形成突触；而图2B显示了一个视锥-RBC突触，其中PKCα阳性的RBC树突位于视锥细胞终末的突触后。此外，DAB反应产物有助于识别内丛状层（IPL）中的RBC终末（图2C）和轴突过程（图2D）。
图3展示了P物质（SP）在小鼠视网膜内丛状层（IPL）中突触前和突触后的表达情况。SP免疫反应性（SP-IR）无长突细胞是SP阴性无长突细胞的突触前（图3A），同时也与其他SP-IR无长突细胞的突起形成突触（数据未显示）。此外，SP-IR无长突细胞分别在IPL的亚层3（S3）和亚层5（S5）水平上作为双极细胞终末的突触后（图3B、C）。我们之前的研究详细分析了SP-IR无长突细胞的突起在IPL内与其他突起形成突触输出的连接结构19。值得注意的是，P物质的亚细胞定位主要存在于突触前终末的突触小泡中（图3）。
图 1：对照实验的免疫电子显微照片。 外丛状层中的视锥细胞终足（CP）具有两个带状突触（箭头所示）（A）以及视杆细胞球状终足（RS）具有一个带状突触（B）均未显示染色。比例尺：500 nm（A），200 nm（B）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：小鼠视网膜中用PKCα抗体标记的免疫电子显微照片。（A）RS与OPL中一个PKCα阳性RBC（箭头指示免疫反应性）和两个水平细胞（H）相连。（B）CP与OPL中的PKCα阳性RBC相连。（C）和（D）分别为IPL中PKCα阳性RBC的终末和轴突过程。比例尺：200 nm（A），500 nm（B），500 nm（C），500 nm（D）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：小鼠视网膜内丛状层中用 SP 抗体标记的免疫电子显微照片。（A）SP-IR 无长突细胞（A+）与 SP 阴性无长突细胞（A-）形成突触前连接。SP-IR 无长突细胞分别在内丛状层的 S3（B）和 S5（C）层次接受来自双极细胞终末的输入。比例尺：200 nm（A），200 nm（B），200 nm（C）。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本文介绍了成功观察突触环路和蛋白质定位的三个关键步骤：（1）快速且温和的固定，（2）包埋前免疫染色，以及（3）后固定与包埋。
我们认为固定是成功进行包埋前免疫电镜技术的关键步骤。因此，本文强调使用新鲜固定液和快速固定的重要性，并将这一原则命名为"4F原则"，该原则在组织制备中至关重要。然而，如何同时实现抗体渗透性的增强与有效的固定仍是一项挑战20。为解决这一问题，在初始固定阶段用苦味酸替代戊二醛，以提高抗体的渗透性，因为戊二醛可能破坏抗原决定簇并影响免疫染色效果21。相比之下，苦味酸能更好地保持膜结构和组织完整性22，尽管其固定效果有所折衷。在第三步中，使用2%戊二醛进行后固定，以优化组织的固定质量。
本方案的关键步骤包括以下五个方面：（1）早期固定：在早期使用苦味酸，以增强抗体渗透性，同时尽量减少对抗原决定簇的破坏。（2）后固定：免疫染色后使用2%戊二醛以增强组织固定效果。（3）还原处理：将组织在0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.4）中加入1% NaBH4孵育30分钟，以恢复大部分免疫反应性，提高抗原与抗体的免疫反应活性，增强阳性信号23。（4）组织制备：去除玻璃体，并将视网膜组织切成小条状，以促进抗体有效孵育，确保信号均匀。（5）此外，必须极其小心地操作视网膜组织，避免任何可能影响后续观察的损伤。这些措施共同保障了包埋前免疫电镜技术的成功，可用于研究多种结构与分子特征，例如视锥细胞-双极细胞突触24、SP-IR分子定位19以及α-Syn在小鼠视网膜中的精确定位表达25。
在孵育一抗之前，必须使用2% NGS封闭视网膜条，以消除非特异性信号干扰。一抗的浓度需根据抗体本身进行确定，通常高于冷冻切片染色所用浓度，且必须预先优化。在孵育一抗期间，需持续旋转微量离心管，以确保堆叠的视网膜条与抗体充分接触，防止堆叠部分抗体渗透不完全。为增强信号，在常规DAB染色前需预先孵育DAB，具体染色时间通常为10–20分钟。若时间过短，信号可能过弱而难以观察；若时间过长，则可能导致假阳性信号，影响准确判断。一般而言，染料的孵育时间直接取决于组织表面的颜色变化（由棕色至深棕色）。
尽管如前所述18,26,27，实验曾采用液氮冷冻组织以增强信号，该方法虽可放大阳性信号，但会导致视网膜细胞膜结构较差（数据未显示）。这种结构降解使得准确鉴定细胞类型变得困难。鉴于此，视网膜组织未进行反复冷冻。为增强阳性信号，适当延长了抗体孵育时间。本方案结合了以往方法的优点，相较于琼脂包埋法简化了步骤。这不仅保护了蛋白质的抗原决定簇，也维持了细胞膜的完整性。总体目标是探究整个通路中神经递质的突触连接及细胞定位。因此，本方案中的DAB反应产物未经过银增强处理，从而更适用于研究神经递质特异性的突触连接和通路28。
目前，在超微结构水平上对通路或神经递质进行化学鉴定的方法十分有限。其中一种方法是相关光镜与电镜技术（CLEM）29,30，但该方法仅限于非常小的区域，且无法识别整个通路中的连接。前包埋免疫电镜的优势在于信号强、适用范围广，并具备长距离分析定位与追踪能力13,14,15。然而，该方法也存在局限性，例如信号弥散，导致特异性较低。对于膜受体（尤其是位于膜上的受体）的精确定位，使用后包埋免疫胶体金电镜可能更为合适。该技术可直接计数金颗粒，有助于分析这些膜受体的数量及其变异性16。
未来，免疫电镜前包埋技术与容积电镜技术的结合有望成为长期探索已鉴定神经环路的有效方法，代表了该技术进一步发展的方向。容积电镜侧重于结构重建，依赖形态学特征识别特定结构，缺乏精确的化学鉴定能力31,32。将免疫电镜前包埋技术与容积电镜相结合，可在三维重建过程中实现对特定结构或物质的识别，为神经环路的鉴定提供更为全面且直观可视的研究手段。
致谢
本工作部分得到了中国国家重点研发计划（2022YFA1105503）、神经科学国家重点实验室（SKLN-202103）以及中国浙江省自然科学基金（Y21H120019）的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 注射器针头 | kangdelai | ||
| 1% OsO4 | 电子显微镜科学公司 | 19100 | |
| 2,2,2-三溴乙醇 | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| 8% 戊二醛 | 电子显微镜科学公司 | 16020 | |
| 8% 多聚甲醛 | 电子显微镜科学公司 | 157-8 | |
| 丙酮 | 电子显微镜科学公司 | 10000 | |
| 兔源 PKC 抗体 | Sigma-Aldrich | P4334 | |
| 兔源 SP 抗体 | Abcam | ab67006 | |
| DAB 底物试剂盒 | MXB 生物技术公司 | KIT-9701/9702/9703 | |
| 弯头剪刀 | 苏州66视觉公司 | 54010 | |
| 电子显微镜 | Phillips | CM120 | |
| Epon 树脂 | 电子显微镜科学公司 | 14910 | |
| 镊子 | 苏州66视觉公司 | S101A | |
| Millipore 滤纸 | Merck Millipore | PR05538 | |
| Na2HPO4· 12H2O | Sigma | 71650 | 磷酸缓冲液的组分 |
| NaH2PO4· H2O | Sigma | 71507 | 磷酸缓冲液的组分 |
| 苦味酸 | 电子显微镜科学公司 | 19550 | |
| 硼氢化钠 (NaBH4) | Sigma | 215511 | |
| Tris | Solarbio | 917R071 | |
| 超薄切片机 | Leica | ||
| 醋酸铀 | 电子显微镜科学公司 | 22400 | |
| VACTASTAIN ABC 试剂盒，过氧化物酶（兔 IgG） | Vector Laboratories | PK-4001 |
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