单色多重定量聚合酶链式反应端粒长度测量

摘要

本文介绍了一种利用单色多重定量聚合酶链式反应（MMqPCR）检测法测定相对端粒长度（TL）的实验方案。MMqPCR检测法是一种可重复、高效且经济的方法，适用于在基于人群的研究中测定人源DNA的端粒长度。

摘要

端粒是位于所有真核生物染色体末端的核糖核蛋白结构，可保护DNA免受损伤并维持染色体稳定性。端粒长度（TL）与多种暴露因素、生物学过程及健康结局相关。本文描述了我们实验室常规用于从人类DNA中测定相对平均TL的单色多重定量聚合酶链式反应（MMqPCR）检测方案。目前已存在多种基于PCR的TL测量方法，但本论文所介绍的MMqPCR方法的特定方案具有可重复性高、效率高、成本效益好等优点，且适用于基于人群的研究。 适用于基于人群的研究。本详细方案概述了研究者在其实验室建立该检测方法所需的全部信息。此外，本方案提供了具体步骤，以提高该检测方法在端粒长度（TL）测量中的可重复性，其可重复性通过同一样本多次测量的组内相关系数（ICC）来定义。ICC是评估特定研究人群预期检验效能的关键因素；因此，报告任何TL检测方法在特定队列中的ICC值，是提升基于人群的TL研究整体严谨性的必要步骤。利用从外周血单个核细胞中提取的DNA样本所得的示例结果表明，采用本MMqPCR方案可获得高度可重复的TL数据。

引言

端粒是位于所有真核生物染色体末端的保护性复合体，由高度保守的重复DNA序列及其结合蛋白组成。端粒可保护DNA的完整性，维持染色体的稳定性。在细胞分裂过程中，由于滞后链DNA合成不完全、DNA损伤及其他因素，端粒会逐渐缩短^1,2。越来越多的证据表明，端粒长度（TL）可作为人类整个生命周期中衰老及衰老相关疾病的生物标志物，同时用于评估TL在人类暴露、疾病与健康研究中作用的TL检测方法种类也在不断增加^3,4,5。荟萃分析已报道了TL与总体死亡率、环境暴露以及癌症、心血管疾病和糖尿病等健康结局之间的关联^{6,7,8,9,10,11,12,13}。这些荟萃关联来源于采用二十多种不同TL检测方法的研究，而不同方法所得出的关联强度往往存在差异^14,15,16。为研究选择最优的TL检测方法是确保结果准确性的关键步骤，因为每种方法都有其自身的优缺点^5,17。

由于试剂成本相对较低、检测周期短、可扩展性强以及对初始DNA用量要求较少，基于PCR的端粒长度（TL）测量技术在大样本量研究、难以获得高浓度DNA样本的研究或优先考虑高通量的研究中常被优先采用。首个基于PCR的TL测量方法是单重定量聚合酶链式反应（qPCR），由Richard Cawthon首次开发，该方法利用在不同PCR板上扩增的端粒（T）与单拷贝基因（S）荧光信号的比值¹⁸。在此方法中，使用与端粒重复DNA序列互补的引物扩增样本中的总端粒DNA含量，并通过荧光染料SYBR Green的信号进行定量。类似地，使用与保守单拷贝（S）基因的基因间区互补的引物来定量基因组拷贝数。这两个定量值均相对于在整个项目所有检测中使用的基因组DNA标准曲线进行校准，以校正板间差异。将总端粒DNA量（T）除以单倍基因组拷贝数（S），得到T/S比值，该比值是一个无量纲的相对测量值，代表单个DNA样本中每个细胞的平均端粒含量^18,19。因此，T/S比值并非功能长度的特异性测量；然而，为符合文献惯例，本方案中通篇使用“每样本平均TL”这一术语。

2009年，Richard Cawthon 提出了单色多重定量聚合酶链式反应（MMqPCR）检测法，该方法作为一种可能降低T/S比值变异性的策略被引入，相较于最初的单重qPCR方法具有改进之处¹⁹。MMqPCR检测法兼具qPCR检测的优势，并额外具备在同一反应孔中使用单一报告荧光染料同时测定T和S信号的能力，从而减少了相对于单重qPCR的误差，提高了测量的精确度和可重复性¹⁹。此外，由于所需反应数量仅为单重检测的一半，该多重方法还可能降低检测成本并提高通量¹⁹。

鉴于MMqPCR法在端粒长度（TL）测量中的优势，该方法非常适用于开展TL与暴露因素、健康结局及生物学过程关联的群体研究。然而，该方法的建立可能面临一定挑战。为应对这些挑战，我们详细描述了本实验室所采用的MMqPCR TL测量实验方案，重点说明了为提高检测精度、降低污染风险以及增强重复性而采取的关键步骤。

此外，本方案还概述了数据清洗和计算组内相关系数（ICC）的步骤，ICC 是衡量端粒长度（TL）测量重复性的重要统计指标²。通过我们的代表性结果，展示了使用本方案获得高 ICC 值的能力。同时，我们还确定了质量控制（QC）及故障排除步骤，这些步骤有助于降低 TL 测量的变异程度，从而提高最终的 ICC 值。由于该方法具有高重复性、高效性和成本效益，单色多重定量聚合酶链反应（MMqPCR）TL 测量法非常适合用于流行病学中的 TL 研究。图 1 直观展示了本方案所述的 MMqPCR 方法。

图 1：方法概述。 用于测量端粒长度的单色多重定量聚合酶链式反应方法的总体流程示意图。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

本研究严格遵守机构指南进行。本方案描述了以“重复三次的双板测定”深度（即每个样本在两个独立的反应板上分别进行三次重复测量）开展的单色多重定量聚合酶链式反应（MMqPCR）检测，并通过同时使用两台热循环仪以提高通量。采用双板设计是本方案实施中的首要考虑，旨在实现高重复性，表现为高组内相关系数（ICC）。尽管可使用较少的重复次数，但各实验室必须针对每个队列仔细评估并测量其对ICC以及后续统计效能和所需样本量的影响^20,21。若仅有一台热循环仪可用，我们建议保持测量深度（即双板三重复），并依次运行两个反应板。

1. 储液的配制与保存条件

1. 本方案所用全部材料与设备详见材料表。此外，MMqPCR检测所用特定主混合试剂及其用量详见表1。若需连续运行两块PCR板，可将主混合液体积减半但保持浓度不变，并确保同一批次检测的连续PCR板使用相同的试剂分装 aliquot。
   注意：所有储备试剂应提前配制，分装后的试剂使用前应完全解冻。
2. 将1× Tris-EDTA（pH 7.6，TE）以每管3 mL分装至5 mL离心管中，室温避光保存，可稳定保存长达2年。
3. 将5 M Betaine以每管1,280 µL分装至5 mL离心管中，-20 °C保存，可稳定保存长达1年。
4. 将SYBR Green以每管3 µL分装至单个PCR条形管中，-20 °C避光保存，用铝箔包裹，尽量减少光照暴露，可稳定保存长达2年。
5. DNA聚合酶应保存于原装管中，-20 °C保存，可稳定保存长达1年。
6. 将10× 聚合酶缓冲液以每管660 µL分装至1.5 mL离心管中，-20 °C保存，可稳定保存长达1年。
   1. 配制1× 缓冲液：取9.9 µL 10× 聚合酶缓冲液加入89.1 µL PCR级H₂O中，混匀后分装至0.5 mL离心管，-20 °C保存，可稳定保存长达1年。
7. 将1 M MgCl₂以每管70 µL分装至0.5 mL离心管中，4 °C避光保存，可稳定保存长达1年。
8. 端粒（T）和单拷贝基因（S）的正向与反向寡核苷酸引物应以冻干粉形式在室温避光条件下保存。四种寡核苷酸引物的具体序列见表2。
   注意：本方案中单拷贝基因为白蛋白基因（albumin）；若选用其他单拷贝基因，可能需要调整引物浓度以确保PCR扩增效率处于可接受范围。
   1. 引物重悬：将每管冻干引物涡旋振荡10秒，随后短暂离心5秒，确保引物干粉沉至管底，再加入1× TE缓冲液。
   2. 查看每管引物标注的nM浓度（[nM] = alpha），按每管加入体积为alpha值10倍的1× TE缓冲液（例如，若引物管上标注浓度为24.6 nM，则加入246 µL 1× TE）以配制100 µM的引物储备液。
   3. 将端粒正向与反向引物分别以每管16 µL分装，白蛋白正向与反向引物分别以每管11 µL分装，所有四种引物分装后于-20 °C保存，可稳定保存长达6个月。
9. dNTP混合液：取四种25 mM dNTP储备液各4–8管，在室温下涡旋振荡10秒，随后使用小型离心机短暂离心。将各管均匀放置于离心机管位中，盖紧盖子，离心约5秒至达到最高速度。
   1. 取一个5 mL离心管，从每种dNTP管中各加入200–250 µL，确保四种dNTP等量加入，随后充分涡旋混匀dNTP混合液。
   2. 将混合液以每管210 µL分装至0.5 mL离心管中，-20 °C保存，可稳定保存长达1年。
10. DTT储备液于-20 °C保存，3 M乙酸钠储备液于室温保存。
    1. DTT溶液配制：使用不锈钢药匙在电子天平上称取0.1545 g DTT至已去皮的称量舟中。
       警告：二硫苏糖醇（DTT）为危险试剂。若吞食可造成伤害，引起皮肤刺激，并可能导致严重眼损伤。操作时应佩戴防护手套、护目镜及面部防护装备。此外，应避免吸入DTT蒸气，操作时应在PCR通风橱内进行，并避免长时间或反复接触。
    2. 在15 mL离心管中加入33.33 µL 3 M乙酸钠和9,967 µL PCR级H₂O，配制10 mL 0.01 M乙酸钠溶液，充分涡旋混匀。将称量好的DTT加入该15 mL离心管中。取约100 µL 0.01 M乙酸钠溶液冲洗称量舟，收集残留DTT，并将此液体重新吸回15 mL管中。待DTT完全溶解后，充分涡旋混匀。
    3. 将15 mL管中溶液倒入加样槽，从槽一端用10 mL塑料注射器吸取全部溶液。在注射器出口端连接一个无菌0.2 µm醋酸纤维素滤膜（25 mm），静置1分钟使滤膜充分润湿，然后缓慢推动注射器活塞，使溶液缓慢滴入新的15 mL离心管中，确保全部溶液均通过滤膜进入新管。
    4. 将DTT溶液以每管200 µL分装至0.5 mL离心管中，-20 °C保存，可稳定保存长达6周。

表1：试剂的最终体积和浓度。 各分装样品、总反应混合液及PCR孔中试剂的体积和浓度。请点击此处下载该表格。

表2：端粒和单拷贝基因寡核苷酸引物序列。 方法中所使用的端粒和白蛋白单拷贝基因引物序列列表。请点击此处下载该表格。

2. 基因组DNA提取与样品制备

1. 分析样本的提取：使用试剂盒或实验室已建立的方法，按照制造商的说明进行样本的基因组DNA提取。
   1. 使用分光光度计检测DNA样本质量，并使用荧光计检测双链DNA（dsDNA）。平均260/280和260/230比值不合格或dsDNA浓度低于检测限（<0.20 ng/µL）的样本不应进行端粒长度（TL）分析^22,23。此外，若dsDNA浓度过高导致荧光计无法读取（>1000 ng/µL），应稀释样本后重新检测。
      注：本文所展示结果中，核酸纯度的可接受值为260/280比值在1.6至2.0之间，260/230比值在2.0至2.2之间。
2. 对照样本的提取：对来源于与待测样本相同生物材料的对照样本进行基因组DNA提取。确保提取足够量的对照DNA，以满足整个队列所有板的实验需求，从而在所有检测中使用单一DNA标准品。
   1. 使用分光光度计和荧光计检测对照DNA样本的质量。对照样本应具有可接受的平均260/280和260/230比值，并且dsDNA浓度可被检测到^22,23。
   2. 将对照DNA分装为每管150 µL、浓度为2 ng/µL的等份，置于标记有样本类型和日期的0.5 mL离心管中。将对照DNA分装样本储存于-20 °C，最长可达5年。同一队列或研究项目的全部样本所有板均使用同一对照DNA样本。请提前制备这些储备分装液。
3. 分析样本的制备：对于起始浓度>5 ng/µL的样本，使用整数倍稀释因子制备稀释分装液，加入适量提取的DNA样本（补充文件1 MMqPCR设置表，F列）和PCR级H₂O（补充文件1 MMqPCR设置表，G列），将浓度稀释至2.5 - 5.0 ng/µL之间（补充文件1 MMqPCR设置表，K列）。浓度<5 ng/µL的样本无需稀释，但应分装足够体积，以便使用本方案对每个样本进行3次检测。
   注：样本制备过程中必须制备稀释分装液，以确保向每个样本对应的PCR条管中加入15 ng DNA。制备样本分装液可使技术人员避免因样本未通过质量标准需重做而导致的反复冻融，从而保护储备样本DNA的完整性。补充文件1中的样本MMqPCR模板有助于确定正确的稀释倍数及体积以制备稀释分装液（补充文件1，MMqPCR设置表，E-I列）。
   1. 按照补充文件1 MMqPCR设置表及表3中的详细说明，将样本A1-8加入PCR条管A，样本B1-8加入PCR条管B，样本C1-8加入PCR条管C，分别加入适当稀释的样本量（补充文件1 MMqPCR设置表，L列）和PCR级H₂O体积（补充文件1 MMqPCR设置表，M列），使每根PCR管中DNA总量为15 ng，总体积为75 µL。放置一旁备用。
      注：PCR条管中的样本可在4 °C保存过夜，次日进行加样。
4. 标准曲线的制备：取出一管对照DNA分装液，解冻后涡旋振荡30秒，离心5秒，将全部体积（150 µL）转移至标准曲线（SC）PCR条管的第一管中。
   1. 向SC PCR条管的第二至第八管中各加入70 µL PCR级H₂O。充分重悬第一管中的对照DNA后，吸取70 µL加入第二根PCR管。等待30秒后，充分重悬第二根PCR管中的溶液，再吸取70 µL加入第三根PCR管。依此操作继续至第七管，形成七级2倍系列稀释的标准品。最后一管仅含PCR级H₂O，作为空白模板对照（NTC）。将SC PCR条管放置一旁备用。

表3：样品和对照标准品在板上的排列。所有样品和标准品在96孔PCR板上的位置。请点击此处下载该表格。

3. MMqPCR 扩增反应液的制备

1. 在 PCR 超净台内，将 表 1 中列出的除 DNA 聚合酶外的所有主混合试剂分装管取出，并使其升至室温。向 1x 缓冲液分装管中加入 1 µL SYBR Green 分装液。
   注意：由于实验过程中移液器精度的限制，必须使用此精确体积，以确保生成正确浓度的 SYBR Green，因此即使每次仅运行一个板，该体积也应保持不变。
2. 将所有分装管涡旋振荡 10 秒，离心 5 秒，然后按照 表 1 所列，向装有 5 M 甜菜碱的 5 mL 管（现为主混合液管）中加入以下体积的试剂：1,235.2 µL PCR 级 H₂O、640 µL 10x 缓冲液、204.8 µL dNTPs、192 µL DTT、64 µL MgCl₂、48 µL SYBR Green / 1x 缓冲液（来自步骤 3.1）、14.4 µL 的两条端粒引物，以及 9.6 µL 的两条白蛋白引物。
3. 从 -20 °C 保存处取出 DNA 聚合酶，涡旋振荡 10 秒，离心 5 秒，然后缓慢加入 128 µL 至主混合液中；立即将其放回 -20 °C 保存。
4. 将 5 mL 主混合液管涡旋振荡 30 秒。

4. 96孔板的准备

1. 将两个96孔板、加样槽和多通道移液器吸头放入PCR超净台内。用板编号（1或2）标记每块板。将第一块板（P1板）旋转180°，使列编号倒置。第二块板（P2板）保持面向操作人员的方向。
2. 将5 mL主混合液管中的内容物倒入加样槽中。使用移液器吸头收集并转移管内残留的任何溶液。
3. 将吸头装到多通道移液器上，从每个吸头的底部推入，以确保密封紧密。检查吸头在将要吸取主混合液的出口区域是否含有滤芯；如果存在滤芯，则更换吸头。
4. 使用反向移液法将黏稠的主混合液加入孔板中：先轻轻摇动加样槽，然后将移液器按钮压过第一停点，吸入超过15 µL的液体至移液器吸头中，确保所有吸头同时以相同体积充满。当将主混合液排入某一列时，将按钮压至第一停点，将多余的主混合液留在吸头中。保持按钮下压状态，将吸头重新浸入加样槽中，然后松开按钮，使吸头再次吸入约15 µL液体。使用同一组吸头为两块板加样。
   1. 先将主混合液加入所有偶数列或所有奇数列，交替在两块板之间进行（例如，若操作人员选择从奇数列开始，则先填充P2板的第1列，接着是P1板的第11列，然后是P2板的第3列，依此类推）。当操作人员从左至右完成该系列（奇数或偶数）所有孔的填充后，再以相同方式填充另一系列（偶数或奇数）的列。该操作流程示意图见图2。
      注：此加样方式可控制板间位置效应。
5. 对含有样本和标准曲线的四条封闭PCR条带进行涡旋振荡，然后分别在小型离心机中离心5秒。
   1. 按照在板上的放置顺序，将PCR条带排列在PCR管架中。对于P1板，前3列为样本（PCR条带A），第4–6列为标准品（PCR条带S），第7–9列为样本（PCR条带B），第10–12列为样本（PCR条带C；见图3和Table 3）。由于P2板相对于操作人员旋转了180°，其列顺序相反。
6. 将两块板均旋转180°，使每块板的列编号相对于操作人员方向翻转（即，若此前操作人员面对P2板的标签，则现在将面对P1板边缘的标签）。
7. 将多通道移液器设定为10 µL，并按照步骤4.3所述方法将吸头装到多通道移液器上。
   1. 使用多通道移液器重悬溶液，然后按照步骤4.4所述进行反向移液，吸取并分配10 µL的样本和标准品溶液，从PCR条带A开始。
   2. 使用PCR条带A填充每块板的前3列，列的填充顺序与主混合液加样方式类似（即奇数或偶数交替）。
   3. 使用标准曲线PCR条带填充接下来的三列。对于该条带，先用设定为约90 µL的200 µL移液器充分重悬第7^th稀释管（倒数第二管），然后再用多通道移液器彻底重悬整条PCR条带。
      注：此管中较大的体积和较低的DNA浓度常因混合不充分而导致PCR板各孔间的测量值差异。使用较大体积进行混匀可更好地均一化DNA溶液。
   4. 使用PCR条带B填充接下来的三列，最后三列使用PCR条带C填充。每次更换PCR条带时均需更换移液器吸头，按照图3所示方案，将两块板的所有96个孔填充相应的样本和对照标准品。
8. 板加样完成后，轻轻敲击板面以使附着在孔壁的液体流到底部，然后使用封板膜覆盖板面。用指尖按压膜的所有边缘，确保密封严密。
   1. 在超净台台面上轻轻旋转混匀板30秒，然后将密封好的板放入板式离心机中，孔口朝向中心，离心2分钟。
   2. 将板放入PCR仪中，确保板的列编号方向清晰可读。关闭PCR仪盖前，使用干净的纸巾擦拭每块板的顶部。

图 2：板孔填充流程。（A）若选择先填充奇数列，则此图为孔位填充顺序。（B）若选择先填充偶数列，则此图为孔位填充顺序。请点击此处查看此图的放大版本。

图 3：板布局。 应使用 PCR 排管 A、排管 B、排管 C 以及标准曲线（SC）排管填充每块板上的三列，以生成每个样本和标准稀释液的重复三份。本示意图展示了每根排管应填充的列。在加样前，第二块板需旋转 180°（注意列和行的标题是倒置的），但其填充方式与第一块板完全相同，这样可在消除潜在移液误差的同时，仍能控制板间的位置效应。请点击此处查看此图的放大版本。

5. MMqPCR 热循环

1. 在步骤 4.8.1 离心过程中，打开计算机和热循环仪。启动热循环仪软件。本方案描述的是使用 CFX Maestro 软件的操作流程。
2. 根据 MMqPCR 热循环扩增方案¹⁹（图 4）创建端粒长度（TL）热循环程序：
   1. 添加一个孵育步骤，用于在 95 °C 下激活 DNA 聚合酶，持续 15 分钟。
   2. 为避免引物二聚体结合，先运行两个循环：94 °C 15 秒，49 °C 1 分钟；然后运行三个循环：94 °C 15 秒，59 °C 15 秒。
   3. 进行端粒扩增时，添加 27 个循环：85 °C 15 秒，74 °C 30 秒，随后进行信号采集。
   4. 进行白蛋白扩增时，添加 31 个循环：94 °C 15 秒，84 °C 30 秒，随后进行信号采集。
   5. 在热循环程序中加入熔解曲线分析，温度从 59 °C 升至 95 °C，每升高 1 °C 停留 5 秒。
3. 点击两台热循环仪上的开始运行。当系统提示时，为分析文件提供一个标题。

图4：MMqPCR检测的热循环程序。 MMqPCR方案根据原始热循环程序在软件中创建¹⁹。 请点击此处查看此图的放大版本。

6. MMqPCR 数据分析

1. 当热循环完成后，按以下方式分析数据，以生成已处理样本的端粒长度（TL）值。
2. 在软件中选择 板设置 功能。在下拉菜单中点击 查看/编辑板。
   1. 选中所有孔并点击 选择荧光染料，然后勾选标记为 SYBR 的选项框，并取消勾选所有其他选项框。点击 确定。
   2. 保持所有孔仍处于选中状态，在 加载 一词旁边，勾选 SYBR 旁边的选项框。此时所有孔上应显示 SYBR 字样。
   3. 接下来选中标准对照系列稀释液顶部或底部的三个 NTC 孔，并从右侧的样本类型菜单中选择 NTC。这三个孔现在应变为黄色并标记为 NTC。图 5A 显示了 P1 应选择的孔，图 5B 显示了 P2 应选择的孔。
      注：P2 与 P1 相反，因此对于 P1，NTC 位于第 4–6 列的底部，而对于 P2，NTC 位于第 7–9 列的顶部。
   4. 选中标准对照系列稀释的 21 个孔，并从样本类型菜单中选择 标准品。这些孔应变为绿色。在这些孔仍被选中的情况下，点击 技术重复。从重复大小菜单中选择 3，然后选择 横向 > 应用。这些孔应以三组为单位标记为 Std-1 至 Std-7。
   5. 在标准品仍被选中的情况下，向下滚动并选择 稀释系列。在稀释因子字段中输入 2，然后根据板编号输入起始浓度和方向性，具体步骤如下所述。
   6. 对于 P1 板，在起始浓度字段中输入 2.00E-03，并勾选 递减 选项框，然后选择 应用。这 21 个孔中的浓度值应从上到下依次为 2.00E-03 至 3.13E-05。
   7. 对于 P2 板，在起始浓度字段中输入 3.13E-5，并勾选 递增 选项框，然后选择 应用。这 21 个孔中的浓度值应从上到下依次为 3.13E-05 至 2.00E-03。
3. 对于样本，选中 PCR 条带 A 的列（P1 和 P2 的第 1–3 列），从样本类型菜单中选择 未知，然后选择 技术重复。从 重复大小 菜单中选择 3，然后选择 横向 > 应用。这些列的孔应变为蓝色，并按行以三组为单位标记为 Unk-1 至 Unk-8。
   1. 对 PCR 条带 B 的列（P1 的第 7–9 列，P2 的第 4–6 列）重复步骤 6.3。它们应标记为 Unk-9 至 Unk-16。
   2. 对 PCR 条带 C 的列（P1 和 P2 的第 10–12 列）重复步骤 6.3。它们应标记为 Unk-17 至 Unk-24。当完成步骤 6.2–6.3.2 后，板设置窗口应如 图 5A、B 所示。
4. 点击板编辑器窗口右下角的 确定。提示是否应用更改时，点击 是。
5. 对于实验水平的质量控制（QC），确保定量标签页中的曲线符合要求（例如，无倒置扩增曲线），分别对应热循环程序的第 9 步和第 12 步，即端粒和白蛋白扩增子。可通过软件窗口右中部的下拉菜单访问曲线。图 6A、B 展示了合适的曲线。
   1. 确保第 9 步和第 12 步报告的 PCR 扩增效率均在 90% 至 110% 之间，且两者之间的差异不超过 10%（例如，第 9 步为 92.4%，第 12 步为 98% 是合适的，但第 9 步为 92.4%，第 12 步为 108% 则不合适）。此外，确保标准 R² 曲线 >0.995。若 P1 或 P2 中任一板未达到这些标准，则需重新运行。
6. 对于 P1，选择 第 9 步 并选中与标准曲线对应的 21 个孔，如 图 6A、B 所示。复制软件窗口右下角的 Cq 值。打开作为 补充文件 1 提供的端粒数据表模板，将这些值粘贴到“标准 1”工作表的 B 列。选择 第 12 步，然后复制这些 Cq 值。将这些值粘贴到“标准 1”工作表的 I 列。
   1. 识别第 9 步中的斜率值，并将其输入“标准 1”工作表的 C4 单元格。识别第 12 步中的斜率值，并将其输入“标准 1”工作表的 J4 单元格。
      注：系统使用步骤 6.6.1 中确定的标准曲线斜率计算引物的扩增效率百分比。可通过以下公式手动计算效率：
      
   2. 确保每个标准稀释三重复的变异系数（CV）小于 0.1。若大于或等于 0.1，则从板上 7 点标准系列稀释曲线中包含的所有对照样本浓度中，最多排除总共三个单独的孔。每个三重复组中仅可排除一个孔。
      注：在软件分析中排除标准点将改变两个引物的报告斜率、R、y 截距和效率。因此，在从分析中移除任何标准孔后，必须重复步骤 6.5.1–6.6.1。
   3. 对 P2 分析文件及对应的“标准 2”工作表重复步骤 6.6.1–6.6.2。
   4. 仅当“标准 1”和“标准 2”工作表均完成且 CV 值可接受时，才从分析文件中收集个体样本数据。确保在 P1 v P2 工作表的 L 列中报告了质量控制调整信息，例如在 P1 分析文件中排除了多少个孔。
7. 确保在定量标签页中，P1 分析文件中的 72 个样本孔仅以蓝色高亮显示，如 图 7A、B 所示。选择 第 9 步。复制软件窗口右下角的 Cq 和 SQ 值。将这些值粘贴到“样本 P1”工作表的 D3 单元格开始处。选择 第 12 步，然后复制这些 Cq 和 SQ 值，并粘贴到“样本 P1”工作表的 F3 单元格开始处。
   1. 对 P2 分析文件中的样本及对应的“样本 P2”工作表重复此步骤。端粒与单拷贝基因比值（T/S）（H 列）将自动计算，也可使用以下公式手动计算：
      
      其中 E_T/S 分别表示针对端粒或单拷贝基因反应的指数扩增效率，Cq_T/S 表示特定重复样本在达到荧光定量临界阈值时的循环数。每个样本的六个测量值将自动计算平均 T/S 比值（I 列）。
      注：CFX 中的样本 ID 编号在两块板之间不对应相同的生物样本。端粒数据表模板已考虑此差异，会自动匹配相应的重复三重复。
   2. 在 CFX Maestro 中，检查所有分析样本的 Cq 值是否落在标准曲线最低和最高 Cq 值范围内，如 图 7B 所示。若样本超出范围，如 图 7A 所示，则需在调整浓度后重新运行。若样本的 Cq 值低于最高浓度标准，则应按其超出范围的扩增循环数近似倍数进行稀释；若样本的 Cq 值高于最低浓度标准，则应按其超出阈值的扩增循环数近似倍数进行浓缩。
      注：分析样本浓度的大幅变化会引入额外的变异可能性，应谨慎操作。
   3. 确保 NTC 的起始浓度低于样本孔中 DNA 平均含量的 5%。可通过查看 MMqPCR 的“样本 P1”和“样本 P2”工作表上的 % 水污染情况来检查。若 NTC 显示污染，则需重新运行板。
      注：由于 MMqPCR 检测的高度敏感性，偶尔可能因微小的不可控污染导致 NTC 孔发生扩增。但这种扩增应较轻微，且发生在热循环程序第 12 步单拷贝基因扩增后的若干个循环之后。
   4. 对于样本水平的质量控制，检查“样本 P1”和“样本 P2”工作表中的标准差（SD）（J 列）和变异系数（CV）（K 列）。确保样本三重复 T/S 比值的板内 CV 小于 0.10（10%）。若板内 CV 大于 0.1，可从一组三重复中排除一个 T/S 比值。
      注：每个样本的六次测量中，总共仅可排除一个重复，即同一样本不能在 P1 和 P2 上同时排除重复。
   5. 检查 P1 v P2 工作表 G 列中的个体样本板间 CV 是否小于 0.05（5%）。若 CV 大于 0.05，可从两块板的六次测量中排除一个 T/S 比值。必要时，通过目视检查板内三重复和全部六次测量结果后排除样本。
      注：仅通过这些质量控制标准（板内 CV < 10%，板间 CV < 5%）的样本可纳入最终 TL 结果。否则，该样本应从本次运行的 P1 v P2 和 ICC 数据表中排除，并在第二次 MMqPCR 检测中重新评估。
   6. 对于板水平的质量控制，检查每块板上所有样本的平均板内变异（位于“样本 P1”和“样本 P2”工作表底部）是否小于 0.05（5%）。额外的板水平质量控制，检查 P1 v P2 工作表 G29 单元格的整体板间变异是否小于 0.06（6%）。确保未通过质量控制的样本从 G30 单元格的板间 CV 计算中移除。
      注：当处理相关样本组（如家庭成员、不同时间点等）时，组内所有样本必须在同一块板上运行。因此，若组内一个样本未通过质量控制标准，则该组所有样本必须重新运行。
   7. 在另一个独立的总体队列或实验数据文件中，记录通过质量控制的每个样本的最终 TL 数据（P1 v P2 工作表，I 列）、通过质量控制的每个样本的 ICC 计算结果（ICC 数据表，E–K 列），以及来自 P1 v P2 工作表的最终实验运行质量控制数据（J–L 列）
8. 使用端粒研究网络（TRN）创建的 补充文件 2 计算该项目的 ICC²⁰。
9. 最后，为提高不同 TL 研究之间的可比性，使用以下公式将独立的总体队列或实验数据文件中每个通过质量控制的样本的最终 TL 数据转换为 Z 分数，其中从个体样本的 T/S 比值中减去队列中所有样本的平均 T/S 比值，再除以队列中所有样本的 SD。
   

图5：基于软件的孔板设置。（A）完成步骤6.2–6.4后P1板的基于软件的孔板设置。（B）完成步骤6.2–6.4后P2板的基于软件的孔板设置。由于软件根据孔位分配样本编号，两个CFX板之间的样本和标准品编号未对齐（例如，P1板上的CFX样本1对应P2板上的CFX样本24）。补充文件1中提供的Excel模板已对此进行了校正，确保同一样本在不同板间的测量结果能够正确匹配。请点击此处查看该图的放大版本。

图 6：端粒和白蛋白扩增子的标准曲线。（A）该标准曲线来自代表性结果数据集的 P1 端粒扩增子。其中一个标准品因未达到质控标准而被剔除。（B）该标准曲线来自代表性结果数据集的 P2 白蛋白扩增子。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7：端粒和单拷贝基因扩增子。（A）端粒扩增，以及（B）在代表性结果中显示的样本白蛋白基因扩增，由软件报告。 请点击此处查看该图的放大版本。

7. MMqPCR 数据报告

1. 在报告使用MMqPCR生成的端粒长度（TL）数据的研究结果时，应确保报告TRN最低报告指南中所述的各项内容。这些指南可在TRN网站（https://trn.tulane.edu/resources/reporting-guidelines/）获取，报告该信息的模板见补充文件3。在适当情况下引用本实验方案及其他TRN指南和资源。

结果

表 4 和 表 5 所示结果展示了遵循本方案获得的高度可重复的端粒长度（TL）测量数据示例。这些结果所用的DNA样本来自24个外周血单个核细胞（PBMC）样本，采用商业试剂盒并按照制造商指南提取。这24个样本在两个96孔板上进行检测。所有DNA样本均通过分光光度计和荧光计检测其质量，利用平均260/280比值、平均260/230比值以及双链DNA（dsDNA）浓度来判断样本是否符合检测要求及确定稀释倍数（表 6）。表 6 还强调了定量双链DNA浓度的重要性，该浓度可能与分光光度法测得的DNA浓度存在差异。这种差异源于不同的定量方法：分光光度法基于280 nm处的吸光度推算DNA浓度，易受污染物（如蛋白质、盐类等）影响而导致吸光度读数波动；相比之下，荧光计通过特异性结合双链DNA的荧光染料所产生的荧光信号来测定dsDNA浓度，因此被认为更能准确反映DNA的实际含量。在进行MMqPCR端粒长度分析前，DNA样本最多经历了三次冻融循环。对照DNA由单一个体PBMC提取的DNA混合而成，并以此制备了从2 ng/μL到0.0313 ng/μL的七点梯度稀释系列。PCR第9步（端粒扩增子）和第12步（单拷贝基因扩增子，本方案中为白蛋白基因）各自建立的独立标准曲线见图6A,B。实验在商用实时荧光定量PCR检测系统上运行，生成的熔解曲线显示不同温度下产生各自的扩增产物，如图8所示。

表4：MMqPCR测量获得最优代表性结果的输出数据。 24个样本的平均T/S比值、标准差（SD）、变异系数（CV）及Z分数化的端粒长度（TL）。请点击此处下载该表格。

表5：端粒长度数据输出。 MMqPCR检测的原始数据在软件中分析后，将被导入作为补充文件1附带的电子表格模板中进行进一步分析和质量控制。该端粒长度模板输出表汇总了数据，显示了两个板中每个样本的样本编号、平均端粒长度、标准差（SD）和变异系数（CV）。请点击此处下载该表格。

表6：样本检测结果的分光光度计和荧光计DNA质量指标。 每个样本通过分光光度计进行重复分析以及通过荧光计对双链DNA及可能污染物进行单次测量所获得的质量控制数据。 请点击此处下载该表格。

图8：熔解曲线示例。 由软件生成的样本数据熔解曲线。较早出现的峰（约80 °C）代表端粒扩增产物，第二个峰（约89 °C）代表白蛋白扩增产物。 请点击此处查看该图的放大版本。

本项目中，所有运行的平均端粒扩增效率为98.6%，范围为90.7%至102.1%；白蛋白扩增效率平均为102.3%，范围为93.6%至108.2%。标准曲线中平均剔除0.97个重复样本，符合本方案的质量控制标准。板间平均变异系数（CV）为1.83%（标准差SD为0.00616），板内平均变异系数为3.78%（标准差SD为0.00658）。这些代表性样本的平均端粒长度（TL）如表4和表5所示。平均TL为1.37，标准差为0.24，范围为0.84至2.32。每个样本的T/S比值、标准差（SD）、变异系数（CV）及Z-score标准化的TL值列于表4中。由于MMqPCR检测输出的T/S比值为端粒长度的相对测量值，因此将比值转换为Z-score，以便进行跨研究比较。本项目的组内相关系数（ICC）使用R脚本计算，方法依据补充文件2中TRN指南所述，已校正批次和运行效应²⁰。为计算项目内部的ICC，我们对10%合格样本进行了重复检测，并确保ICC检测板中每批队列板至少包含一个样本。总体项目ICC为0.801 [95%置信区间CI：0.703, 0.86]，表明端粒长度结果具有高度可重复性。

并非所有结果都会是理想的。图9 和 表7展示了 MMqPCR 检测中次优的结果。图9 显示了一个端粒扩增效率低于90%的标准曲线，低于质量控制标准，因此整块板必须重做。引物扩增效率问题通常源于试剂问题，因此在确定导致低效率的试剂时，首要步骤是追踪试剂分装的日期及其有效期。在重新运行该板之前，应更换已过期的试剂。表7 显示一块板虽然通过了初始的样本水平质量控制标准，但板间变异程度较高，导致板间水平质量控制失败。板间的变异通常源于移液和加板操作技术中的误差。在此情况下，技术人员应评估板设置过程中出现的任何问题，并确保移液器已校准。

图 9：不理想的结果。 软件中显示的该标准曲线未能通过质量控制，因为端粒引物的扩增效率低于 90%。此图像来自 P1，但 P2 的扩增效率同样偏低。本次运行的数据无法使用，需更换已过期的导致问题的试剂后，所有样本必须重新检测。请点击此处查看此图的放大版本。

表7：不理想的结果。 该表格展示了一次运行中许多样本未能达到质控标准的端粒数据模板。根据变异系数（CV）值确定需要重新运行的样本，并将样本名称更改为红色字体以便于识别。 请点击此处下载该表格。

补充文件 1：端粒数据电子表格模板。请点击此处下载该文件。

补充文件 2：ICC 计算。本方案由端粒研究网络（TRN）制定。此文件改编自²⁰。 请点击此处下载该文件。

补充文件 3：TRN 报告指南。 请点击此处下载该文件。

讨论

在2002年之前，大规模人群研究中最常用的端粒长度（TL）测量方法是末端限制性片段长度（TRF）的Southern印迹分析^24,25。尽管TRF在专业实验室中能够提供出色的精确度和可重复性，但由于其对DNA的用量和质量要求较高，且通量有限，因而应用受到限制，这也促使了基于qPCR的TL检测方法以及随后的MMqPCR检测方法的广泛应用。MMqPCR TL方法在建立、优化并严格遵循各项质量控制（QC）标准进行维护的情况下，可实现可重复的TL测量。为确保检测的可靠性，必须对每个分析队列计算并报告其特定的组内相关系数（ICC）。尽管该方法仍受DNA质量和操作技术水平的影响，但MMqPCR方法因其所需DNA量少、比单重PCR更可靠、在试剂成本和实验人员时间上比其他方法更高效，因而非常适合用于大规模人群研究中对TL的分析。能够获得高ICC值的能力进一步支持了MMqPCR在大规模人群TL研究中的应用。MMqPCR TL测量可广泛应用于多种研究，以明确TL作为全因死亡率、衰老、终生应激、环境暴露以及心血管疾病和癌症等躯体健康结局生物标志物的作用^{4,7,8,10,11,12,13,26,27,28,29,30,31}。

MMqPCR方法的一个局限性在于，其以T/S比值报告端粒长度（TL），这是一种相对长度估计值，其结果会因单拷贝基因的选择、预混液组成以及PCR扩增循环参数的不同而发生变化。³²T/S 比值无单位。因此，在未结合其他端粒长度（TL）测量方法的情况下，该方法无法提供以碱基对数值表示的估计结果。^18,33,34因此，T/S 比值必须转换为Z分数，以便在不同研究之间具有可比性³⁵在不同实验室、方法和检测之间进行此类操作时应格外谨慎。此外，与基于凝胶的杂交检测方法一样，本方法可包含对端粒间序列的定量。然而，这些序列在每个基因组的总端粒DNA含量中所占比例极小。此外，端粒间序列更可能含有与经典端粒重复序列不同的错配碱基对序列，从而降低引物结合与扩增的可能性。另外，尽管MMqPCR检测所需的DNA用量极少具有优势，但需要注意的是，基于qPCR的端粒长度（TL）测量 受样本储存条件、DNA提取方法和生物组织等影响DNA质量和完整性的分析前因素的影响^36,37。它具有 已证明，对这些因素进行分析控制可提高使用qPCR生成的端粒长度测量结果的外部有效性³⁸尽管如此，仍需系统评估DNA质量差异对MMqPCR检测所获得的端粒长度（TL）的具体影响，因为目前尚无基于数据的指导标准用于判断样本是否具有足够质量以通过该方法准确估算TL。尽管存在这些局限性，该检测方法在人群水平健康结局研究中的应用前景仍然广阔。

使用MMqPCR检测方法时，需持续评估其精密度和通量。根据当前设计，技术人员应同时在两个PCR仪上的两块平行板中对样本进行三复孔检测。若不具备多个PCR仪，我们建议保留双板三复孔的检测设置，并依次运行各反应板，以提高检测精密度，即使这会降低通量。任何以牺牲精密度为代价优先考虑通量的决策（例如仅进行一次三复孔检测），都应在分析实际样本前，对所得的组内相关系数（ICC）进行充分测试与评估。在权衡通量与精密度时，必须考虑样本量及样本DNA的质量。当样本量较小或DNA质量较差时，更应优先保证高精密度²³。若处理来自相关群体的样本（例如家庭成员或具有多个时间点的受试者），这一点尤为重要。在此类情况下，应进行周密规划，例如在实验开始前将相关样本分配至同一块反应板，以避免因无意的“组别-板”混杂而损失统计效能。

在本实验中，使用分光光度计评估DNA样本质量：260/280比值在1.6–2.0之间、260/230比值在2.0–2.2之间的样本被视为合格。此类质量评估以及通过荧光计对双链DNA进行准确定量，是本方案中获得可重复的端粒长度（TL）数据的关键步骤。此外，也可采用其他更详细的DNA完整性评估方法，例如片段大小，或通过琼脂糖凝胶电泳确定的DNA质量综合指标（如DNA完整性数值），以判断样本质量³⁸。我们还建议，样本稀释仅在准备进行MMqPCR实验时进行。这可确保DNA分装样本在提取后经历尽可能少的操作，从而降低实验前处理带来的变异。若需运输DNA样本，应以尽可能高的浓度在干冰条件下运送，以减少低浓度下DNA样本的降解^39,40。由于冻融循环会导致DNA降解，因此应尽量减少储存DNA的冻融次数⁴¹。在运行队列样本前，应预先制备混合对照DNA的分装 aliquot；在运行实验前，也应预先制备各单个待测DNA样本的分装 aliquot。

评估实验性能和质量控制（QC）的关键指标包括无模板对照（NTC）信号、板间和板内变异系数（CV），以及标准曲线的 R²。若未达到质量控制标准，可通过多种方式加以纠正。定期更换 PCR 级 H₂O 储存液，并为每对运行的 PCR 板单独分装 PCR 级 H₂O 的子储存液，可最大限度减少污染来源及 NTC 扩增。此外，减少污染的其他措施包括：指定专用的 PCR 操作台，仅用于 MMqPCR 实验；使用 DNA 去污染溶液擦拭 PCR 操作台和设备；用紫外线照射实验区域；以及在 PCR 操作台内操作时严格遵守无菌技术。为提高实验重复性并降低 CV 值，建议在相应的涡旋步骤中对样本、稀释液和 PCR 条带进行充分剧烈涡旋，并在移液时彻底重悬 DNA 样本。标准曲线 R² 值低于阈值 (<0.995) 通常主要归因于加样过程中的移液误差。为避免此问题，应特别注意精确移液，每年校准移液器，在加样前对标准 PCR 条带进行充分剧烈混合，并合理有序地准备实验耗材，以提高实验流程效率。若使用两台仪器时发现其中一台仪器持续输出较高的 CV 值，应考虑对仪器进行维护，以可能改善该问题。应定期运行制造商提供的质量控制板，以评估 PCR 仪的性能。

如果在实施上述建议步骤后问题仍然存在，可采用以下步骤对本实验方案进行故障排查。记录所有试剂分装的时间以及相关有效期信息，有助于在问题出现时加快排查进程。排查过程中的一个重要原则是每次仅调整一种试剂，以确定导致微孔板未能通过质控标准的具体原因，并应从最廉价的可疑试剂开始逐一排查。例如，若端粒和单拷贝基因的扩增效率均较低，则更可能是由两者共用的试剂引起问题，如 DTT、dNTPs 或 SYBR 储备液，而非特异性引物。根据所列价格，应依次测试新分装的 DTT，然后是 dNTPs；若问题仍未解决，最后再测试新的 SYBR 储备液。相反，若仅有一个扩增子（端粒或单拷贝基因）扩增效率偏低，则问题更可能出在其中一条引物上。图8 所示的熔解曲线峰形可为故障排查提供关键信息。通过观察两条熔解曲线峰形，可识别特定样本的潜在问题，因为异常样本的峰形会明显偏离标准品或其余分析样本的整体趋势。此外，若某一扩增子的熔解峰形系统性地较另一扩增子更宽、不锐利，则可利用熔解曲线判断该扩增子所用引物是否存在问题。

本文详细介绍了如何成功建立用于测量端粒长度（TL）的单色多重定量聚合酶链式反应（MMqPCR）检测方法，该方法广泛适用于公共卫生研究，并提出了关键的质量控制与故障排除建议，旨在提高这一高效且经济的方法的可及性与可靠性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 mL 管	USA Scientific	1605-0099	Seal-Rite 0.5 mL 微量离心管，无菌 储存温度和条件：室温
1.5 mL 离心管	USA Scientific	1615-5599	Seal-Rite 1.5 mL 微量离心管，无菌 储存温度和条件：室温
100 mM DTT	自主研发	不适用	使用储备液 DTT、稀释的醋酸钠和 PCR 级 H2O 储存温度与条件：-20 °C
15 mL 离心管	Thermo Fisher	14-959-53A	Corning 352196 Falcon 15 mL 圆锥形离心管 储存温度和条件：室温
1M MgCl2	Thermo Fisher	50152107	Biotang Inc 1M MgCl2 1 M 氯化镁溶液，使用 18.2 兆欧姆水配制，并经 0.22 微米滤膜过滤 储存温度和条件：4 °C
1x Gold 缓冲液	实验室内部方法	不适用	10X Gold Buffer 用 PCR 级 H 稀释2O 储存温度与条件：-20 °C
25 mM dNTPs	New England BioLabs	N0446S	脱氧核苷酸溶液套装 储存温度与条件：-20 °C
5 mL 离心管	Thermo Fisher	3391276	Argos Technologies 微型离心管 – 5 mL 储存温度与条件：室温
96孔板	伯乐（Bio-Rad）	HSP9601	Hard-Shell 96孔PCR板，低矮型，薄壁，带裙边，白色/透明 储存温度和条件：室温
铝箔	Office Depot	3489072	Reynolds Wrap Stanard 铝箔卷，12" x 75'，银色 储存温度和条件：室温
AmpliTaq Gold 试剂盒 – 聚合酶与缓冲液	Thermo Fisher	4311806	AmpliTaq Gold DNA聚合酶（含Gold缓冲液和MgCl）2 (MgCl₂)2 在此试剂盒中未使用），10X Gold Buffer，2.5U AmpliTaq Gold Polymerase 储存温度与条件：-20 °C
甜菜碱	赛默飞世尔科技	AAJ77507AB	甜菜碱，5M 溶液，分子生物学级，超纯，10 mL 储存温度和条件：-20 °C
大试管架	Thermo Fisher	344817	Fisherbrand 四通试管架 储存温度和条件：室温
CFX Maestro 软件	Bio-Rad	12004110	实时荧光定量PCR板设置、数据采集、统计分析与结果作图软件 储存温度和条件：室温
CFX96 实时荧光定量 PCR 系统光学反应模块（含初装套件）	伯乐（Bio-Rad）	1845096	实时荧光定量PCR用96孔光学模块 储存温度和条件：室温
DTT	Fisher Scientific	AAJ1539706	二硫苏糖醇， >99.5+ 分子生物学级，5 g 储存温度和条件：-20 °C
ELIMINase	Fisher Scientific	04-355-32	ELIMINase 实验室去污染剂 储存温度和条件：室温
高效微粒空气过滤器	USA Scientific	替换滤光片	AirClean 工作站用高效微粒空气过滤器 储存温度和条件：室温
Kimwipes	Thermo Fisher	06666A	Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes 一次性擦拭纸，单层 储存温度与条件：室温
加样槽	Thermo Fisher	14387069	赛默飞世尔科技 Matrix 试剂储液槽 储存温度和条件：室温
Microsoft Excel	Microsoft	不适用	Microsoft 365 套件，Excel 软件应用 储存温度和条件：室温
微型离心机	Genesee Scientific	31-500B	Poseidon 31-500B 微型离心机，蓝色盖子 储存温度和条件：室温
PCR级H2O	Thermo Fisher	AM9937	无核酸酶水（非DEPC处理） 储存温度与条件：室温
PCR操作台	USA Scientific	4263-2588	带有高效微粒空气（HEPA）过滤系统的核酸工作站，AirClean Systems 组合式 PCR 工作站 储存温度与条件：室温
PCR 条板	Thermo Fisher	AB0776	低轮廓管和扁平盖，8联排管 储存温度与条件：室温
PCR管架	Thermo Fisher	344820	Fisherbrand 96孔PCR管架 储存温度与条件：室温
多通道移液器吸头	Ranin	17005860	Pipette Tips SR LTS 20µL F 960A/5, 20µL 最大值 储存温度和条件：室温
单通道移液器吸头	USA Scientific	1181-3850	10µL Graduated TipOne RPT 滤芯吸头 储存温度和条件：室温
单通道移液器吸头	USA Scientific	1180-1850	20µL 斜口尖端 RPT 过滤吸头 储存温度和条件：室温
移液器吸头（单通道）	USA Scientific	1111-0880	200µL 自然型 TipOne 吸头，带架 储存温度和条件：室温
移液器吸头（单通道）	USA Scientific	1111-2890	1000µL 自然渐变尖端一次性移液器吸头，置于架子上 储存温度与条件：室温
移液器（多通道）	Ranin	17013802	Pipet-Lite 多通道移液器 L8-10XLS，0.5 至 10µL 储存温度和条件：室温
移液器（多通道）	Ranin	17013803	Pipet-Lite 多通道移液器 L8-20LS+，2 至 20µL 储存温度和条件：室温
单通道移液器	Thermo Fisher	F144802G	Gilson Pipetman Classic 移液器，1 至 10µL 储存温度和条件：室温
移液器（单通道）	Thermo Fisher	F123600	Gilson Pipetman Classic 移液器，2 至 20µL 储存温度和条件：室温
移液器（单通道）	Thermo Fisher	F123601	Gilson Pipetman Classic 移液器，20 至 200µL 储存温度与条件：室温
移液器（单通道）	Thermo Fisher	F123602	Gilson Pipetman Classic 移液器，200 至 1000µL 储存温度与条件：室温
封板膜	伯乐（Bio-Rad）	MSB1001	Microseal “B” PCR板封膜，粘性，光学级 储存温度和条件：室温
板式离心机	Thermo Fisher	14-100-141	Fisherbrand 微孔板旋转离心机，230 V 储存温度和条件：室温
预扩增滤器	USA Scientific	4235-3724	AirClean Systems 工作站用预过滤器 储存温度和条件：室温
R 软件	统计计算的 R 项目	不适用	R 版本 4.2.2 储存温度与条件：室温
比例尺	Thermo Fisher	01-922-329	OHAUS 30430060 PR系列分析天平，62g量程 储存温度和条件：室温
剪刀	Office Depot	458612	Office Depot 品牌剪刀，8”, 直发，黑色，2 支装 储存温度与条件：室温
夏普利斯	Sharpie	2151734	Brush Twin 永久性记号笔，黑色 储存温度与条件：室温
单拷贝基因正向引物	Integrated DNA Technologies	自定义	参见单独的表格 储存温度与条件：-20 °复水后 C
单拷贝基因反向引物	Integrated DNA Technologies	端粒是位于所有真核生物染色体末端的核糖核蛋白结构，可保护DNA免受损伤并维持染色体稳定性。端粒长度（TL）与多种环境暴露、生物学过程及健康结局相关。本文描述了我们实验室常规用于测定人源DNA相对平均端粒长度的单色多重定量聚合酶链式反应（MMqPCR）检测方案。目前已有多种基于PCR的端粒长度检测方法，但本出版物所介绍的MMqPCR方法具有可重复性强、效率高、成本低等优点，适用于基于人群的研究。该详细方案提供了研究人员在其实验室建立此检测方法所需的全部信息。此外，本方案还提供了具体操作步骤，以提高该检测方法在重复测量同一样本时端粒长度测量结果的可重复性，该可重复性以组内相关系数（ICC）进行评估。ICC是评估特定研究人群预期统计效能的关键因素；因此，报告任何端粒长度检测方法在特定队列中的ICC值，是提升端粒长度人群研究整体严谨性的必要步骤。利用外周血单个核细胞提取DNA样本的示例结果表明，采用本MMqPCR方案可获得高度可重复的端粒长度数据。	参见单独的表格 储存温度与条件：-20 °复水后 C
小型试管架	Thermo Fisher	21-402-17	Thermo Fisher 8601 可逆微型离心管架（带盖） 储存温度和条件：室温
乙酸钠	Thermo Fisher	J63560.EQE	3M NaOAc pH 5.2 储存温度与条件：室温
不锈钢刮勺	Thermo Fisher	3990240	Bel-Art SP Scienceware 不锈钢取样勺和刮铲 储存温度和条件：室温
SYBR Green	Thermo Fisher	S7563	SYBR Green I 核酸凝胶染色剂 – 10,000倍浓缩液（溶于DMSO） 储存温度与条件：-20 °复水后 C
注射器滤器	Fisher Scientific	09-927-55A	GD/X 25 mm 无菌注射器滤器，醋酸纤维素滤膜，0.2 μm μm 储存温度和条件：室温
注射器	Thermo Fisher	148232A	BD Luer-Lok 无针一次性注射器，10 mL 储存温度与条件：室温
TE缓冲液	Fisher Scientific	BP2474100	TE缓冲液，Tris-EDTA，1X溶液，pH 7.6，分子生物学级，Fisher BioReagents 储存温度和条件：室温
端粒正向引物	Integrated DNA Technologies	定制	参见单独的表格 储存温度与条件：-20 °重悬时为 C
端粒反转录引物	Integrated DNA Technologies	自定义	参见单独的表格 储存温度与条件：-20 °C 重悬时
紫外光	USA Scientific	4288-2540	工作站用紫外灯管 储存温度与条件：室温
涡旋震荡	Thermo Fisher	14-955-151	Fisherbrand 小型旋涡混合器，115 V，50/60 Hz 储存温度和条件：室温
称量纸	Thermo Fisher	01-549-752	Fisherbrand 无菌六边形称量舟，10 mL 储存温度和条件：室温