此处，我们介绍一种利用光学光热红外-荧光技术的实验方案 原位 杂交技术（OPTIR-FISH），也称为中红外光热-FISH（MIP-FISH），可用于鉴定单个细胞并研究其代谢活动。该方法具有广泛适用性，可用于多种应用，包括以单细胞分辨率绘制细胞代谢图谱。
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方法文章
光学光热红外-荧光原位杂交（OPTIR-FISH）
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
理解复杂群落中单个细胞的代谢活动对于揭示其在人类疾病中的作用至关重要。本文介绍了一种综合实验方案，利用OPTIR-FISH平台结合rRNA标记的FISH探针与同位素标记底物，实现细胞鉴定与代谢分析的同步进行。荧光成像通过rRNA标记的FISH探针的特异性结合实现细胞鉴定，而OPTIR成像则通过同位素诱导的OPTIR光谱红移，提供单细胞水平的代谢活性信息。该方法适用于与同位素标记底物共同培养的细菌 13C-葡萄糖作为实验平台，本方案概述了微生物培养结合同位素标记与荧光检测的方法 原位 杂交（FISH）、样品制备、OPTIR-FISH成像系统的优化以及数据采集。我们还展示了如何以高通量方式在单细胞水平上进行图像分析并解读光谱数据。该方案具有标准化和详细的特点，将极大促进来自单细胞代谢研究领域不同背景和学科的研究人员对其进行采用。
引言
细胞代谢是细胞生物学的基础支柱之一，调控着决定细胞健康、功能及其与环境相互作用的诸多过程。在单细胞水平上，尤其是在原生环境中分析代谢活动，可提供宝贵的见解，揭示生物系统中复杂且异质性的生物学行为。1这一点在微生物研究中尤为关键，因为许多微生物具有独特的生长需求或环境依赖性，这对传统的培养方法构成了挑战。2例如，某些物种可能需要特定的营养成分或共生关系，而这些条件在实验室环境中难以复制，因此无法通过标准技术进行培养。3此外，某些物种的培养需要较长时间，这为微生物学研究带来了重大挑战，往往超出了研究和分析的实际时间范围。为了克服这些限制，可采用聚合酶链式反应和荧光技术等替代方法 原位 杂交（FISH）技术能够在无需培养的情况下实现微生物物种的鉴定4，能够实现对微生物生态系统的更精确和更全面的观察。然而，这些分析技术缺乏阐明细胞代谢的能力。这一局限凸显了微生物学领域持续存在的挑战：即在单细胞水平上同时区分细胞身份并阐明其代谢活动。成像质谱技术（IMS）与稳定同位素联用等方法的进展，已成为进行单细胞代谢分析的有力工具。5在这些实验中，细胞与含有同位素的底物共同孵育，例如 13C 或 15新合成的生物分子携带这些同位素，从而在质荷比（m/z）谱....
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方案
本研究中细菌样本的使用遵循波士顿大学机构审查委员会（IRB）和美国国立卫生研究院的指导方针。
注意：本方案所遵循的一般工作流程详见图2。
1. 细菌培养与同位素标记（图 2A）
注意：此处给出的示例适用于标记纯细菌培养物。若将本方案应用于多微生物群落，必须根据具体群落及目标生物体的生理特性调整培养基和标记时间。
- 从单个菌落接种目标菌株，并在营养丰富的培养基（如胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）或Luria-Bertani肉汤（LB））中预培养3小时，使其进入对数生长期（log期）。本方案以大肠杆菌（E. coli）BW25113为例。
注意：不同菌株达到对数生长期所需时间各异，应根据具体菌株调整培养时间。 - 测定600 nm处的光密度以估算细菌浓度。
- 准备添加同位素标记底物的最低培养基。对于E. coli BW25113，可在M9最低培养基中添加终浓度为0.2%（w/v）的13C-葡萄糖。
注意：13C-葡萄糖（D-葡萄糖....
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结果
通过OPTIR-FISH实现单细胞微生物代谢分析并结合遗传学鉴定的通用工作流程如图2所示。图3展示了体现OPTIR单细胞代谢成像能力的代表性结果。本示例使用了在12C-或13C-葡萄糖中孵育24小时的大肠杆菌（E. coli）细胞。13C掺入蛋白质已被证明会导致蛋白质酰胺I带和II带发生显著的红移现象（图3A）17,18。因此，选取了代表12C-蛋白质（1656 cm-1，正常酰胺I带）和13C-蛋白质（1612 cm-1，位移后的酰胺I带）的这两个关键波数，并采集了在这些波数下的OPTIR图像。同时展示了相应的明场图像以显示细胞形态（图3B
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讨论
本文介绍了一种应用OPTIR-FISH平台在单细胞水平上同时鉴定微生物种类并定量其代谢活性的详细实验方案。关键步骤包括使用稳定同位素标记培养以研究特定的代谢活动，以及通过荧光原位杂交技术鉴定目标微生物种类。可在同一台显微镜上依次进行多通道荧光成像和在选定波数下的OPTIR成像。我们展示了如何对这些图像进行定量分析，以揭示复杂群落中不同物种的代谢活性水平。该方案特别适用于在天然环境中研究复杂群落内多种物种的代谢活动。
此处以细菌为例，但该方案也可适用于其他生物体，如真菌和哺乳动物细胞。一个关键点是在不含正常对应物的培养基中添加目标代谢过程的振动探针。例如，若研究来自脂肪酸的脂质代谢，应将叠氮标记的脂肪酸添加到由去脂胎牛血清（FBS）组成的常规培养基中，因为脂肪酸原本来源于FBS。此外，孵育时间还需与不同真菌或哺乳动物细胞的生长速率相匹配。这既能保证细胞的正常生长，又能最大限度地提高振动探针对目标大分子的标记效率。
本文所述方案还可用于研究除葡萄糖合成蛋白质以外的其他代谢过程。所有主要的生物大分子，包括蛋白质、脂.......
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披露
Y.B. 是 Photothermal Spectroscopy Corp. 的兼职顾问。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院资助，项目编号为R35GM136223、R01AI141439，授予J.X.C.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96% 乙醇 | ThermoScientific | T032021000 | |
| 氟化钙 | Crystran | CAFP10-0.35 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| D-葡萄糖 (U-13C6, 99%) | Cambridge Isotopic Laboratories | CLM-1396-1 | |
| 乙二胺四乙酸 | Sigma-Aldrich | E9884-100G | |
| 甲酰胺 | ThermoScientific | 17899 | |
| LB 培养基 | Sigma-Aldrich | L3522-250G | |
| M9 最小盐溶液 5× | SIGMA | M6030-1KG | |
| OPTIR 仪器 | Photothermal Spectroscopy Corp. | mIRage LS | |
| 4% 多聚甲醛溶液（溶于 PBS） | ThermoScientific | J19943-K2 | |
| 聚-L-赖氨酸溶液 0.1% (w/v) | Sigma-Aldrich | P8920-500ML | |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma-Aldrich | L3771-25G | |
| 三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，99+% | ThermoScientific | A11379.18 | |
| 胰蛋白胨大豆肉汤 | Sigma-Aldrich | 22092-500G |
参考文献
- Evers, T. M. J., et al. Deciphering metabolic heterogeneity by single-cell analysis. Anal Chem. 91 (21), 13314-13323 (2019).
- Overmann, J., Abt, B., Sikorski, J. Present and future of culturing bacteria. Annu Rev Microbiol. 71, 711-730 (2017).
- Epstein, S.
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重印与许可
