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方法文章

活体小鼠肺移植的双光子显微成像

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DOI：

10.3791/66566

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2024年4月19日

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1Division of Cardiothoracic Surgery, Washington University in St. Louis, 2Division of Thoracic Surgery, University of Maryland, 3Division of Infectious Diseases, Washington University in St. Louis

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用双光子显微镜对移植的小鼠左肺进行活体成像的实验方案。该方法为实时研究小鼠肺移植后细胞动态变化及细胞间相互作用提供了有力工具。

摘要

肺移植术后并发症在很大程度上与宿主免疫系统对移植物的反应有关。此类免疫反应由供体与受体细胞之间的相互作用所调控。深入理解这些过程依赖于临床前动物模型的应用，并得益于实时观察移植物内免疫细胞迁移的能力。活体双光子显微镜可用于对组织和器官进行成像，成像深度可达数百微米，且光损伤极小，相比单光子共聚焦显微镜具有显著优势。在活体双光子显微成像过程中，选择性地使用启动子特异性表达荧光蛋白的转基因小鼠，和/或过继转移荧光染料标记的细胞，可实现对生理环境下单个细胞动态行为的研究。我们课题组已建立一种稳定小鼠肺组织的技术，使我们能够在未受刺激的肺组织及原位移植的肺移植物中进行细胞动态成像。该技术可详细评估血管系统和间质内细胞的行为，并可用于研究不同细胞群体之间的相互作用。该方法易于掌握，可广泛应用于研究调控肺移植后炎症反应与耐受性反应的免疫机制，也可进一步拓展至其他肺部疾病病理过程的研究。

引言

肺移植是许多终末期肺部疾病患者的最终治疗选择；然而，与其他实体器官移植相比，肺移植后的长期生存率较差。移植后5年的生存率仅为约60%-70%1，而心脏移植为80%-90%2，肾移植为85%-90%3。肺移植后的多种并发症，例如原发性移植物功能障碍、抗体介导的排斥反应以及慢性肺移植物功能障碍，均源于宿主对同种异体移植物的免疫反应。例如，我们的研究团队已证实，在移植引起的缺血-再灌注损伤后，中性粒细胞会迅速被招募至肺移植物内，并在血液单核细胞周围形成动态簇集结构4。供体与受体细胞之间的相互作用导致有害的同种免疫反应5,6,7，而能够在活体动物模型中研究这些动态细胞相互作用具有重要价值。

双光子显微镜能够在组织光漂白最小化的情况下，实现高达数百微米深度的高分辨率活体成像8,9。该技术已广泛应用于多种组织和解剖部位，包括新皮层10,11、皮肤12,13和肾脏14,15。近年来，该技术也被应用于肺和心脏等非静态器官4,16,17。在本实验方案中，我们描述了一种在小鼠原位左肺移植后，对已稳定、通气且灌注的肺移植物进行成像的技术。移植模型的一个关键优势在于可分别对供体和受体进行遗传学操作。通过表达荧光蛋白的转基因小鼠品系、过继性转移荧光标记细胞5，或静脉注射荧光标记抗体以结合细胞特异性标志物4,16,17,18，均可实现对特定细胞群体的可视化观察。

为了在成像过程中稳定肺组织，本方案涉及将肺组织粘附于盖玻片上；而其他研究团队则描述了使用定制的可逆真空装置进行负压固定的稳定方法19。我们的方案具有多项优势，包括可实现更大范围的成像区域，以及利用显微镜实验室中常见的材料（如盖玻片和胶水）相对简便地完成装置搭建。由于该粘附技术在肺组织上表面施加固定，预期可减少呼吸运动带来的干扰，从而实现更深层的成像。这种活体成像技术能够实时详细观察免疫细胞的行为及其相互作用，有助于研究肺移植后调控炎症反应与耐受性免疫反应的免疫机制。

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方案

所有动物操作程序均遵循美国国立卫生研究院《实验动物的护理和使用指南》，并经华盛顿大学医学院机构动物护理和使用委员会批准。

1. 麻醉与插管

注意：正位小鼠左肺移植操作如前所述20,21。将20-25 g的C57BL/6（B6）小鼠的肺移植至性别和年龄相匹配的B6受体小鼠。在部分实验中，使用B6.LysM-GFP报告基因小鼠作为受体，以可视化中性粒细胞向肺移植物的浸润。受体小鼠在肺移植后可立即进行成像观察。

  1. 通过腹腔注射氯胺酮（80−100 mg/kg）和赛拉嗪（8−10 mg/kg）使小鼠重新麻醉。皮下注射缓释丁丙诺啡（0.5-1.0 mg/kg）以进一步控制疼痛。通过足垫夹捏试验确认麻醉深度。
    注意：如果肺移植与计划的活体成像之间的时间间隔少于两小时，可给予初始剂量50%的氯胺酮追加麻醉。
  2. 使用电动剪刀去除整个左侧胸部的毛发，并擦拭胸部以清除剪下的多余毛发。
  3. 将不含药物的眼科软膏涂抹于小鼠眼睛，以防角膜干燥。
  4. 如前所述21，使用20 G套管针经口进行气管插管。
  5. 以每分钟120次呼吸频率、0.5 cc潮气量的空气进行通气。
  6. 在整个操作过程中经气管输送1%异氟烷。
  7. 为在成像过程中可视化血管，成像前至少5分钟经静脉注射20 µL 655 nm非靶向量子点（q-dots）溶于50 µL磷酸盐缓冲液中。

2. 左肺成像的手术准备

  1. 将小鼠置于右侧卧位（参见 图1A).
  2. 用0.75%碘液和70%乙醇的混合液对胸部皮肤消毒三次。
  3. 通过第三肋间重新打开左侧开胸切口（见小鼠肺移植） 图1A).
  4. 切除左侧开胸部位的部分皮肤和软组织，大小为1.5 cm × 1.5 cm（参见 图1B).
  5. 在肋骨切除前，先用血管钳夹住肋骨约10秒，以使任何微小血管血栓形成，从而实现止血（参见 图1C，D).
  6. 切除3的部分rd 至 5th 肋骨以创建足够大的成像窗口，以便取出肺组织（约0.8 cm cranio-caudally 和约1.0 cm antero-posteriorly） 图 1D，E).
  7. 使用电凝止血法停止肋骨边缘的任何额外出血。
    注意：必须对肋骨切缘实现止血，以避免在成像期间发生大量失血。
  8. 在右侧胸部下方放置一个小垫块（将 4 cm × 4 cm 纱布纵向折叠 3 次）（见 图1E).
  9. 使用棉签将肺移植物从胸腔中抬起，并将其下部置于一条 1 cm × 3 cm 的生理盐水浸湿纱布上（参见 图1F).
    注意：此条浸有生理盐水的纱布可防止肺组织滑动，为肺提供湿润环境，保护肺组织免受切除后肋骨锐利边缘的损伤，并隔离心脏运动对肺的影响。当环形成像腔安装至肺表面后（图1G，H在第3节所述的情况下，成像期间开放的胸腔应尽量减少热量和液体的流失。

3. 成像室制备

注意：成像室为定制装置（见图2A）。该成像室由底板和顶板组成，小鼠置于两板之间，并通过两侧带弹簧的螺栓固定（图2B）。顶板中央有一个直径约2 cm的圆形开口。在顶板正面的该开口内放置一个尺寸匹配的黑色O型圈，用于保护物镜（图2C）。使用高真空油脂将一块24 mm × 50 mm的盖玻片粘附在顶板背面，以形成防水密封。该盖玻片将作为成像窗口，其下方紧贴肺组织，上方容纳成像介质（即水）。确保真空油脂不进入圆形成像窗口区域。每次新的成像实验均需更换新的盖玻片。使用热电偶温度探针将底板加热至35–37 ˚C（图2A）。

  1. 将已插管的小鼠放置于成像室底板上，使其左侧开胸面朝上（见图1G，H）。用丝带固定小鼠的面部、前肢和尾部（见图1H和图2A）。
  2. 在连接于顶板的盖玻片底面涂胶（见图2C底部的灰色圆圈），中心保留一个直径0.8–1.0 cm的无胶区域。
    注意：无胶区域的大小与运动伪影程度之间存在权衡；因此建议该区域直径不超过1.0 cm。
  3. 缓慢下压顶板，使盖玻片接触肺组织，并让胶水接触肺表面（见图1G）。
    注意：左肺将被粘附在盖玻片上，中间形成一个清洁的无胶圆形区域，该区域即为成像区域。
  4. 将盖玻片紧贴肺组织，并充气膨胀肺部1–2秒，使胶水区域牢固粘附周围组织。可通过阻断小鼠气管插管与呼吸机之间的出气管路来实现肺部膨胀。
    注意：肺部充气时间不应超过1–2秒，以免造成过度的气压伤。
  5. 轻微抬高顶板，以减少对肺组织的压力。确保成像窗口内的肺组织在通气过程中无移动。
  6. 通过拧紧每个螺栓上的手拧螺母，固定顶板两端（见图2B）。

4. 双光子成像

注意：使用带有20倍或25倍物镜的固定载物台直立显微镜 >应使用数值孔径（NA）为1.0的水浸物镜进行活体显微成像。以下为本研究中用于B6至B6.LysM-GFP左肺移植并结合655 nm量子点标记血管的实验设置。在应用本方案时，可根据具体实验需求及所使用的荧光报告分子，调整显微镜、激光器和二向色滤光片的配置。

  1. 将带有插管受体小鼠（B6左肺移植到B6.LysM-GFP并标记655 nm量子点）的完整成像室放置于显微镜载物台上（见图2A）。
  2. 使用波长为480 nm、560 nm和635 nm的二向色滤光片，以适当分离GFP报告基因、量子点以及胶原蛋白产生的二次谐波（SHG）信号（445 nm）。可根据具体实验调整这些滤光片。
    注：胶原蛋白产生的SHG信号呈现出深色火山口样结构，代表肺泡气腔（见图3中的白色箭头）。
  3. 将钛蓝宝石飞秒脉冲激光器设置为890 nm（近红外范围）进行激发。使用尽可能低的激光功率以获得足够的信号。
    注：应根据具体实验调整激光参数，以最大化信号分离效果。
  4. 在顶板的盖玻片上加入约1 mL水，使其完全覆盖盖玻片，水将由O型圈及盖玻片与顶板之间的真空密封脂固定（见图1G和图2C）。
  5. 在显微镜上使用20倍>1.0 NA的水浸物镜。应根据具体实验选择合适的物镜。
    注：数值孔径（NA）越大，可收集更多光线，获得更高对比度和更详细的图像。优先选用水浸物镜，因为水或缓冲液与生物组织的兼容性更好。
  6. 将显微镜物镜浸入水中，并对准肺表面进行聚焦。
  7. 启动底板加热装置，并将温度维持在35–37 ˚C。
    注：若担心无法维持组织温度或肺部灌注不足，可在底板加热的基础上额外连接两个电阻加热顶板（见补充图1）。
  8. 使用选定的图像采集软件获取图像序列。
    注：采集过程中应确保房间完全黑暗，可能需要使用遮光窗帘/百叶窗，并妥善遮蔽所有光源。

5. 视频采集

注意：以下参数可根据具体实验进行调整。步骤 5.1-5.3 描述了用于 B6 到 B6.Lysm-GFP 小鼠左肺移植的具体参数，可作为参考指南。

  1. 使用视频速率双向扫描器，将 x-y 扫描尺寸设置为 512 × 512 像素。
  2. 使用 xyz 步进装置，对 21 步 z-堆栈进行时间推移记录，每步进行 10 帧平均。每个堆栈的采集时间约为 20 秒，包括帧平均所需时间、步进电机移动并校验位置的时间，以及 100 毫秒的延迟。
    注意：本研究中使用的显微镜上的双向扫描器以 30 帧/秒的视频速率运行。具体数值可能因显微镜配置不同而有所差异。
  3. 连续采集 80 个 z-堆栈，以获得白细胞在组织实质内迁移的时间推移成像。以每堆栈 20 秒的速度采集，总时长约 27 分钟。
    注意：应尽量减少堆栈尺寸、帧平均次数、激光功率以及时间推移记录的总时长，以避免组织受到过度激光照射。如果所用荧光报告分子较亮（例如 GFP）且激光功率较低，则以 20 秒间隔重复采集 21 步 z-堆栈（每步 10 帧平均，扫描分辨率为 512 × 512 像素），持续约 27 分钟，小鼠对此耐受良好。若需更长时间成像，应增加每个堆栈的采集时间，以保持总激光暴露量不变（例如，每个堆栈采集 1 分钟，总时长约 1.5 小时）。这些参数需根据所用荧光报告分子进行优化。
  4. 图像采集结束后处死小鼠。处死方法为：先使用氯胺酮（80−100 mg/kg）和赛拉嗪（8−10 mg/kg）麻醉小鼠，随后进行颈椎脱位。典型的成像准备可轻松维持小鼠存活达 2 小时。
    注意：若需延长此时间，可能需要额外补充液体、使用异氟烷进行麻醉，并注意体温调节。
  5. 使用 Imaris 完成视频渲染。也可使用其他成像软件（如 ImageJ）。
    注意：采集后的图像可进行后期处理，包括对比度增强、平滑处理和通道算术运算，以消除通道串扰。

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结果

在4 ˚C下冷缺血保存1小时后，我们将B6小鼠的左肺原位移植到B6.LysM-GFP小鼠体内4，随后按照上述方法进行活体双光子成像。我们在移植后两个时间点进行了成像：2小时（图3A）和24小时（图3B）。血管通过成像前立即注射的量子点标记为红色。此外，我们可以在24小时时间点观察到摄取量子点的单核细胞4。在移植后24小时的相应视频中，可见绿色标记的受体来源中性粒细胞浸润肺移植物（补充视频1）。由于胶原蛋白的二次谐波信号，肺泡呈现为暗色的火山口状结构（图3中的白色箭头所示）。我们观察到，与移植后2小时相比，移植后24小时肺组织中的中性粒细胞数量更多（图3）。

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讨论

双光子激发最早由玛丽亚·格佩特-梅耶（Maria Göppert-Mayer）于1931年在其博士论文中描述，她后来因提出原子核壳层结构而获得诺贝尔物理学奖22,23。传统的荧光显微技术依赖于单光子激发，其激发光波长较短、能量高于发射光波长。与单光子显微技术不同，双光子显微技术涉及两个光子同时激发，每个光子的波长均长于所发射荧光信号的波长24,25,26。由于需要两个独立的光子共定位以激发组织中的单一焦点，双光子激发在空间上局限于微小的样品体积，从而实现光学切片24,25,26，并且在焦点所在平面的上方和下方光漂白效应更弱

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披露

作者声明无相关利益冲突。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）1P01AI11650 项目基金和巴恩斯-犹太医院基金会资助。我们感谢华盛顿大学医学院体内成像核心设施的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.75% 聚维酮碘AplicareNDC 52380-0126-2用作消毒剂
1英寸 20G 静脉导管TerumoSROX2025CA用于气管插管（ETT）
1英寸丝质胶带Durapore3M ID 7100057168用于固定小鼠位置
20倍水浸长工作距离物镜OlympusN20X-PFH
3M Vetbond 胶水Medi-Vet.com10872用于将盖玻片粘附至肺组织
655 nm 非靶向量子点ThermoFisherQ21021MP用于血管标记
70% 乙醇Sigma AldrichEX0281用作消毒剂
Argent 高温精细尖 cautery 笔McKesson231
黑色 O 形圈（2 cm）五金商店N/A用于自制成像腔室
螺栓（2 个）五金商店N/A用于自制成像腔室
黄铜手拧螺母（2 个）五金商店N/A用于自制成像腔室
丁丙诺啡 1.3 mg/mLFidelis Animal HealthNDC 86084-100-30用于镇痛
Chameleon 钛宝石飞秒脉冲激光器CoherentN/A
盖玻片（24 mm × 50 mm）Thomas Scientific1202F63用于自制成像腔室
弯蚊式钳（1 把）Fine Science Tools13009-12
双通道加热控制器Warner InstrumentsTC-344B
精细剪刀（1 把）Fine Science Tools15040-11
固定式直立显微镜OlympusBX51WI
纱布（裁剪为 1 cm × 3 cm）McKesson476709置于左肺下方
高真空润滑脂Dow CorningN/A用于将盖玻片粘附至顶板
1% 异氟烷Sigma Aldrich26675-46-7用于麻醉
盐酸氯胺酮 100 mg/mLVedcoNDC 50989-996-06用于麻醉
金属片（3 cm × 7 cm）五金商店N/A用于自制成像腔室
尖头棉签Solon56225用于操作肺组织及钝性分离
Power Pro Ultra 电推剪Oster078400-020-001
Puralube Vet 眼用软膏Medi-Vet.com11897用于防止眼睛干燥
小型动物呼吸机Harvard Apparatus55-0000
直型镊子（1 把）Fine Science Tools91113-10
三通道快门驱动器UniblitzVMM-D3共振扫描器
x.y.z 光学步进电机Prior ScientificOptiScan II
赛拉嗪 20 mg/mLAkornNDC 59399-110-20用于镇痛

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