本研究介绍了一种用于估算运动单元数量和大小的体内方法，以定量评估大鼠膈肌运动单元的连接情况。文中详细描述了这些技术的逐步操作流程。
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方法文章
评估大鼠膈肌运动单位连接性结局指标作为膈神经运动神经元变性与代偿的定量生物标志物
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
呼吸肌功能丧失是运动神经元损伤和神经退行性变的结果（例如，分别对应颈段脊髓损伤和肌萎缩侧索硬化症）。膈神经运动神经元是中枢神经系统与肌肉之间的最终连接环节，其相应的运动单位（由单个运动神经元支配的一组肌纤维）代表了神经肌肉呼吸系统的最小功能单位。复合肌肉动作电位（CMAP）、单个运动单位电位（SMUP）和运动单位数量估计（MUNE）是已建立的电生理方法，可用于在动物模型中随时间纵向评估运动单位的完整性，但这些方法主要应用于肢体肌肉。因此，本研究的目的是描述一种可在临床前啮齿类动物研究中纵向应用的方法，用于量化膈神经MUNE、运动单位大小（以SMUP表示）和CMAP，并进一步在运动神经元丢失模型中验证这些方法的应用价值。对于运动神经元损伤及相关疾病中的神经元损伤、退变与再生，若能获得敏感、客观且具有转化意义的生物标志物，将显著促进并加速从实验研究发现向临床试验的转化。
引言
膈运动神经元（MNs）起源于C3至C6肌节水平，构成从中枢神经系统（CNS）到膈肌的最终通路1。膈运动单位（MUs）由单个脊髓运动神经元及其所支配的膈肌纤维组成，是呼吸神经肌肉系统的最小功能单位。通气功能依赖于膈肌的充分收缩，而这种收缩是通过膈运动单位池的协调激活实现的2,3。许多神经系统疾病（包括肌萎缩侧索硬化症（ALS））会导致严重的通气功能障碍，最终成为致死原因4。
有多种电生理方法可用于在活体中评估和监测运动单位（MU）池的完整性。in vivo条件下，复合肌肉动作电位（CMAP）反映了在周围神经刺激后，特定肌肉或肌群中所有肌纤维去极化的总和，且对多种神经肌肉疾病具有敏感性，包括肌萎缩侧索硬化症（ALS）5,6和脊髓性肌萎缩症（SMA）7,8,9。CMAP评估的一个局限性在于，侧支芽生可能导致即使在运动单位丢失的情况下，CMAP的波幅和面积....
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方案
所有操作均经密苏里大学机构动物护理和使用委员会批准，并遵循其制定的指南进行。实验采用11至15周龄的成年雄性Sprague-Dawley大鼠。这些大鼠每两只同笼饲养，维持12小时光照与12小时黑暗的循环周期，并可随时获取标准商用颗粒饲料和经盐酸处理的饮水。
1. 动物准备与麻醉给药
- 操作大鼠时应穿戴适当的个人防护装备。
- 使用3-5%异氟烷进行吸入麻醉，确保充分诱导。当大鼠被充分麻醉后，将其置于仰卧位，并以1-3%吸入异氟烷维持麻醉状态。用镊子轻轻按压后肢足垫，检查是否存在回缩反应，以确认麻醉深度是否足够。
注意：根据大鼠的体型和体重，监测麻醉深度，并相应调整异氟烷浓度。 - 使用恒温加热板维持体温在37 °C，以防止温度波动影响复合肌肉动作电位（CMAP）的波幅和潜伏期。
- 在眼部涂抹兽用石油基眼膏，防止角膜干燥。通过观察呼吸频率以及用镊子按压足垫时是否有回缩反应，来监测麻醉深度。
- 使用剪毛器去除胸部和颈部待检测区域下三分之一处的毛发。在整个实验过程中持续监测大鼠的呼吸情况。
注意：在完成复合肌肉动作电位（CMAP）和运动单位数目估计（MUNE）记录并停止麻醉后，不得在大鼠未完全恢复意识前离开看护。在大鼠完全恢复前，不得将其放回饲养笼中。
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结果
本报告中所述的CMAP、SMUP和MUNE技术可利用微创电极放置方法记录膈肌的神经肌肉功能（图1）。可通过幅值和面积参数来表征超最大CMAP的大小，从而对肌群输出进行整体评估（图2）。然而，在当前方法中，我们依赖幅值来量化CMAP和SMUP的大小。CMAP、SMUP和MUNE可用于在多种大鼠神经肌肉疾病模型中测量神经肌肉功能。为展示运动神经元变性背景下运动单位的丢失情况，实验组大鼠接受双侧胸膜内注射CTB-SAP（25 µg）以靶向膈神经运动神经元，并额外注射游离CTB（25 µg）；对照组大鼠则注射未结合的CTB（25 µg）和SAP（25 µg）1,27。
在图3中，比较了成年对照大鼠与成年大鼠（12周龄）胸膜内注射CTB-SAP后7天的结果。胸膜内注射CTB-SAP后，CTB-SAP.......
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讨论
在运动神经元（MN）变性疾病（如肌萎缩侧索硬化症，ALS）中，评估参与呼吸功能的运动单位（MUs）至关重要28。尽管ALS患者中存在呼吸运动神经元变性现象，但运动神经元死亡的具体起始时间及进展过程仍尚未完全阐明29,30,31。鉴于这一问题的重要性，研究人员已采用多种模型来模拟神经退行性疾病动物模型中的呼吸功能障碍，包括基于遗传因素的模型（如SOD12,32）和非遗传因素的模型（如胸膜内注射CTB-SAP3,27,33）。因此，识别可用于诊断、监测及评估潜在治疗效果的生物标志物，将有助于这些模型的研究。此.......
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披露
WDA 已从 NMD Pharma 和 Avidity Biosciences 获得研究经费，并从 NMD Pharma、Avidity Biosciences、Dyne Therapeutics、Novartis、Design Therapeutics、Catalyst Pharmaceuticals 和 Novartis 获得咨询费。
致谢
本研究由密苏里州脊髓损伤/疾病研究计划（Missouri Spinal Cord Injury/Disease Research Program）的脊髓损伤/疾病研究项目资助（NLN 和 WDA）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2 mL 玻璃注射器 | Kent Scientific Corporation | SOMNO-2ML | |
| 50 mL，型号 705 RN 注射器 | Hamilton Company | 7637-01 | 用于进行胸膜腔内注射 |
| 5008 - Formulab 饲料 | LabDiet | 0001325 | |
| 可高压灭菌的 26 G 针头（26S RN 9.52 mm 40°） | Hamilton Company | 7804-04 | 用于进行胸膜腔内注射 |
| 霍乱毒素 B 亚基（CTB） | MilliporeSigma | C9903 | 用于胸膜腔内注射以标记存活的运动神经元 |
| 与皂苷毒素偶联的霍乱毒素 B 亚基（CTB-SAP） | Advanced Targeting Systems | IT-14 | 用于胸膜腔内注射以诱导运动神经元死亡 |
| 可拆卸电缆 | Technomed | 202845-0000 | 用于连接记录电极与电诊断仪器 |
| 一次性 2" x 2" 带导线圆盘电极 | Cadwell | 302290-000 | 接地电极 |
| 一次性单极针电极 28 G | Technomed | 202270-000 | 阴极和阳极刺激电极 - 记录电极 |
| 肌电图针电极电缆（放大/刺激切换盒） | Cadwell | 190266-200 | 用于将单极电极连接至电诊断刺激器 |
| 带铁底座的帮手鳄鱼夹 | Radio Shack | 64-079 | 用于固定记录电极位置 |
| 异氟烷（250 mL 瓶装） | Piramal Healthcare | ||
| monoject 弯头冲洗注射器 | Covidien | 81412012 | 用于涂抹电极凝胶 |
| PhysioSuite 生理监测系统，配备 RightTemp 恒温加热装置 | Kent Scientific Corporation | PS-RT | 包含红外加热垫、直肠探头和垫温探头 |
| Pro 修剪器宠物美容套装 | Oster | 078577-010-003 | 用于脱毛的剪毛器 |
| 皂苷毒素（SAP） | Advanced Targeting Systems | PR-01 | 用于胸膜腔内注射（单独注射时作为对照试剂） |
| Sierra Summit 肌电图系统 | Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA | 便携式电诊断系统 | |
| SomnoSuite 低流量数字麻醉系统 | Kent Scientific Corporation | SOMNO | 包含防溢、防蒸气瓶顶适配器；Y 型适配管；活性炭吸附过滤器 |
| Sprague-Dawley 大鼠 | Envigo colony 208a, Indianapolis, IN | ||
| 兽用石油基眼用软膏 | Puralube | 26870 | 麻醉期间使用以防止角膜损伤 |
参考文献
- Mantilla, C. B., Zhan, W. -Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
- Nichols, N. L., Satriotomo, I., Harrigan, D. J., Mitchell, G. S. ....
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重印与许可
