该方案介绍了两种改进厌氧肠道细菌分离的方法。第一种方法侧重于利用不同的培养基分离多种多样的细菌。第二种方法则专注于特定微生物类群的培养步骤，该类群可能具有代谢肌醇的能力。-肌醇，以全面理解其生态学意义。
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摘要
摘要
鸡的胃肠道（GIT）是一个复杂的生态系统，栖息着数以万亿计的微生物，这些微生物在宿主的生理功能、消化、营养吸收、免疫系统成熟以及抵御病原体入侵方面发挥着关键作用。为了实现动物的最佳健康与生产性能，明确这些微生物的特征并理解其功能至关重要。尽管家禽胃肠道蕴藏着大量具有潜在益生菌应用价值的微生物，但其大部分多样性仍未被充分探索。为了加深对未培养微生物多样性的认识，迫切需要系统性努力将这些微生物成功培养。分离和培养定植于胃肠道的微生物可获得可重复的实验材料，包括细胞、DNA 和代谢产物，从而为环境中的代谢过程提供新的见解。若缺乏培养手段，这些微生物在自然环境中的功能将仍不明确，仅能停留在描述性层面。我们的目标是实施一系列培养策略，旨在提高从鸡胃肠道中分离多种厌氧微生物的效率，综合运用动物生理学、动物营养学、宏基因组学、饲料生物化学以及现代培养技术等多学科知识。此外，我们还致力于规范采样、运输和培养基制备等关键操作流程，这些环节已被证实显著影响分离成功率。适当的方法学应确保持续无氧环境、最佳气体条件、适宜的宿主孵化温度，并根据各类微生物的特异性需求提供相应的营养支持。遵循这些方法不仅可实现可重复的分离结果，还将优化分离流程，从而促进对鸡胃肠道内复杂微生物生态系统的全面理解。
引言
在研究微生物时，培养技术的复兴补充了宏基因组学研究所提供的见解，为检验此前仅被部分描述和定量的代谢假设提供了实验材料。肠道细菌的培养为持续研究微生物与宿主之间的相互作用提供了资源，有助于开展靶向定植研究，并提升分子相互作用研究的水平1,2,3。关于胃肠道微生物的知识进步已通过影响饲料配方和提高营养物质的可利用性，改善了动物营养与福利4。这一理解也促进了益生元与益生菌相互作用应用效果的提升。然而，要全面了解生化与理化条件如何相互作用并影响微生物群落的组成及其结构，仍需深入研究。为实现这一目标，微生物培养仍然不可或缺，是深入探究胃肠道环境中微生物群落复杂动态的关键工具。
与大量关于人类肠道微生物及临床培养研究的文献相比5，针对家畜来源微生物的研究主要使用有限种类的培养基进行分离，这可能限制了所获得菌株的多样性2,3。此外，培养基配方的优化以及磷酸盐和盐类与琼脂相互作用的研究（由Tanaka等人和Kawasaki等人阐明）迄今尚未应用于肠道微生物组研究中
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方案
该实验方案分为四个部分：取样、细菌分离、鉴定以及所获得微生物的保藏。动物使用许可已由德国图宾根区政府伦理委员会批准，批准编号为 HOH50/17 TE 和 HOH67-21TE。
1. 获取用于培养厌氧菌的样本
- 动物的饲养与管理
- 维持动物在 随意摄取 商品化玉米基饲料（Legehennen/Junghennenfutter；参见 材料表）并饲养于霍恩海姆大学试验站。
- 转运溶液的制备
- 在采样前1至2天，准备含有1.00 g/L硫代乙醇酸钠、0.10 g/L二水合氯化钙（CaCl₂）、0.10 g/L氯化铁（FeCl₃）、0.10 g/L氯化镁（MgCl₂）、0.10 g/L氯化钾（KCl）、0.10 g/L氯化锰（MnCl₂）、0.10 g/L硫酸镁（MgSO₄）、0.10 g/L磷酸二氢铵（NH₄H₂PO₄）、0.10 g/L磷酸氢二铵（(NH₄)₂HPO₄）、0.10 g/L硫酸亚铁（FeSO₄）、0.10 g/L柠檬酸铁（FeC₆H₅O₇）、0.10 g/L L-半胱氨酸、0.10 g/L酵母提取物、0.10 g/L蛋白胨、0.10 g/L葡萄糖、0.10 g/L抗坏血酸、0.10 g/L半胱氨酸、0.10 g/L谷胱甘肽、0.10 g/L还原型谷胱甘肽、0.10 g/....
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结果
运输过程中厌氧条件的监测
由于添加了刃天青钠，若在将样本转移至试管前，运输溶液颜色变为粉红色，则表明厌氧条件的维持已受到破坏或失效。因此，在运输过程中应避免使用出现颜色变化的试管，仅使用未发生颜色变化的试管，如图2所示。
测序结果分析
对于色谱图数据存在过高背景噪音、基线紊乱、信号强度低的峰、单个位置出现多个或重叠峰以及峰高不一致的分离菌株，需使用新鲜且纯净的培养物重新进行DNA提取，因为这些现象表明样本可能存在污染、扩增不均或测序过程中出现问题。在NCBI中进行BLAST比对时，选择显示最高序列相似性百分比和较高查询覆盖度的菌株作为与本研究分离株相关的菌株，从而实现对分离株的鉴定。
多种厌氧菌的培养
通过分离获得的厌氧菌在五种分别制备和灭菌的培养基中产生了600多个分离株。利用16S rRNA基因进行鉴定，共鉴定出15个不同的细菌属（
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讨论
本方法的目的是通过改善采样条件、样品处理以及培养基的配制和制备，提高厌氧肠道细菌的培养效果。在配制培养基时，必须考虑样品的理化条件（如pH值、碳源、氮源和辅因子的可利用性）。与来自猪、人或小鼠的细菌培养物收集相比1,26,27 ，有关鸡源培养基选择的报道相对较少，甚至对于粪便和盲肠等高关注度部位的研究也可能被低估2,28。因此，本研究所采用的培养基配制与制备方案提供了80种不同的培养条件，旨在覆盖其他研究中通过测序方法所报道的微生物的代谢需求29,30,31。
除了培养基的选择和添加成分.......
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披露
作者声明，他们不存在与本稿件所报告工作相关的任何竞争性财务或个人利益。
致谢
作者感谢雷霍沃特-霍亨海姆合作项目以及德国研究基金会（DFG）SE 2059/7-2项目的支持。本项目是研究单元P-FOWL（FOR 2601）的一部分。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙酸 | VWR | 20104.334 | |
| 琼脂 | VWR | 97064-332 | |
| 氯化铵 | Carl Roth | P726.1 | |
| 厌氧工作站 | Don Whitley Scientific | A35 HEPA | |
| 丁酸 | Merck | 8.0045.1000 | |
| 二水合氯化钙 | VWR | 97061-904 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5424R | |
| 鸡溶菌酶（胞壁质酶） | VWR | 1.05281.0010 | |
| 半胱氨酸 | VWR | 97061-204 | |
| 葡萄糖 | VWR | 90000-908 | |
| 磷酸氢二钾 | Carl Roth | P749.1 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
| 母鸡/青年母鸡饲料 | Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Düsseldorf, Germany | - | |
| MagAttract HMW DNA 试剂盒 | Qiagen | 67563 | |
| 氯化镁 | Carl Roth | 2189.1 | |
| 混合气体（80% N2（质量等级 5.0）、15% CO2（质量等级 3.0）和 5% H2（质量等级 5.0）） | Westfalen Gase GmbH, Germany | - | |
| 重组溶葡球菌酶（冻干粉） | A&A Biotechnology | 1017-10L | |
| 肌醇 | Carl Roth | 4191.2 | |
| PBS 1X | ChemSolute | 8418.01 | |
| 磷酸二氢钾 | Carl Roth | 3904.2 | |
| 丙酸 | Carl Roth | 6026.1 | |
| QuantiFluor dsDNA 检测试剂系统 | Promega | E2671 | |
| RNase A | QIAGEN 核糖核酸酶 A (RNase A) | 19101 | |
| 氯化钠 | VWR | 27800.291 | |
| 刃天青钠 | VWR | 85019-296 | |
| 硫乙醇酸钠 | Sigma-Aldrich | 102933 | |
| 大豆蛋白胨，无转基因成分，无动物源成分 | VWR | 97064-186 | |
| PCR 仪 | Bio-Rad | T100 | |
| 胰蛋白胨 | Carl Roth | 8952.1 | |
| 吐温80 | Carl Roth | 9139.2 | |
| 维生素混合物（添加剂） | VWR | 968290NL | |
| 涡旋振荡器 | Star Lab | 07127/92930 | |
| 酵母提取物 | Carl Roth | 9257.05 | |
| β-D-果糖 | VWR | 53188-23-1 |
参考文献
- Wylensek, D., et al. A collection of bacterial isolates from the pig intestine reveals functional and taxonomic diversity. Nat Comm. 11 (1), 6389(2020).
- Medvecky, M., et al. Whole genome sequen....
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重印与许可
