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利用全自动系统对重组蛋白进行快速糖基化定性分析

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DOI：

10.3791/66571

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2024年6月28日

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1Molecular & Cellular Glycoproteomics Research Group, Cellular and Molecular Biotechnology Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 2Precision System Science Co., Ltd.

本文内容

摘要

此前已开发出一种用于蛋白质上糖链自动化快速分析的系统。本文介绍了针对广大用户优化的“糖基化定性分析”实验方案，适用于从事生物制药及其他糖缀合物材料中糖链结构分析的研究人员。

摘要

蛋白质糖基化是一种关键的翻译后修饰，影响重组蛋白（包括生物制药）的稳定性、有效性和免疫原性。糖链结构具有显著的异质性，会随生产用细胞类型、培养条件和纯化方法的不同而变化。因此，监测和评估重组蛋白的糖链结构至关重要，尤其在生物制药生产中更是如此。凝集素微阵列技术作为质谱分析的补充方法，具有高灵敏度和操作简便的优点。然而，该技术通常需要超过一天的时间才能获得结果。为了使其适用于非糖科学领域的研究或药物产品工艺开发，亟需一种自动化、高通量的替代方案。因此，全球首个完全自动化的基于凝集素的糖链分析系统应运而生，采用了“单枪头内珠阵列（BIST）”技术理念。该系统可将固定化凝集素的微珠以每单位1,000个的形式进行制备和储存，并可根据不同用途自定义多种微珠的并行插入顺序。本文介绍了一种针对“糖型确认”重组蛋白研究的实用操作流程。在测试了15种凝集素对12种聚丙烯酰胺-糖链偶联物的反应性后，筛选出15种凝集素以提升系统的适用范围。此外，通过将标记物由Cy3改为生物素，优化了样品标记步骤，使整体处理时间缩短了30分钟。为实现数据的即时判定，凝集素结合信号以点码形式显示在顶部显示器上。该系统的可靠性已通过日间重复性试验、重复性试验和长期储存试验得到验证，变异系数小于<10%。这一操作简便且快速的糖型分析仪在内源性糖蛋白的质量监控、生物标志物的评估与验证方面具有广泛应用前景。该方法有助于糖科学领域新手开展分析工作，从而拓展其实际应用价值。

引言

蛋白质糖基化是一种关键的翻译后修饰，需要在生物制药中进行评估。蛋白质的聚糖谱会因培养条件、纯化工艺和宿主细胞的不同而发生变化1. 生物工艺流程中需要简单的仪器来鉴定糖基化修饰。据估计，超过50%的分泌蛋白和膜蛋白 体内 经过多种糖链修饰，这些修饰会随着细胞谱系、发育阶段以及疾病状态（如恶性肿瘤的发生）而发生变化2监测糖型谱在识别特异性诊断标志物和药物靶点方面具有重要意义。在发现流程中，需要能够快速测量大规模样本量的自动化仪器，以验证和确认来自数百例患者样本的异常糖基化。

微阵列技术已应用于糖组学，用于评估糖蛋白的聚糖谱型3. 在该方法中，多种凝集素（即糖类结合蛋白）被固定在玻璃片等表面。这种基于相互作用的糖组分析技术无需预先将糖链从核心蛋白上释放，简化了糖工程领域新手研究人员的操作流程。尽管该技术已被广泛使用，但在生物制药等工业应用中，仍需要一种能够快速、简便地对大量分析目标进行糖链监测的自动化系统。为解决这一需求，开发了一种基于独特概念的自动化糖链分析系统 "单个吸头中的珠阵列" （BIST）最初用于基因分型，此前已有报道。该系统采用一体化高通量自动仪器，简化了操作流程。4使用并列排列的固定化凝集素微珠的吸头4,5一种用于分析糖蛋白中糖链结构修饰的方法被建立，并命名为GlycoBIST（以下简称GlycoBIST） "自动糖链分析系统") (图1A）。凝集素可固定在1,000个微珠上，干燥保存，无论是在装入吸头前或后，均可维持活性达一年之久。一旦将含有试剂（如辣根过氧化物酶标记的抗链霉亲和素抗体（SA-HRP））的吸头和 cartridges 置于检测用原型仪器（一种自动反应检测装置，参见 材料表），该探针可作为自动移液器使用。仪器内部后侧的化学发光检测扫描仪可同时量化八个探针的信号。这八个探针的定量数据以点阵码形式紧凑且同步地显示在仪器的触摸屏上，便于快速确认测量结果。此外，仪器将测得峰形的最大值作为原始数据输出，供研究人员自行绘图分析。图1A，下图）。

本文中，作者介绍了一种改进的蛋白质生物素标记方法，将处理时间缩短至30分钟。目标蛋白质预先进行生物素化标记，并通过链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SA-HRP）进行检测（图1B）。构建了一种标准的GlycoBIST探针（用于自动糖链分析的专用探针），包含15种选定的凝集素，以实现多功能糖蛋白糖链谱分析，确保分析的全面性。

方案

本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。

1. 自动糖组分析专用探针的制备

  1. 将密封袋中于4 °C保存的干燥凝集素固定化微珠取出，置于实验台，使其恢复至室温（约23 °C）。
    注意：此步骤可防止微珠表面产生冷凝水，从而避免影响其质量。该制备凝集素固定化微珠的方法此前已有报道5。
  2. 在实验台上铺放防静电布，并将便携式静电消除器朝向工作区域放置。这样可在后续操作中为实验台提供防静电保护（图2A）。
  3. 使用防静电镊子将微珠装入空的吸头中，使两个间隔微珠位于凝集素固定化微珠之间（图1A）。
  4. 用镊子轻轻挤压吸头顶部以闭合开口，注意在所有微珠装入后避免剪断吸头（图2B）。
    注意：此步骤旨在固定吸头内的微珠。建议使用不会剪断吸头的镊子设计（图2C）。
  5. 若吸头弯曲，可手动将其捋直。
  6. 将制备好的吸头置于含干燥剂的密封袋中，于4 °C保存，直至使用时取出。
    注意：使用前应先将吸头连同密封袋一起恢复至室温后再打开取出，湿气会显著降低凝集素的反应活性。

2. 分析物的制备

  1. 为常规分析预先分装生物素化试剂。
    注意：对于常规分析，建议将生物素化试剂（Biotin-(AC5)2 Sulfo-Osu，参见材料表）按以下方法分装成小份，以便快速使用。由于该试剂的琥珀酰亚胺酯通常易发生水解，建议将其干燥后保存。
    1. 用去离子水溶解生物素化试剂。
    2. 使用移液器将10 µg试剂分装至各管中。
    3. 将含有生物素化试剂的管子置于冷冻真空浓缩仪中干燥，并在避光袋中加入干燥剂后于4 °C保存，直至使用。
  2. 将待测物溶液（相当于200 ng蛋白）加入步骤2.1中制备的含干燥生物素化试剂的管中。
    注意：需注意用于溶解和稀释待测物的缓冲液组成，具体取决于所用生物素化试剂的性质。例如，应避免使用含伯胺的试剂（如Tris）作为胺偶联反应的缓冲液，以防止待测物的生物素化效率降低。
  3. 充分涡旋混匀，然后在台式离心机中离心（室温下1000 × g，5秒），使管盖上的液体沉降至管底。
  4. 将管子在避光条件下于室温孵育1小时。
  5. 用探针缓冲液（含1% Triton X-100、0.5 M甘氨酸、1 mM CaCl2和1 mM MnCl2的TBS缓冲液）将生物素化样品稀释10倍，以灭活未反应的生物素化试剂。
    注意：在胺偶联反应中，未反应的生物素化试剂会与含伯胺试剂（如Tris）的缓冲液发生反应而被消耗，从而防止在后续检测中非特异性地标记固定在微珠上的凝集素及其他物质。
  6. 在避光条件下于室温孵育2小时。
  7. 如有必要，使用HRP标记的链霉亲和素作为检测探针，通过Western印迹法评估待测物的生物素化效率。Western印迹方法请参考相关文献6。

3. 使用自动化反应检测装置进行糖链分析的试剂制备

  1. 按1:3000的比例，用封闭液稀释HRP标记的链霉亲和素。
  2. 将底物A与底物B等体积混合（见材料表）。每份样品使用160 µL混合底物。
  3. 将封闭液、洗涤缓冲液（0.1% Triton X-100/TBS）、TBS、HRP标记的链霉亲和素溶液以及每种底物分别加入具有10个液体储液槽的试剂盒指定孔中。
    注意：以下描述了填充反应试剂盒各孔的推荐体积和放置位置。然而，可根据需要预先在自动反应检测装置中调整溶液种类及孔位排列。
    1. 使用移液器将步骤3.1中制备的HRP标记链霉亲和素0.2 mL加入#2孔。试剂盒前端起始孔编号为#1。
    2. 使用移液器将0.2 mL封闭液加入#3孔。
    3. 使用移液器将1 mL TBS加入#4和#6孔。
    4. 使用移液器将1 mL洗涤缓冲液加入#7和#8孔。
    5. 使用移液器将0.16 mL底物混合液加入#10孔。
    6. 确认#1、#5和#9孔为空。
  4. 将步骤2中制备的分析物加入2 mL低吸附蛋白螺口微量离心管中。
  5. 打开自动反应检测装置的前门。
  6. 将步骤3.3中准备的液体储液槽、步骤1中准备的探针尖以及步骤3.4中准备的分析物，按照以下方式放置到自动反应检测装置的指定位置（图2D）。每次测量均沿单一垂直方向进行。
    1. 将步骤1中准备的每个探针尖插入图2D中标记为"a"的黄色符号位置的各个孔中。
      注意：若探针尖曾冷藏，请在打开密封袋前先恢复至室温。凝集素因受潮会导致信号显著下降。
    2. 取下步骤3.4中含分析物的管盖，并将其类似地插入位置"b"的各个孔中。
    3. 小心插入步骤3.3中装有液体的试剂盒，避免在位置"c"发生溢出。
    4. 当图2D中的"waste box"装满时，将其整体取出，将内容物倒入垃圾桶，并将"waste box"放回原位。
      注意：反应后的探针尖将在测量后自动收集至"waste box"中。

4. 使用自动化反应测量装置进行聚糖谱型分析

  1. 打开主机侧面的电源开关。
  2. 触摸屏幕上显示的"开始诊断"按钮（图3A）。自诊断程序将自动启动。一段时间后，自诊断程序完成，HOME 屏幕出现（图3B）。
    注意：以下操作可通过触摸相应图标完成。"检测"用于开始测量，"维护"用于确认系统错误，"历史记录"用于查看以往的测量数据。
  3. 在 HOME 屏幕上触摸显示的"检测"以选择检测方案（图3B）。
  4. 选择检测方法中的"BAssaySTD"（图3C），然后点击右下角的"下一步"。
  5. 根据需要为每个样本输入样本名称（图3D），然后点击右下角的"下一步"。
  6. 根据需要为每个样本输入所用吸头的名称（图3E），然后点击右下角的"下一步"。
  7. 确认右侧的提示信息（图3F），若无问题，则点击右下角的"开始"进行测量。
  8. 确认屏幕切换至运行模式（图3G），并等待"完成"箭头高亮显示。如有必要，可点击"中断"停止运行模式。
    注意：由自动化反应测量装置自动控制的操作如下：（1）仪器内部的自动微量移液喷嘴可同时安装最多八个吸头（参见图2D中的黄色符号"a"）；（2）在含有分析物的试管中反复吸液/排液5分钟；（3）转移至封闭溶液中并吸液/排液5分钟；（4）转移至TBS溶液中并吸液/排液2分钟；（5）转移至HRP标记的链霉亲和素溶液中并吸液/排液5分钟；（6）转移至洗涤缓冲液中并吸液/排液7分钟；（7）转移至TBS溶液中并吸液/排液2分钟；（8）转移至底物混合液中并立即吸液；（9）在设备后部同时扫描八个吸头的化学发光信号，以获取峰值数据；（10）将使用过的吸头丢入废料盒中；（11）喷嘴返回初始位置。
  9. 测量完成后，确认屏幕已切换至结果模式（图3H）。屏幕上将同时显示八个点码，便于核对。
    注意：点击左下角的"历史记录"，可在屏幕上显示扫描图（图3I、J）、柱状图（图3K、L）、表格（图3M）和详细信息（图3N）作为结果。通过下拉"通道"列表可查看其他通道的结果。
  10. 将U盘插入主机侧面的USB接口，并在结果模式下点击右下角的"导出"，将所有通道的数据分别保存至U盘中。
  11. 通过USB接口将原始数据（图3M）导出为CSV文件，以便在Excel中进行进一步的数据分析和单独作图。"数值"表示每种凝集素的信号强度。强度值代表反应后吸头扫描所得峰值数据（图3I、J）中的最大值。
    注意：可设置峰值提取阈值。根据分析物的不同，间隔珠部分的信号可能整体较高，此时可将间隔珠部分的数值作为背景扣除。

结果

首先，展示每种凝集素的信号分布，以了解凝集素微珠阵列的特性。制备了一组固定化凝集素的微珠（每种1,000个微珠）。从1,000个微珠中随机选取15个，并加入到一个检测尖端中。在图1A底部显示了一个典型图表，表明固定同一种凝集素的15个微珠之间的信号强度几乎相同。该测量程序可用于在进行糖链谱型分析前，对自制的凝集素微珠制备质量进行评估。例如，使用六个尖端同时进行测量，基于90个微珠的信号计算变异系数（CV）。表1展示了一个典型示例。当固定化凝集素微珠库扩展至包含28种不同凝集素时，其中25种凝集素表现出高重复性，CV值低于10%。

接下来展示了包含15种不同凝集素的凝集素微珠阵列的数据。表2中列出的这15种凝集素被选用于凝集素微珠阵列。此外，还检测了表3中列出的12种聚丙烯酰胺（PAA）单/二/三糖。在屏幕上使用点编码显示评估测量可靠性后，从自动反应检测装置导出原始数据（参见实验方案步骤4.11），并在Excel中利用每种糖链的反应峰值得到图表（图4A）。随后将这些值用于主成分分析，以可视化所选的15种凝集素与发生反应的糖链之间的相关性（图4B、C）。结果表明，每种凝集素对12种PAA-糖链的结合模式存在明显差异（见图4A）。此处，各信号的有效性通过参考已有的凝集素与糖链特异性的综合列表进行验证7,8（也可参见表2中的这些特异性信息）。由于AAL可结合末端α-Fuc、Sia-Lex和Lex，自动糖链分析证实了AAL对含岩藻糖分子的识别能力（图4A）。SSA和MAL（凝集素全称及其缩写见表2）分别识别Siaα2-6Gal/GalNAc和Siaα2-3Gal。在微珠阵列中，MAL还可结合3'-O-磺酸-Galβ3GalNAc和LacNAc。这与先前使用机器学习分析的结果一致7，即MAL优先结合3'-O-磺酸-Gal，而LacNAc并非其主要结合对象9。RCA120是一种识别半乳糖（Gal）的凝集素，其对包括Lac/LacNAc在内的末端β-Gal表现出强烈反应，并可结合Siaα2-6Lac，但不能结合Siaα2-3Lac。ECA对LacNAc的反应性远高于Lac。WFA具有较广泛的特异性，不仅识别α/β-GalNAc，也识别末端β-Gal，这与已有报道一致7,10。GSL II可识别GlcNAc以及半乳糖基化的三/四触角型N-糖链，但在所制备的分析物中，仅对单一的GlcNAc发生结合，而对其他糖链均无结合。GRFT可识别高甘露糖型N-糖链，与α-Man发生反应。ABA、Jacalin和MAH通常用于检测O-糖链。由于ABA偏好Galβ1-3GalNAcα-Thr/Ser（T）及唾液酸化T抗原（sialyl-T）结构，因此在微珠阵列中，ABA对3'-O-磺酸-Galβ1-3GalNAc表现出强烈反应，对α-GalNAc则弱结合。ABA还可识别β-GlcNAc，这与先前关于其结合无半乳糖基化N-糖链的报道一致7。Jacalin具有相对较广的特异性，因此可与α-甘露糖、β-GalNAc、β-Gal、α-GalNAc以及3'-O-磺酸-Galβ1-3GalNAc发生反应。MAH特异性识别3'-O-硫酸化-Galβ1,3GalNAc，这与先前报道一致7。其余四种凝集素NPA、LCA、PHA-L和PHA-E识别的是所制备的PAA糖链中未包含的N-糖链内部结构，因此对所有分析物均无亲和力。

利用所获得的数据，可通过在主成分分析图上绘制凝集素来阐明其对每种单糖结合的相似性（图4B）。在图4B中影响变异的所有单糖均以特征向量表示，这是一种统计分析方法，其中贡献率以向量形式表示（图4C）。值得注意的是，发生反应的单糖对每种凝集素的贡献无偏倚。凝集素并不只对单一类型的单糖具有特异性。例如，人类复杂型糖链的存在是通过对其内部某些糖链的部分识别来确定的。Jacalin可识别O-糖链（见表2中的特异性），在本研究使用的单糖中，它能够识别3'suTF结构和α-GalNAc，因此3'suTF和α-GalNAc在图4C中沿Jacalin（棕色圆点）在图4B中的位置方向绘制。WFA在本研究使用的单糖中可识别α/β-GalNAc，因此图4C中的α/β-GalNAc沿WFA在图4B中的方向绘制。相反，α-GalNAc位于WFA与Jacalin之间，因为它是Jacalin易于结合的单糖结构。本研究中绘制的全部11种单糖均与先前报道的凝集素特异性（单糖结合）一致7,8，表明所提出的方法是一种可靠的检测手段。此外，对应于每种单糖的特征向量呈分散分布，说明所选的15种凝集素具有最小偏倚，从而确保分析中的全面覆盖。因此，使用这15种凝集素重新填充的探针被定义为标准GlycoBIST探针（表2）。

在更具实用性的示例中，将纯化的蛋白质产物进行尖端检测（图5）。分析了含有一个N-糖基化位点并具有复杂型、杂合型及高甘露糖型N-聚糖的牛甲状腺球蛋白11。标准尖端显示某些凝集素对糖类的反应性增强8（具体特异性参见表2）：识别双分枝GlcNAc的PHA-E；识别甘露糖型N-聚糖的GRFT；识别Siaα2-6Gal/GalNAc的SSA；识别乳糖和LacNAc的RCA120；以及识别岩藻糖的AAL。这些聚糖结构存在于复杂型、杂合型和高甘露糖型N-聚糖中，表明甲状腺球蛋白的N-聚糖结构11可被有效评估。此外，经唾液酸酶A（可降解唾液酸的酶）处理后的甲状腺球蛋白对识别唾液酸的SSA反应性降低，而对在唾液酸去除后更易识别的RCA120、WFA和ECA的反应性则增强。此前尚未有关于牛甲状腺球蛋白中存在O-聚糖结构的报道。与预期一致，在自动聚糖分析中，无论是否经过唾液酸酶处理，甲状腺球蛋白均未显示出对O-聚糖的识别信号。

为评估检测方法的稳健性，使用15种选定的凝集素进行了一次运行内重复性测试（表4）。在该测试中，制备了7个用于分析物的标准探针以及1个用于阴性对照的额外探针，并同时对全部8个探针进行检测。此过程在同一天内重复三次。“混合分析物”（Mix Analytes）是指一组能够使所有凝集素产生显著信号的分析物组合，用于微球阵列的质量控制。混合分析物由适当比例混合的唾液酸酶消化后的促红细胞生成素（EPO）、经唾液酸酶和半乳糖苷酶消化后的EPO、人IgA、基质金属蛋白酶3（MMP3）以及甲状腺球蛋白配制而成。每种糖蛋白（200 ng）在含有Triton X-100的PBS缓冲液中与10 µg生物素标记试剂进行标记。如需要，按照说明书进行唾液酸酶和半乳糖苷酶处理。消化完成后，将产物在75 °C的加热块中孵育10分钟以灭活酶。在分析前立即混合适量的生物素化糖蛋白（3 ng EPO、8 ng人IgA、5 ng MMP3和15 ng甲状腺球蛋白）。检测结果显示，15种凝集素的最大变异系数（CV）为13.5%，平均CV为8.2%，表明该方法具有高度的重复性。

此外，通过日常重复性测试评估了因测量日期不同而产生的变异情况（表5）。预先配制标准探针和混合分析物，连续五天每天重复测量七个探针。结果显示，大多数凝集素的变异系数（CV）低于10%。然而，部分凝集素（如LCA和ECA）表现出较高的变异系数。每轮循环中15种凝集素的平均CV最高为7.7%，五天内的平均CV均低于10%，表明具有较高的重复性。值得注意的是，由于混合分析物中MMP3的自降解作用，Jacalin表现出较低的时间重复性。因此，应筛选更合适的分析物以替代MMP3。

为了了解凝集素固定化微珠的稳定性，本研究对这些干燥的凝集素固定化微珠进行了长期稳定性测试（表6）。标准移液吸头、检测试剂和混合分析物均预先配制，并在储存12个月后进行检测。前述五种生物素标记的分析物分别储存，并在检测前混合。结果显示，15种凝集素的平均变异系数（CV）在干燥储存12个月后仍低于10%。这表明，将同一批次的大量吸头（最多1,000个）一次性储存，随后用于快速且精确的检测是可行的。

凝集素微珠检测示意图，包含自动化反应设置、化学发光分析和点状图结果。
图1：“单枪头微珠阵列”仪器及分析方法示意图。（A）自动糖链谱分析系统示意图。固定有凝集素的微珠可干燥后储存于枪头中。当装载微珠的枪头与含有试剂（如辣根过氧化物酶标记的抗链霉亲和素抗体（SA-HRP））的试剂盒插入测量仪器（自动反应测量装置）并启动后，枪头即可发挥自动移液功能。仪器后部的化学发光检测扫描仪可同时定量八个枪头的信号。定量数据以点码形式显示在仪器的触摸屏上，便于快速确认测量结果。下方部分展示了使用同一种凝集素对90个微珠进行测量的结果。测量数据从仪器导出后，由研究人员自行绘制成图。（B）本实验所用检测方法示意图。目标蛋白预先进行生物素标记，并利用SA-HRP进行检测。请点击此处查看该图的放大版本。

A：PCR工作站设置，包括镊子和微量离心管；B：穿刺微量离心管封膜；C：金属丝切割工具；D：离心废液盒及试管。
图2：使用自动化反应检测装置进行自动糖链分析的材料与装置示意图。（A）凝集素固定化微珠装填至吸头中的示意图。在防静电垫上使用防静电镊子夹取微珠，并将微珠填入吸头中。（B）使用钳子夹紧吸头。轻微挤压顶部微珠的上部区域。（C）用于压合吸头的钳子。塑料部分（黄色圆圈所示）被夹紧，以防止完全剪断。（D）自动化反应检测装置中所用材料的布置方式。a：吸头，b：含有待测物的试管，c：含有液体的 cartridges，应分别正确插入相应位置。反应后的吸头在检测完成后收集于废液盒中。该盒子可拆卸。请点击此处查看此图的放大版本。

显示检测方案、设置和结果图的诊断软件界面序列。
图 3：用于设备操作的触摸屏。（A）电源接通时，自诊断程序自动启动。（B）主屏幕显示“检测”、“维护”和“历史记录”。（C–G）“检测”模式的操作。检测方法选择（C）。可预先注册多个检测方案。输入样本（分析物）顺序（D）。选择移液头类型（E）。确认检测方法设置（F），并从“开始检测”屏幕启动检测（G）。（H–N）在“历史记录”中显示结果。检测完成后或在“历史记录”模式下显示凝集素点码（H）。屏幕上显示所有样本（I）或每个样本（J）的15种凝集素扫描图谱。扫描图谱以柱状图形式显示（K）。可通过下拉的“通道”列表选择其他通道的柱状图。每种凝集素对应八个样本通道的柱状图比较（L）。可通过下拉的“凝集素”列表选择其他凝集素。显示定量数值的表格（M）。已执行测量方法的记录（N）。 请点击此处查看该图的放大版本。

柱状图、PCA 图和载荷图中的凝集素结合分析；糖链检测、数据比较。
图 4：在自动糖链分析系统中对 PAA 糖链反应性的评估。 （A）根据阴性对照值校正后的凝集素与多种 PAA 糖链反应性的图表。（B）基于（A）中数据的主成分分析。（C）来自（B）分析的特征向量。部分（B）和（C）使用了兼容的分析软件。请点击此处查看该图的放大版本。

比较未经处理与神经氨酸酶A处理样品的凝集素结合强度图表。
图5：使用纯化的牛甲状腺球蛋白验证GlycoBIST反应性。 未处理样品的制备在与仅含缓冲液相同的消化条件下进行，但不添加神经氨酸酶A。 请点击此处查看该图的放大版本。

表1：凝集素固定化微珠的重复性测试。 评估了28种凝集素反应活性的重复性。分析物与每个探针进行反应。EPO：促红细胞生成素，PSA：前列腺特异性抗原，Tf：转铁蛋白，M2BP：Mac-2结合蛋白，hIgG：人免疫球蛋白G，MMP3：基质金属蛋白酶3，(Sia+)：经神经氨酸酶A消化的分析物，(Sia+, Gal+)：经神经氨酸酶A和半乳糖苷酶消化的分析物，Ab：抗体。DSA：Datura stramonium 凝集素，HypninA2：Hypnea japonica 凝集素，WGA：小麦胚芽凝集素，UDA：Urtica dioica 凝集素，BPL：Bauhinia purpurea 凝集素，Orysata：Oryza sativa 凝集素，LSL-N：Laetiporus sulphureus 凝集素N端结构域，SNA：Sambucus nigra 凝集素，BanLec：香蕉凝集素，MPA：Maclura pomifera 凝集素，TxLC-I：Tulipa gesneriana 凝集素，AOL：Aspergillus oryzae 凝集素，ACG：Agrocybe cylindracea 半乳糖凝集素。CV：变异系数。请点击此处下载该表格。

表2：用于自动聚糖分析的标准芯片所包含的凝集素列表。 请点击此处下载该表格。

表3：用作自动聚糖分析系统标准品的PAA寡糖。 请点击此处下载该表格。

表4：批内重复性测试结果。 CV：变异系数。 请点击此处下载该表格。

表5：日间重复性测试结果。 CV：变异系数。请点击此处下载该表格。

表6：长期稳定性试验结果。 CV：变异系数。请点击此处下载该表格。

讨论

本研究开发了一种利用“单枪头微珠阵列”技术快速评估糖基化的方法。本研究介绍了一种标准化的GlycoBIST枪头，旨在为糖科学领域及非糖科学领域的研究人员提供便利，以实现常规、全面的糖基化评估。通常采用20至100种凝集素的凝集素微阵列已广泛应用于相关评估中12,13。然而，考虑到微阵列上部分凝集素的特异性存在重叠，且目标糖蛋白上的糖型种类相较于粗制临床样本的糖组学而言相对有限，因此预计仅需15种凝集素即可满足针对特定糖链谱型的简化评估需求。

该实验方案的关键步骤是在使用凝集素固定化的磁珠或装有这些磁珠的提示头之前，需将其从储存条件下恢复至室温。特别是观察到冷凝水会减弱信号强度，因此建议在未恢复至室温前切勿打开储存袋。对于生物素化试剂的保存，储存前也必须确保完全干燥。干燥不充分会导致生物素化试剂发生水解，从而降低其对蛋白质的生物素化效率14。

关于实验修改与故障排除，已探索一种方法以减少变异性，特别是与自动反应检测装置中的测量方法相关的变异性。具体而言，当用于分析的储液槽中缓冲液体积为150 µL时，气泡会进入吸头，导致反应效率降低，并引起测量值出现较大波动。因此，建议在储液槽中至少加入200 µL缓冲液。

自动移液过程中填充吸头的液体量也是一个重要因素。由于液体进入下一步反应时无法被吸头完全排出，因此前一步的缓冲液会以不可忽略的量带入下一步反应中，且当吸取新的缓冲液时，前一步的缓冲液仍会残留在插入溶液的顶部区域。因此，底物及其他溶液应充分吸取，以填满顶部储液区（见图1A）。鉴于仪器上抗体反应具有不可逆性，在初始设置过程中必须格外谨慎，避免出现任何错误。

该方法的一个局限性在于其仅适用于来源于血清和培养上清液的可溶性蛋白质。在当前方法中，凝集素未与磁珠共价交联，因此无法用于分析含有高浓度表面活性剂的样品，例如细胞和组织提取物。因此，未来有必要对该方法进行改进以克服这些局限性。

凝集素微珠阵列的重要性在于固定在微珠上的凝集素种类具有可互换性和可扩展性。例如，在使用自动化聚糖分析系统进行大规模差异分析（>1,000 个样本）时，用户可根据目标糖蛋白的初步凝集素微阵列聚糖谱分析结果（<100 个样本），在检测探针中定制包含15种凝集素的组合。此外，凝集素固定化微珠具有高度稳定性，使得从初始探针设计到采用常规流程进行检测的实验可立即开展。不仅已验证具有高可靠性的28种凝集素中的25种（表1），用户感兴趣的任何其他凝集素均可用于构建定制化的自动化聚糖分析系统，以满足其特定实验需求，前提是遵循前述的常规可靠性测试。该策略推动了由八种不同类型探针组成的、最多可达120种凝集素的微珠阵列设计，以配合标准聚糖分析系统实现更广泛的检测能力。

先前的一项研究致力于建立一种与凝集素微阵列相一致的Cy3标记糖蛋白检测方法15。由于荧光干扰，该方法在检测尖端中仅能同时检测13种凝集素。目前采用HRP检测标记的方法可在尖端中容纳15种固定化凝集素微珠以及两种对照微珠（阳性与阴性）。此外，样本的生物素标记使分析过程得以缩短。

该分析方法不仅可应用于学术研究，还可用于医学和药物研究、食品、化妆品及其他工业领域。尽管凝集素微阵列和糖蛋白质组学技术已较为成熟，但本研究的方法因其完全自动化以及步骤更少、可实现快速分析而仍具有重要意义。未来，将通过使用特定糖蛋白对信号进行归一化，并在吸头中联合使用抗体固定化微珠与凝集素固定化微珠，进一步改进该分析方法，使其成为定量分析方法。

披露

AO、TO、NT、HS、KK、MA、SY、TM、KN、OS 和 KS 是 Precision System Science Co., Ltd. 的员工。

致谢

本工作由通过目标导向型研发的灵活无缝技术转移计划（Adaptable and Seamless Technology transfer Program through Target-driven R）资助&由日本科学技术振兴机构（JST）资助的 #38;D（A-STEP）项目（授予号：JPMJTR204A）以及日本学术振兴会（JSPS）科研费（KAKENHI）授予号 23H02680（授予 AK）部分资助。我们感谢 Editage（www.editage.jp）对英文语言的编辑工作。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 mL 8联PCR管 + 平盖FastGeneFG-0028FC/SE用于生物素标记试剂的分装与储存
2.0 mL SC微量离心管 蛋白LBSARSTEDT AG&Co. KG72.694.600用于向LuBEA-VIII中加样
分析软件SAS Institute Inc.JMP 17
防静电离子发生器，110伏Plas-Labs800-AS/SPI将微珠插入BIST吸头时使用
防静电镊子 NK2ARUBIS 9-5681-01将微珠插入BIST吸头时使用
自动化反应检测装置Precision System Science Co., Ltd.LuBEA本研究中的所有数据均使用LuBEA-VIII获得。LuBEA已实现商业化，而LuBEA-VIII目前尚处于开发阶段。有关LuBEA和LuBEA-VIII产品详情的网站地址如下：https://www.pss.co.jp/english/technology/apit/bist02.html
生物素-(AC5)2 磺基-OSuDojindo341-06801作为生物素化试剂
BIST间隔微珠-V-11Precision System Science Co., Ltd.F4938000直径：1 mm
BIST吸头及护套Precision System Science Co., Ltd.F4930-000将此空吸头填充微珠
氯化钙Wako039-00475用于配制缓冲液
Can Get Signal Solution 2TOYOBONKB-301该封闭试剂适用于本方法
CentriVap台式真空浓缩仪Labconco7810010用于干燥生物素化试剂。其他公司提供的替代产品亦可使用。
Clarity Western ECL底物 Bio-Rad1705060用于通过LuVEA VIII检测样品
CentriVap系列冷阱Labconco7460040用于干燥生物素化试剂。其他公司提供的替代产品亦可使用。
甘氨酸Wako077-00735用于配制缓冲液
四水合氯化锰(II)Wako139-00722用于配制缓冲液
Milli-Q referenceMERCKZIQ7000T0C作为去离子水用于试剂和缓冲液的稀释
PBSWako162-19321用于配制缓冲液
辣根过氧化物酶标记链霉亲和素Jackson016-030-084该抗体适用于GlycoBIST分析。尽管其他公司也可提供替代产品，但其在Western blot检测中具有良好的应用效果。
探针微珠Precision System Science Co., Ltd.FP4936000用于制备固定化凝集素微珠。详细信息请参见参考文献部分Shimazaki H. 等人发表于《Current Protocols in Protein Science》（2020年）的文章。
蛋白低吸附管 1.5 mLEppendorf0030108442用于样品制备过程（如生物素化）中使用。
硅胶（干燥剂用）关东化学37039-02用于储存GlycoBIST吸头及干燥的生物素化试剂。
防静电去除片 M型TRUSCO NAKAYAMASD5050将微珠插入BIST吸头时使用
SV Cartridge II大同化学工业ED041用于通过LuVEA VIII检测样品
台式微量离心机-CAPSULEFUGETOMYPMC-060用于各步骤中混合物的离心沉降
Triton X-100那可丽试剂35501-15用于配制缓冲液

参考文献

  1. Butler, M., Reichl, U. Animal cell expression systems. Adv Biochem Eng Biotechnol. 175, 1-36 (2021).
  2. Silva, M. L. S. Chapter One - Lectin biosensors in cancer glycan biomarker detection. Adv Clin Chem. 93, 1-61 (2019).
  3. Hiono, T., Nagai-Okatani, C., Kuno, A. 4.07 - Application of glycan-related microarrays. Comprehensive Glycoscience (Second Edition). , 134-148 (2021).
  4. Shimazaki, H., et al. Lectin bead array in a single tip facilitates fully automatic glycoprotein profiling). Anal Chem. 91 (17), 11162-11169 (2019).
  5. Shimazaki, H., et al. GlycoBIST: A System for automatic glycan profiling of a target protein using milli-bead array in a tip. Curr Protoc Protein Sci. 99 (1), e103(2020).
  6. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  7. Bojar, D., et al. A useful guide to lectin binding: machine-learning directed annotation of 57 unique lectin specificities. ACS Chem Biol. 17 (11), 2993-3012 (2022).
  8. Nagai-Okatani, C., et al. 2.0: An integrated visualization for lectin microarray-based mouse tissue glycome mapping data with lectin histochemistry. J Proteome Res. 20 (4), 2069-2075 (2021).
  9. Geisler, C., Jarvis, D. L. Effective glycoanalysis with Maackia amurensis lectins requires a clear understanding of their binding specificities. Glycobiology. 21 (8), 988-993 (2011).
  10. Noro, E., et al. N -glycan structures of Wisteria floribunda agglutinin-positive Mac2 binding protein in the serum of patients with liver fibrosis. Glycobiology. 31 (10), 1268-1278 (2021).
  11. Rawitch, A. B., Pollock, H. G., Yang, S. X. Thyroglobulin glycosylation: Location and nature of the N-Linked oligosaccharide units in bovine thyroglobulin. Arch Biochem Biophys. 300 (1), 271-279 (1993).
  12. Dang, K., Zhang, W., Jiang, S., Lin, X., Qian, A. Application of lectin microarrays for biomarker discovery. Chemistry Open. 9 (3), 285-300 (2020).
  13. Chen, S., Qin, R., Mahal, L. K. Sweet systems: Technologies for glycomic analysis and their integration into systems biology. Crit Rev Biochem Mol Biol. 56 (3), 301-320 (2021).
  14. Dwivedi-Agnihotri, H., Srivastava, A., Shukla, A. K. Reversible biotinylation of purified proteins for measuring protein-protein interactions. Methods Enzymol. 633, 281-294 (2020).
  15. Shimazaki, H., et al. Auto-lectin dotcoding by two octopuses: Rapid analysis of fluorescence-labeled glycoproteins by an 8-channel fully-automatic bead array scanner with a rolling-circle detector. Anal Chem. 95 (32), 11868-11873 (2023).

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