啮齿类动物口腔疾病模型中牙齿与牙槽骨的显微硬度测量

摘要

显微硬度是一种机械性能，也是评估硬组织病理生理学的有用参数。本文中，我们展示了一种标准化的显微硬度分析方案（包括样品制备、抛光、平整表面及压痕位点选择），用于啮齿类动物口腔疾病模型中牙齿和牙槽骨的显微硬度检测，具体模型为氟斑牙和结扎诱导的牙周骨吸收。

摘要

评估口腔疾病模型（包括氟斑牙和牙周炎）中牙釉质、牙本质和骨组织的力学性能指标——显微硬度。显微计算机断层扫描（µCT）可提供三维成像信息（体积和矿化密度），扫描电子显微镜（SEM）则生成微观结构图像（釉柱及骨陷窝-管状系统）。与µCT和SEM的结构分析相辅相成，显微硬度是评估结构变化如何影响力学性能的重要参数之一。尽管显微硬度是一项有价值的指标，但针对口腔疾病中牙槽骨显微硬度的研究仍较为有限。迄今为止，已有多种不同的显微硬度测量方法被报道。由于显微硬度值受样本制备（抛光及表面平整度）和压痕位置的影响，不同实验方案可能导致研究结果之间存在差异。因此，在口腔疾病模型中建立标准化的显微硬度检测流程对于实现一致且准确的评估至关重要。本研究展示了一种适用于牙齿及牙槽骨显微硬度分析的标准化操作流程。所用样本如下：在氟斑牙模型中，采集饮用含氟水6周与未饮用含氟水的实验小鼠的门齿；在结扎诱导的牙周骨吸收（L-PBR）模型中，采集上颌第二磨牙区域结扎后产生牙周骨吸收的小鼠牙槽骨样本^nd 摩尔。结扎后2周采集上颌骨标本，按照标准化方案分析维氏硬度。该方案详细提供了树脂包埋、连续抛光以及切牙和牙槽骨压痕位点的材料与方法。据我们所知，这是首个用于评估啮齿类动物口腔疾病模型中牙齿和牙槽骨力学性能的标准化显微硬度检测方案。

引言

硬度是材料的力学性能之一（例如弹性、硬度、粘弹性以及断裂行为），常用于表征材料局部区域抵抗压缩变形和断裂的能力。静态压痕硬度测试是最常用的方法，包括维氏硬度和努氏硬度¹。维氏硬度测试通过在固定试验载荷下将金刚石压头压入材料表面来实施。该压头呈金字塔形，具有正方形底面，相对面之间的夹角为136°。测量试样表面形成的两条对角线长度，取其平均值用于计算硬度值，硬度由F/A的比值确定（其中F为作用力，A为压痕的表面积）。维氏显微硬度值（HV=F/A）通常以千克力每平方毫米（kgf/mm²）表示，1 HV ≈ 0.1891 F/d²（N/mm²）。努氏硬度也采用金刚石四棱锥压头，但其相对面具有不相等的夹角。努氏硬度值（HK）等于施加载荷与压痕投影接触面积的比值。根据施加于试样材料上的力的大小，硬度测试可分为显微压痕（显微硬度）测试和宏观压痕测试。显微压痕测试通常使用0.01–2 N（约1–203 gf）范围内的载荷；而宏观压痕测试则使用超过10 N（10119 gf）的载荷¹。

为了评估口腔疾病中牙体硬组织（包括牙齿和牙槽骨）的特征，常采用显微计算机断层扫描（µCT）和扫描电子显微镜（SEM）进行结构分析。µCT可提供三维成像信息（体积和矿物密度）²，而SEM则可生成微观结构图像....

方案

本方案中描述的所有操作均按照奥古斯塔大学和诺瓦东南大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的脊椎动物使用指南和法规进行，这两所大学均获得国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证。请注意，铃木博士在完成小鼠牙氟中毒实验时受聘于奥古斯塔大学。

1. 小鼠氟斑牙模型下颌切牙的拔除

1. 从氟处理开始前1周起，直至氟处理结束，给予C57BL/6小鼠（5周龄，雄性）无氟饮食。
2. 通过将 NaF 加入蒸馏水中制备氟化水，随后使用真空过滤 0.2 µm 过滤。给予动物含氟化钠的水（0 ppm 和 125 ppm；N=5/组） 随意摄取 持续6周，每2天将氟化水更换为新配制的批次。
3. 在氟化物水处理6周后，使用CO₂处死动物₂ 随后进行断头处死。
4. 从每只小鼠中取出带有门齿的半下颌骨。为采集带有门齿的半下颌骨，需在不施加过度力量的情况下切断下颌骨周围肌肉。
5. 将半下颌置于磷酸盐缓冲液（PBS）中并保持 4 °C 直到 μ- CT分析（可选）。使用手术刀（#15）和剪刀将门齿与下颌分离，注意不要损坏或折断样本。
6. 用 PBS 清洗分离的切牙，并通过将其浸入浓度递增的酒精（70% 和 100% 乙醇）中 2–3 小时进行脱水。
   注意：如果组织（如牙髓）脱水不充分，可能会抑制树脂浸润，进而导致后....

结果

氟斑牙模型：图1展示了对照组和氟处理小鼠门齿的代表性μCT图像。在对照组中（图1B-D），颈区的釉质矿化密度（EMD）为1.188 g/cm³（图1B），低于中部（1.924 g/cm³）和尖端（1.819 g/cm³；图1C，D）。在氟处理组的釉质中（图1E-G），五个样本中仅有一个可用于评估颈区的EMD（0.835 g/cm³；图1E和补充图1）。所有区域的EMD均较对照组降低（图1F.......

讨论

显微硬度测试用于评估牙齿和骨骼等硬组织的力学性能。迄今为止，已有多种不同的显微硬度测量方法被报道。大多数测量信息，尤其是样本制备和压痕位点的描述，往往不够充分。本研究聚焦于牙氟斑病和牙周病模型中釉质和牙槽骨的显微硬度检测方案。为了获得一致且准确的结果，该方案中的关键步骤包括：树脂包埋时样本的取向、保持检测表面与地面平行、对检测表面进行逐级抛光以获得镜面效果，以及通过参考点确定压痕区域和位点。在树脂包埋和抛光过程中，必须通过肉眼或显微镜检查，确保检测表面始终与地面平行且表面完整无损。尽管属于可选步骤，但仍建议进行μCT分析以确定压痕位点。

在牙氟中毒模型中，NaF（125 ppm）处理导致从牙颈部至中部区域的釉质结构难以通过μCT识别。仅牙尖区域的釉质可与牙本质区分开来（图1和 补充图1）。因此，在牙氟中毒模型中评估釉质显微硬度时，应选择牙尖区域进行压痕测试。相应地，既往研究在牙氟中毒模型中均采用切牙釉质的牙尖区域进行评估^.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6-0 编织丝线缝合线	Teleflex
Canica 小动物手术系统	Kent Scientific Corporation	SURGI 5001
CarbiMet PSA 120/P120	Buehler	30080120
CarbiMet PSA 60/P60	Buehler	36080060
CarbiMet PSA 600/P1200	Buehler	36080600
Castroviejo 微型持针器	F.S.T	12060-01
Epofix 冷固化包埋树脂	Electron Microscopy Science	CAT-1237
Fisherbrand 112xx 系列高级超声波清洗机	Fisher Brand	FB11201
无氟啮齿类动物饲料	Bio Serv	F1515	AIN-76A，1/2" 颗粒
活体微计算机断层扫描仪 Skyscan 1176	Bruker
Isomet 1000 精密切割锯	Buehler	MA112180
研磨膜 0.3µm	Maruto Instrument Co., LTD. Japan	26-4203	替代品  A3-0.3 SHT，3M USA
研磨膜 1µm	Maruto Instrument Co., LTD. Japan	26-4206	替代品 A3-1 SHT，3M USA
研磨膜 12µm	Maruto Instrument Co., LTD. Japan	26-4211	替代品 A3-12 SHT，3M USA
研磨膜 3µm	Maruto Instrument Co., LTD. Japan	26-4204	替代品 A3-3 SHT，3M USA
研磨膜 9µm	Maruto Instrument Co., LTD. Japan	26-4201	替代品 A3-9 SHT，3M USA
Leica wild 显微镜	Leica	LEIC M690
Metaserv 2000 变速研磨抛光机	Buehler	No: 557-MG1-1160
MicroCut PSA 1200/P2500	Buehler	36081200
MicroCut PSA P4000	Buehler	36084000
显微硬度计 ALPHA-MHT-1000Z	PACE Technologies
SamplKups  1 英寸	Buehler	No: 209178
氟化钠	Fisher Scientific	S299-100
Westcott 缝合剪刀	JEDMED	Cat. #25-1180
ZooMed Repti Therm 底部加热垫（U.T.H）	Zoo Med Laboratories, Inc.	RH-4