显微硬度是一种机械性能，也是评估硬组织病理生理学的有用参数。本文中，我们展示了一种标准化的显微硬度分析方案（包括样品制备、抛光、平整表面及压痕位点选择），用于啮齿类动物口腔疾病模型中牙齿和牙槽骨的显微硬度检测，具体模型为氟斑牙和结扎诱导的牙周骨吸收。
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摘要
摘要
评估口腔疾病模型（包括氟斑牙和牙周炎）中牙釉质、牙本质和骨组织的力学性能指标——显微硬度。显微计算机断层扫描（µCT）可提供三维成像信息（体积和矿化密度），扫描电子显微镜（SEM）则生成微观结构图像（釉柱及骨陷窝-管状系统）。与µCT和SEM的结构分析相辅相成，显微硬度是评估结构变化如何影响力学性能的重要参数之一。尽管显微硬度是一项有价值的指标，但针对口腔疾病中牙槽骨显微硬度的研究仍较为有限。迄今为止，已有多种不同的显微硬度测量方法被报道。由于显微硬度值受样本制备（抛光及表面平整度）和压痕位置的影响，不同实验方案可能导致研究结果之间存在差异。因此，在口腔疾病模型中建立标准化的显微硬度检测流程对于实现一致且准确的评估至关重要。本研究展示了一种适用于牙齿及牙槽骨显微硬度分析的标准化操作流程。所用样本如下：在氟斑牙模型中，采集饮用含氟水6周与未饮用含氟水的实验小鼠的门齿；在结扎诱导的牙周骨吸收（L-PBR）模型中，采集上颌第二磨牙区域结扎后产生牙周骨吸收的小鼠牙槽骨样本nd 摩尔。结扎后2周采集上颌骨标本，按照标准化方案分析维氏硬度。该方案详细提供了树脂包埋、连续抛光以及切牙和牙槽骨压痕位点的材料与方法。据我们所知，这是首个用于评估啮齿类动物口腔疾病模型中牙齿和牙槽骨力学性能的标准化显微硬度检测方案。
引言
硬度是材料的力学性能之一（例如弹性、硬度、粘弹性以及断裂行为），常用于表征材料局部区域抵抗压缩变形和断裂的能力。静态压痕硬度测试是最常用的方法，包括维氏硬度和努氏硬度1。维氏硬度测试通过在固定试验载荷下将金刚石压头压入材料表面来实施。该压头呈金字塔形，具有正方形底面，相对面之间的夹角为136°。测量试样表面形成的两条对角线长度，取其平均值用于计算硬度值，硬度由F/A的比值确定（其中F为作用力，A为压痕的表面积）。维氏显微硬度值（HV=F/A）通常以千克力每平方毫米（kgf/mm2）表示，1 HV ≈ 0.1891 F/d2（N/mm2）。努氏硬度也采用金刚石四棱锥压头，但其相对面具有不相等的夹角。努氏硬度值（HK）等于施加载荷与压痕投影接触面积的比值。根据施加于试样材料上的力的大小，硬度测试可分为显微压痕（显微硬度）测试和宏观压痕测试。显微压痕测试通常使用0.01–2 N（约1–203 gf）范围内的载荷；而宏观压痕测试则使用超过10 N（10119 gf）的载荷1。
为了评估口腔疾病中牙体硬组织（包括牙齿和牙槽骨）的特征，常采用显微计算机断层扫描（µCT）和扫描电子显微镜（SEM）进行结构分析。µCT可提供三维成像信息（体积和矿物密度）2，而SEM则可生成微观结构图像（如釉柱结构及骨陷窝-骨小管系统）3。除了通过µCT和SEM进行结构分析外，显微硬度也是评估口腔疾病中结构变化如何影响牙齿和牙槽骨力学性能的重要参数之一，例如釉质发育异常和牙周骨吸收。人类釉质的维氏显微硬度值（HV = 283–374）约为牙本质（HV = 53–63）的4至5倍4,5。在啮齿类动物氟斑牙模型中，经氟处理的小鼠门牙釉质显微硬度显著降低（HV = 136），而对照组釉质的硬度为HV = 3346,7。这表明氟斑釉质较软且较弱，其矿化程度较低而蛋白含量高于非氟斑釉质。显微硬度也被用于评估骨组织的力学性能。既往多项研究已探讨了来自不同解剖部位的人骨力学行为，包括长骨的显微硬度8,9,10。人类氟中毒股骨的平均显微硬度较非氟中毒股骨显著降低（氟中毒组HV = 222.4，非氟中毒组HV = 294.4）11。尽管显微硬度是一个有用的参数，但目前关于口腔疾病中牙槽骨显微硬度（无论是维氏硬度12还是努氏硬度13,14）的研究报道仍十分有限。
迄今为止，已有多种不同的显微硬度测量方法被报道。由于显微硬度值会因样品制备（抛光和表面平整度）以及压痕位置的不同而变化15，不同的实验方案可能导致研究结果之间存在差异。在口腔疾病模型中，显微硬度测试方案的标准化对于实现一致且准确的评估至关重要。在本研究中，我们展示了一种在小鼠氟斑牙模型和牙周骨吸收模型中对牙齿和牙槽骨进行显微硬度分析的标准化方案。
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方案
本方案中描述的所有操作均按照奥古斯塔大学和诺瓦东南大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的脊椎动物使用指南和法规进行，这两所大学均获得国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证。请注意，铃木博士在完成小鼠牙氟中毒实验时受聘于奥古斯塔大学。
1. 小鼠氟斑牙模型下颌切牙的拔除
- 从氟处理开始前1周起，直至氟处理结束，给予C57BL/6小鼠（5周龄，雄性）无氟饮食。
- 通过将 NaF 加入蒸馏水中制备氟化水，随后使用真空过滤 0.2 µm 过滤。给予动物含氟化钠的水（0 ppm 和 125 ppm；N=5/组） 随意摄取 持续6周，每2天将氟化水更换为新配制的批次。
- 在氟化物水处理6周后，使用CO₂处死动物2 随后进行断头处死。
- 从每只小鼠中取出带有门齿的半下颌骨。为采集带有门齿的半下颌骨，需在不施加过度力量的情况下切断下颌骨周围肌肉。
- 将半下颌置于磷酸盐缓冲液（PBS）中并保持 4 °C 直到 μ- CT分析（可选）。使用手术刀（#15）和剪刀将门齿与下颌分离，注意不要损坏或折断样本。
- 用 PBS 清洗分离的切牙，并通过将其浸入浓度递增的酒精（70% 和 100% 乙醇）中 2–3 小时进行脱水。
注意：如果组织（如牙髓）脱水不充分，可能会抑制树脂浸润，进而导致后续评估不充分。 - 用乙醇脱水后，将切牙水平包埋于树脂中。继续进行步骤3。
2. 小鼠结扎诱导的牙周骨吸收（L-PBR）模型中上颌牙槽骨的提取
- 向小鼠（C57BL/6，8–12周龄，雄性）腹腔注射（i.p.）0.8 mL 氯胺酮（100 mg/mL）+ 0.1 mL 赛拉嗪（Xylazine，100 mg/mL）+ 9.1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）作为麻醉剂，剂量为0.01 mL/g（体重）。在双眼涂抹眼用软膏，以防止麻醉期间角膜干燥。
- 将麻醉后的小鼠置于加热垫上5-10分钟。评估其对尾部或足趾夹捏的反应以及角膜反射的完整性。确认小鼠对有害刺激无反应且角膜反射消失。
- 将小鼠置于治疗台上，使用5-0丝线缝合线一端绑在治疗台的磁性支柱上，另一端固定以保持小鼠口腔张开。
- 在手术显微镜下，使用显微持针器将结扎线（6-0 编织丝线）围绕上颌第二磨牙一侧缠绕一圈（单层）。为减少分析时的个体差异，采用一侧作为处理侧，另一侧作为对照侧。
- 在腭侧打结并系紧结扎丝。打结后，将剩余的结扎丝尽可能剪短，以避免过长的结扎丝干扰咀嚼或进食。这一点至关重要，可确保在后续观察期间结扎丝不会因咀嚼而松脱。
注意：在动物恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得使其无人看管。动物在手术后未完全恢复前，不得放回与其他动物同处的环境中。在存活期间应维持无菌条件。 - 给小鼠喂食饲料和饮水 随意摄取 持续2周。结扎2周后，使用CO₂处死小鼠2 随后进行断头处死。
- 从每只小鼠中分离双侧上颌骨（结扎侧和对照侧）并保留磨牙。为获取带磨牙的上颌骨，使用剪刀剪除上颌周围肌肉和骨骼，注意避免施加过大外力。将每侧上颌骨置于磷酸盐缓冲液（PBS）中，并保存于 4 °C 直到 µCT 分析（可选）。
- 分离带有磨牙的牙槽骨（1st 至 3rd使用解剖刀（#15）和剪刀从上颌分离标本，注意不要损伤或折断标本。
- 用 PBS 清洗分离的肺泡骨，随后通过浸入浓度递增的酒精（70% 和 100% 乙醇）中脱水和脱脂，每步 2–3 小时。
注意：如果组织（如牙髓和骨组织）脱水不充分，可能会抑制树脂浸润，进而导致后续评估不充分。 - 乙醇脱水后，将牙槽骨水平包埋于树脂中。继续进行步骤3。
- 可选：执行 µCT 显微硬度测试前的评估
- 在进行显微硬度测试之前，先执行无损结构分析（例如， µCT) 使用同一试样进行显微硬度测试作为补充评估 (图1）。通过结构信息（三维图像、矿物密度、体积） µCT 可用于评估可能影响显微硬度结果的样品力学性能和质量。
图1：对照组与氟化物处理组小鼠门齿釉质的代表性μCT图像。（A）下颌门齿的代表性μCT矢状面图像。（B-D）对照组门齿（NaF 0 ppm）的μCT冠状面图像。（E-G）经NaF处理（125 ppm）门齿的μCT冠状面图像。图中显示代表性釉质矿物密度（EMD，g/cm3）。请点击此处查看该图的放大版本。
3. 将样品包埋于树脂中
- 从步骤1.7（氟斑牙模型）或步骤2.10（L-PBR模型）继续操作。
- 用一层薄薄的凡士林涂抹包埋杯（1英寸）的内表面。按照说明书配制树脂（冷固化包埋树脂），将树脂与固化剂按15:2的体积比倒入提供的塑料杯中，使用木刮刀仔细混合至少2分钟，避免产生气泡。
- 将已脱水和脱脂的切牙（图2A）或带有磨牙的牙槽骨（图2B）水平且平行于包埋杯底部放置（每杯一个样本）。
- 将混合好的树脂（用量适中，约1.5 mL）倒入包埋杯中，完全覆盖样本。避免加入过多树脂，因为多余的树脂会妨碍后续抛光过程（图2C、D）。将装有样本的包埋杯置于50 °C的加热板上至少8小时，以促进树脂聚合。此步骤有助于使样本保持稳定位置。
注意：根据样本大小调整树脂用量，确保完全覆盖样本即可。切勿加入过多树脂，否则将需要更长时间去除多余部分。 - 固化后，将含有样本的树脂块从包埋杯中取出。使用高级研磨抛光机，在流水冷却条件下，采用粗粒度防水砂纸（Grit 60/P60 和 120/P120）去除毛刺，并使样本平面与其对侧平面保持平行且平整。切牙和牙槽骨样本的高度应保持在约3 mm（图2E、F）。
注意：若样本在显微硬度测试后还需进行扫描电镜（SEM）分析，则样本厚度应约为3 mm，以确保后续SEM观察不受影响。过小的样本在研磨过程中更难操作。仅用于显微硬度测试的样本，其高度可增至约10–20 mm。 - 使用精密切片锯修整外部形状，制成矩形固体树脂块并修圆角（切牙样本尺寸约为宽30 mm、长10 mm（图2G）；牙槽骨样本尺寸约为宽10 mm、长5 mm（图2H））。
- 完成粗略形状修整后，使用超声波清洗器清除树脂块上的碎屑和颗粒（约1分钟）。然后进入步骤4。
图 2：树脂包埋与抛光流程示意图。（A）脱水和脱脂后的切牙。（B）L-PBR 中脱水和脱脂后的牙槽骨。（C, D）浸入树脂中的切牙与牙槽骨。（E, F）通过切除部分树脂，更便于对目标组织表面进行抛光。（G, H）将树脂边缘修圆以利于抛光操作。缩写：L-PBR = 结扎诱导的牙周骨吸收。请点击此处查看该图的放大版本。
4. 样品抛光
注意：在高级研磨抛光机上，通过水浸条件下使用防水砂纸（从粗到细）手动对样本进行抛光处理。
- 将粗粒度防水砂纸（粒径 600/P1200）放置于研磨机上。将已修整并清洁的树脂块（来自步骤 3.7）置于粗粒度防水砂纸上。
- 在加水的同时，手持树脂块，在研磨抛光机上对样品的待评估表面进行抛光（速度 1-10 x g）。此时应注意手持树脂块，使评估表面与地面保持平行。为确保评估表面完整，需用肉眼或显微镜检查表面。
注意：请注意研磨机为顺时针旋转，若施加均匀压力可能导致表面不平行。为获得平行表面，应保持抛光盘转速恒定，小心按压试样数秒后，将试样旋转 180° 并以相同时间按压。粗砂纸可能不仅去除树脂，还会损伤样品。 - 更换为粒径 800/P2400 的砂纸，并将树脂块放置其上。重复步骤 4.2。
- 使用超声波清洗器去除树脂块上的碎屑和颗粒（约 1 分钟）。
注意：建议在继续操作前使用超声波清洗器清除表面碎屑，以防堵塞。 - 接下来使用更细的砂纸进行逐级抛光；抛光顺序依次为 12 µm、9 µm、3 µm、1 µm 和 0.3 µm。
- 将研磨抛光机平台上的砂纸更换为研磨膜（12 µm），不旋转平台，将树脂块放置于研磨膜上。
注意：本实验中，研磨平台在水浸条件下适用于获得平整表面。也可使用大型平面镜（或类似物）提供平行性。 - 在水冷却条件下，手动小心地在研磨膜上对样品的评估表面进行抛光。在注水状态下，以 2 至 3 cm（1 英寸）的行程，分别在垂直、水平和对角方向上移动样品相同的时间。当抛光操作正确完成时，树脂样品将粘附于研磨膜上。
- 按照步骤 4.4 的方法清除碎屑和颗粒。根据逐级抛光顺序（从 12 µm 到 0.3 µm）更换为下一级粒径的砂纸，并将树脂块放置其上。
- 在加水的同时，手持树脂块，手动小心地在研磨膜上对样品表面进行抛光。按照步骤 4.4 的方法清除碎屑和颗粒。
- 重复步骤 4.5 至 4.8，完成最终抛光（0.3 µm）。完成最终抛光（0.3 µm）后，样品应具有镜面光洁的表面（图 3A）。
- 使用乙醇（100%）清洁样品表面，以脱脂和脱水，并将树脂块在室温下保存，直至进行显微硬度测试。储存期间应避免过度潮湿和灰尘。继续进行步骤 5。
5. 维氏显微硬度测试
注意：镜面抛光表面试样的压痕使用显微硬度计进行。测试采用维氏压头，载荷为25 g，保持时间为10秒。
- 前牙显微硬度测试（牙氟中毒模型）
注意：釉质从外（口腔侧）向内（牙髓侧）可分为三层，即表层、中层和深层（釉牙本质界，DEJ）。图3B)16在本方案中，测试了三层牙釉质。- 将加载力设置为25 g，加载时间为10 s。将树脂块放置于载物台上。
- 在每个牙釉质层（表层、中层和釉牙本质界）以及每个区域的牙本质（颈部、中段和尖端）上各压痕6个点； 图3B).
- 测量两条对角线的长度（d1 和 d2； 图3B) 计算维氏显微硬度值（HV； 图4).
- 牙槽骨维氏显微硬度测试（L-PBR模型）
- 将加载力设置为25 g，加载时间为10 s。将树脂块置于载物台上。
- 在牙槽嵴顶的近中和远中侧的牙槽骨上各压痕3-6个点。在1之间的牙槽骨上压痕st 和 2nd 摩尔（白色方块），以及 2nd 和 3rd 摩尔
注意：在本方案中，对照（完整）骨组织的近中和远中侧各评估6个点（共12个点），L-PBR则每侧各评估3个点（共6个点）。压痕点的数量取决于病损的状况（例如，骨量丢失过多会限制压痕区域）。
图3：下颌切牙显微硬度的评估区域。（A）包含下颌切牙的镜面抛光样品表面。（B）各区域的压痕；分别为颈部、中部和尖部（NaF 0 ppm）。（C）三层牙釉质；从釉牙本质界（DEJ）起，分别为内层、中层和外层釉质。缩写：D = 牙本质，E = 釉质，DEJ = 釉牙本质界 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：经NaF处理与未处理釉质的Vickers显微硬度。 对每个区域（颈部、中部和尖端区域）的牙本质及三层釉质的显微硬度进行了评估。(A-C) 对照组和(D-F) NaF (125 ppm) 处理组。数据以均值±标准差表示。采用单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey事后检验评估显著性差异。p 值 < 0.05 被认为具有统计学显著性。**p < 0.005，***p < 0.0005，****p < 0.0001 请点击此处查看该图的放大版本。
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结果
氟斑牙模型：图1展示了对照组和氟处理小鼠门齿的代表性μCT图像。在对照组中（图1B-D），颈区的釉质矿化密度（EMD）为1.188 g/cm3（图1B），低于中部（1.924 g/cm3）和尖端（1.819 g/cm3；图1C，D）。在氟处理组的釉质中（图1E-G），五个样本中仅有一个可用于评估颈区的EMD（0.835 g/cm3；图1E和补充图1）。所有区域的EMD均较对照组降低（图1F...
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讨论
显微硬度测试用于评估牙齿和骨骼等硬组织的力学性能。迄今为止，已有多种不同的显微硬度测量方法被报道。大多数测量信息，尤其是样本制备和压痕位点的描述，往往不够充分。本研究聚焦于牙氟斑病和牙周病模型中釉质和牙槽骨的显微硬度检测方案。为了获得一致且准确的结果，该方案中的关键步骤包括：树脂包埋时样本的取向、保持检测表面与地面平行、对检测表面进行逐级抛光以获得镜面效果，以及通过参考点确定压痕区域和位点。在树脂包埋和抛光过程中，必须通过肉眼或显微镜检查，确保检测表面始终与地面平行且表面完整无损。尽管属于可选步骤，但仍建议进行μCT分析以确定压痕位点。
在牙氟中毒模型中，NaF（125 ppm）处理导致从牙颈部至中部区域的釉质结构难以通过μCT识别。仅牙尖区域的釉质可与牙本质区分开来（图1和 补充图1）。因此，在牙氟中毒模型中评估釉质显微硬度时，应选择牙尖区域进行压痕测试。相应地，既往研究在牙氟中毒模型中均采用切牙釉质的牙尖区域进行评估...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究的报告工作获得了日本学术振兴会（JSPS）科研资助项目JP21K09915（MO）以及美国国立普通医学科学研究所的支持。 T34GM145509（MM）以及美国国家牙科与 颅面研究；R01DE025255 和 R21DE032156 (XH)；R01DE029709、R21DE028715 和 R15DE027851 （TK）；R01DE027648 和 K02DE029531（MS）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6-0 编织丝线缝合线 | Teleflex | ||
| Canica 小动物手术系统 | Kent Scientific Corporation | SURGI 5001 | |
| CarbiMet PSA 120/P120 | Buehler | 30080120 | |
| CarbiMet PSA 60/P60 | Buehler | 36080060 | |
| CarbiMet PSA 600/P1200 | Buehler | 36080600 | |
| Castroviejo 微型持针器 | F.S.T | 12060-01 | |
| Epofix 冷固化包埋树脂 | Electron Microscopy Science | CAT-1237 | |
| Fisherbrand 112xx 系列高级超声波清洗机 | Fisher Brand | FB11201 | |
| 无氟啮齿类动物饲料 | Bio Serv | F1515 | AIN-76A，1/2" 颗粒 |
| 活体微计算机断层扫描仪 Skyscan 1176 | Bruker | ||
| Isomet 1000 精密切割锯 | Buehler | MA112180 | |
| 研磨膜 0.3µm | Maruto Instrument Co., LTD. Japan | 26-4203 | 替代品 A3-0.3 SHT，3M USA |
| 研磨膜 1µm | Maruto Instrument Co., LTD. Japan | 26-4206 | 替代品 A3-1 SHT，3M USA |
| 研磨膜 12µm | Maruto Instrument Co., LTD. Japan | 26-4211 | 替代品 A3-12 SHT，3M USA |
| 研磨膜 3µm | Maruto Instrument Co., LTD. Japan | 26-4204 | 替代品 A3-3 SHT，3M USA |
| 研磨膜 9µm | Maruto Instrument Co., LTD. Japan | 26-4201 | 替代品 A3-9 SHT，3M USA |
| Leica wild 显微镜 | Leica | LEIC M690 | |
| Metaserv 2000 变速研磨抛光机 | Buehler | No: 557-MG1-1160 | |
| MicroCut PSA 1200/P2500 | Buehler | 36081200 | |
| MicroCut PSA P4000 | Buehler | 36084000 | |
| 显微硬度计 ALPHA-MHT-1000Z | PACE Technologies | ||
| SamplKups 1 英寸 | Buehler | No: 209178 | |
| 氟化钠 | Fisher Scientific | S299-100 | |
| Westcott 缝合剪刀 | JEDMED | Cat. #25-1180 | |
| ZooMed Repti Therm 底部加热垫（U.T.H） | Zoo Med Laboratories, Inc. | RH-4 |
参考文献
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重印与许可
