本方案描述了从培养人脂肪来源的间充质干细胞（ADSCs）、收集上清液到通过超速离心法提取细胞外囊泡（EVs）的全部操作步骤。
本文内容
摘要
摘要
人脂肪来源的间充质干细胞（ADSCs）能够促进多种组织和器官的再生与重建。近期研究表明，其再生功能可能归因于细胞间的直接接触以及细胞的旁分泌作用。旁分泌作用是细胞在短距离内相互作用和传递信息的重要方式，其中细胞外囊泡（EVs）作为载体发挥功能性作用。ADSC来源的EVs在再生医学中具有巨大潜力。已有大量研究报道了这些方法的有效性。目前已有基于离心、沉淀、分子大小、亲和性以及微流控等原理的多种EVs提取与分离方法。超速离心法被认为是分离EVs的金标准。然而，目前仍缺乏一套详细强调超速离心过程中注意事项的操作流程。本研究介绍了ADSC培养、上清液收集以及EV超速离心的关键步骤与方法。但尽管超速离心法成本较低且无需额外处理，仍存在一些不可避免的缺点，例如回收率较低以及EV聚集现象。
引言
大多数ADSCs来源于脂肪组织，已被证明可促进多种组织和器官的再生与重建，包括心肌、骨骼和皮肤1。近期研究表明，ADSCs的再生功能可能归因于细胞间的直接接触及其旁分泌效应2。旁分泌效应是细胞在短距离内相互作用和传递信息的重要方式，该功能主要通过细胞外囊泡（EVs）实现。
细胞外囊泡（EVs）是由细胞产生的双层膜结构，直径范围为40 nm至160 nm（平均约为100 nm）。它们可影响多种细胞功能，如细胞因子产生、细胞增殖、凋亡和代谢3,4。目前已有大量关于脂肪来源间充质干细胞（ADSC）EVs功能的研究，包括促进骨再生、口腔黏膜组织再生、移植后脂肪组织的存活以及皮肤伤口修复5,6,7,8，表明ADSC EVs在再生医学中具有巨大潜力。从上清液中提取和分离EVs的方法多种多样，包括基于离心、沉淀、分子大小、亲和性以及微流控技术的方法。其中，超速离心法被广泛认为是分离EVs的金标准9。超速离心分离EVs的基本原理在于样品中颗粒的沉降系数不同，从而在离心过程中沉降并聚集于不同的分离层。然而，目前尚未建立一套详细强调超速离心过程中注意事项的操作方案。
因此，本研究以逻辑清晰的信息流程和准确、正式的语言，客观地概述了脂肪来源干细胞（ADSC）的培养、上清液收集以及细胞外囊泡（EVs）超速离心的实验步骤与关键要点，为后续实验提供了有价值的参考。
方案
实验方案步骤的概述见图1。研究中所用试剂和设备的详细信息列于材料表中。
1. 培养基制备
- 使用450 mL基础培养基、50 mL无外泌体的胎牛血清和5 mL三联抗生素配制无外泌体的ADSC培养基。
2. 复苏与培养ADSCs
注意：复苏 ADSCs。
- 提前打开超净台的紫外辐射，消毒30分钟。
- 提前将培养基置于37 °C水浴中预热。
- 从液氮中取出2管冻存的脂肪来源间充质干细胞（ADSCs，P3代），在37 °C恒温水浴中轻轻振荡，直至完全解冻。
注意：冻存管管口不应接触水，以防污染。 - 用75%酒精对冻存管进行消毒，然后转移至超净台内。用移液器吸取细胞悬液，转移至15 mL离心管中。
- 将离心管放入低速离心机中，在4 °C条件下以250 × g离心5分钟。
- 准备四个10 cm培养皿，每个培养皿中加入9 mL培养基。标记名称、细胞类型、代数和实验日期，然后放入37 °C恒温细胞培养箱中预热。
- 对离心管进行消毒后移入超净台，用移液器吸除上清液。
- 加入4 mL培养基，轻轻吹打混匀（细胞密度为1 × 105 cells/mL），使细胞均匀分散。
注意：吸取上清液时注意不要吸出细胞沉淀。 - 向每个培养皿中加入1 mL细胞悬液，采用十字法轻轻振荡培养皿。
注意：将培养皿置于水平台面上，以十字交叉方式（上下左右移动）振荡5–6次，避免画圈，以免导致细胞在中心聚集。 - 在光学显微镜下以40倍物镜观察细胞，然后将培养皿放入培养箱中。
注意：观察细胞的主要目的是确认细胞是否分布均匀，分布不均将影响后续生长。 - 为细胞更换培养基。
- 提前打开超净台的紫外辐射，消毒30分钟。
- 提前将培养基置于37 °C水浴中预热。
- 在光学显微镜下以40倍物镜观察细胞状态，细胞融合度约为50%。
注意：细胞融合度是指细胞贴壁并充分伸展后，其占据的面积与培养皿表面积的比值。 - 将培养皿消毒后转移至超净台（生物安全二级），吸除旧培养基。
- 用2 mL PBS溶液轻轻冲洗每个培养皿两次。
- 向每个培养皿中加入10 mL新鲜培养基，将培养皿转移至培养箱中。
3. 收集ADSCs上清液并提取EVs
- 提前开启超净台的紫外辐射，消毒30分钟。
- 在显微镜下观察细胞状态，融合度约为80%。
- 消毒后将培养皿转移至超净台内，小心用移液器收集上清液，并转移至50 mL离心管中。
注意：细胞可选择冻存或丢弃。若无需保持无菌，后续步骤可在操作台进行。此时实验可暂停，待后续继续。若实验中断，上清液可在4 °C冰箱中保存不超过一周，不建议长期保存，以免影响细胞外囊泡（EVs）的活性。最佳做法是立即提取EVs。 - 离心（300 × g，10分钟，室温）以去除悬浮细胞，用移液器收集上清液。
注意：不要倾倒，保留少量上清液以防止吸出沉淀。 - 离心去除细胞碎片（2000 × g，10分钟，4 °C），继续用移液器收集上清液。
注意：关键操作要点与步骤3.4相同。 - 使用0.22 µm滤膜过滤上清液，以去除大颗粒和细胞碎片。
注意：过滤前先用2 mL无菌PBS润湿滤膜。 - 在超速离心机中离心（10,000 × g，30分钟，4 °C）。
- 随后在4 °C条件下以100,000 × g离心70分钟，弃去沉淀并收集上清液。
注意：通过多次离心纯化所获得的EVs，以提高其纯度。沉淀可能肉眼不可见，因此操作移液器时务必轻柔，并在管底保留少量上清液，避免吸入沉淀。 - 用移液器移除上清液，将沉淀用PBS重悬，再次离心（100,000 × g，70分钟，4 °C）。
注意：沉淀可能肉眼不可见，因此用移液器吸取上清液时，必须轻柔且彻底地去除上清液，以最大程度提高EVs的纯度。 - 移除上清液，获得EVs沉淀。用1 mL PBS重悬沉淀，转移至1 mL离心管中，置于4 °C冰箱中保存，用于后续检测。
注意：沉淀可能肉眼不可见，因此用移液器吸取上清液时，务必轻柔且彻底地去除上清液，以最大程度提高EVs的纯度。若样品需长期保存，应置于-80 °C冰箱中。
结果
首先，对ADSCs进行了表征与鉴定，包括其形态学特征10和表面抗体表达。根据图2A可知，ADSCs呈 spindle 形排列，在密集生长后形成涡旋状结构。培养的细胞可向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化，并分别用油红O、茜素红和阿利新蓝进行染色11。诱导分化实验及流式细胞术结果证实，这些细胞确为具有多向分化潜能的ADSCs。然而，结果中显示有22%的细胞CD45呈阳性，但由于存在足够的阳性和阴性抗体支持，该结果不影响最终结论（图2A、B）。
接下来，对提取的细胞外囊泡（EVs）进行鉴定至关重要。鉴定主要包括三个方面：形态、粒径和标志蛋白。透射电镜（TEM）结果清晰地显示了具有双层膜结构的杯状EV形态12（图3A）。纳米颗粒追踪分析（NTA）表明，EVs的粒径分布约为50–150 nm，浓度约为1.6 × 1010 粒粒/mL（图3B）。Western Blot分析还显示，EVs的标志蛋白（包括CD9、CD63和TSG10113）均得到良好表达（图3C）。
图 1：实验方案步骤概览。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：ADSCs 的表征。（A）ADSCs 呈梭形形态。将 ADSCs 分别在成脂、成骨和成软骨诱导培养基中进行培养。通过油红O染色鉴定成脂分化，通过茜素红染色和阿利新蓝染色分别确认成骨和成软骨分化。比例尺：100 µm。（B）ADSCs 的流式细胞术分析，检测间充质干细胞表面标志物（CD90、CD105、CD29 和 CD73）以及造血细胞特异性标志物（CD31、CD34、CD45 和 HLA-DR）。设门策略：首先圈选空白对照组，以此为基础，根据各组标记的抗体依次圈选 CD90、CD105、CD29、CD73、CD31、CD34、CD45 和 HLA-DR。本图改编自 Han, Y. D. 等人13。请点击此处查看此图的放大版本。
图 3：细胞外囊泡（EVs）的表征。（A）透射电镜（TEM）结果清晰地显示出双层膜结构的杯状 EV 形态。比例尺：200 nm。（B）纳米颗粒跟踪分析（NTA）表明，EVs 的粒径分布约为 50–150 nm，浓度约为 1.6 × 1010 粒子/mL。（C）通过 Western 印迹法检测外泌体中 TSG101、CD9 和 CD63 的表达。本图改编自 Han, Y. D. 等人13。请点击此处查看该图的高清版本。
讨论
在正式的实验过程中，有几个关键点对于获得最佳实验结果至关重要。根据我们以往的经验，建议选用第3至第6代的脂肪来源间充质干细胞（ADSCs），以确保细胞处于最佳状态。在第3代之前，红细胞、内皮细胞及其他杂细胞可能尚未被充分筛选去除；而在第6代之后，细胞可能逐渐老化，从而影响分泌的细胞外囊泡（EVs）的状态。其次，收集上清液时应确保细胞融合度在80%至90%之间，以保证尽可能充分地分泌大量EVs。为了保持EVs的最高纯度，研究人员在前三次离心过程中必须谨慎操作，确保不留任何液体残留，防止杂质混入或沉淀被吸出。在最后两次离心过程中，应彻底去除上清液，同时注意保护沉淀物。
超速离心法成本较低，且无需进一步处理。该技术已广泛应用于细胞外囊泡（EV）研究，并通过表征实验验证了其在获取EV方面具有令人满意的效率。然而，该方法仍存在一些不可避免的缺点：首先，EV的回收率较低；其次，EV有时容易发生聚集；此外，可能同时分离出非细胞成分，且部分EV在过程中可能发生破裂，导致碎片积累14,15,16。为克服这些缺陷，目前大多数研究集中于EV的纯化12,13。然而，本方案涵盖了从细胞培养到外泌体纯化的完整流程，因为我们认为整个操作过程均会影响最终提取EV的状态与纯度。操作过程中严格遵循上述指南至关重要。此外，收集更多上清液并采用三维（3D）细胞培养可能更有利，因为大量研究已证实，与二维（2D）培养相比，3D培养在促进EV分泌方面更具优势17,18。
本方案概述了使用超速离心法从脂肪来源间充质干细胞（ADSCs）中提取细胞外囊泡（EVs）的流程。该方案提供了实用的操作指导，帮助实验人员在操作过程中尽可能避免遗漏细节。总之，本方案有助于提高样品质量，并提醒我们：在关注每一步骤细节的同时，还应将实验作为一个整体来考虑。
披露
作者声明无经济利益冲突。
致谢
本工作部分得到了中国国家自然科学基金（82202473）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Supor 膜针头滤器 | Acros Organics | 4652 | 0.22 μm |
| 细胞培养基础培养基 | OriCell | BHDM-03011 | |
| 无外泌体胎牛血清 + 培养补充剂（用于人脂肪来源间充质干细胞） | OriCell | HUXMD-05002 | |
| 倒置显微镜 | OLYMPUS | Lx70-S8F2 | |
| 低速离心机 | 安徽优胜特克中科科学仪器有限公司 | SC-3612 | |
| 诺卡霉素 | InvivoGen | ant-nr-05 | |
| Optima Max-XP 台式超速离心机 | 贝克曼库尔特 | 393315 | |
| 青霉素-链霉素-庆大霉素溶液（100 倍浓缩） | Solarbio | P1410 |
参考文献
- Al-Ghadban, S., Artiles, M., Bunnell, B. A. Adipose stem cells in regenerative medicine: Looking forward. Front Bioeng Biotechnol. 9, 837464(2021).
- Xin, H., Li, Y., Chopp, M. Exosomes/miRNAs as mediating cell-based therapy of stroke. Front Cell Neurosci. 8, 377(2014).
- Li, Q., et al. The tissue origin effect of extracellular vesicles on cartilage and bone regeneration. Acta Biomater. 125, 253-266 (2021).
- Gao, X., Salomon, C., Freeman, D. J. Extracellular vesicles from adipose tissue-a potential role in obesity and type 2 diabetes. Front Endocrinol (Lausanne). 8, 202(2017).
- Zheng, Y., et al. Production and biological effects of extracellular vesicles from adipose-derived stem cells were markedly increased by low-intensity ultrasound stimulation for promoting diabetic wound healing). Stem Cell Rev Rep. 19 (3), 784-806 (2023).
- Mou, S., et al. Extracellular vesicles from human adipose-derived stem cells for the improvement of angiogenesis and fat-grafting application. Plast Reconstr Surg. 144 (4), 869-880 (2019).
- Li, W., et al. Tissue-engineered bone immobilized with human adipose stem cells-derived exosomes promotes bone regeneration. ACS Appl Mater Interfaces. 10 (6), 5240-5254 (2018).
- Han, B., et al. Adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicles inhibit the fibrosis of fibrotic buccal mucosal fibroblasts via the microRNA-375/foxf1 axis. Stem Cells Int. 2021, 9964159(2021).
- Brezgin, S., et al. Technological aspects of manufacturing and analytical control of biological nanoparticles. Biotechnol Adv. 64, 108122(2023).
- Kim, S. H., et al. Character comparison of abdomen-derived and eyelid-derived mesenchymal stem cells. Cell Prolif. 46 (3), 291-299 (2013).
- Gan, L., et al. Exosomes from adipose-derived mesenchymal stem cells improve liver fibrosis by regulating the miR-20a-5p/TGFBR2 axis to affect the p38 MAPK/NF-κB pathway. Cytokine. 172, 156386(2023).
- Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy. J Vis Exp. (131), e56482(2018).
- Han, Y. D., et al. Co-transplantation of exosomes derived from hypoxia-preconditioned adipose mesenchymal stem cells promotes neovascularization and graft survival in fat grafting. Biochem Biophys Res Commun. 497 (1), 305-312 (2018).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509(2015).
- Lamparski, H. G., et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J Immunol Methods. 270 (2), 211-226 (2002).
- Baranyai, T., et al. Isolation of exosomes from blood plasma: Qualitative and quantitative comparison of ultracentrifugation and size exclusion chromatography methods. PLoS One. 10 (12), e0145686(2015).
- Yuan, X., et al. Engineering extracellular vesicles by three-dimensional dynamic culture of human mesenchymal stem cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12235(2022).
- Eguchi, T., et al. Organoids with cancer stem cell-like properties secrete exosomes and HSP90 in a 3D nanoenvironment. PLoS One. 13 (2), e0191109(2018).
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