从人脂肪来源的间充质干细胞中纯化和表征细胞外囊泡

摘要

该方案描述了所有程序，从培养人脂肪来源的间充质干细胞 （ADSC） 和收集上清液到使用超速离心提取细胞外囊泡 （EV）。

摘要

人脂肪来源的间充质干细胞 （ADSC） 可以促进各种组织和器官的再生和重建。最近的研究表明，它们的再生功能可能归因于细胞间接触和细胞旁分泌效应。旁分泌效应是细胞在短距离内相互作用和传递信息的重要方式，其中细胞外囊泡 （EV） 作为载体发挥着功能作用。ADSC EV 在再生医学中具有巨大潜力。多项研究报告了这些方法的有效性。目前根据离心、沉淀、分子大小、亲和力和微流体等原理描述了提取和分离 EV 的各种方法。超速离心法被认为是分离 EV 的金标准。尽管如此，仍然缺乏强调超速离心过程中预防措施的细致方案。本研究介绍了 ADSC 培养、上清液收集和 EV 超速离心所涉及的方法和关键步骤。然而，尽管超速离心具有成本效益并且不需要进一步处理，但仍存在一些不可避免的缺点，例如回收率低和 EV 聚集。

引言

大多数 ADSC 来源于脂肪组织，并已被证明可促进各种组织和器官的再生和重建，包括心肌、骨骼和皮肤¹。最近的研究表明，ADSC 的再生功能可能是由于细胞间接触和细胞旁分泌作用²。旁分泌效应是细胞在短距离内相互作用和传递信息的重要手段，这一功能是通过细胞外囊泡 （EV） 实现的。

EV 是由细胞产生的双层膜结构，直径范围为 40 nm 至 160 nm（平均约为 100 nm）。它们影响不同的细胞功能，例如细胞因子产生、细胞增殖、细胞凋亡和代谢 ^3,4。已经对 ADSC EV 的功能进行了大量研究，包括促进骨再生、口腔粘膜组织再生、组织移植后脂肪组织存活和皮肤伤口修复 5,6,7,8。ADSC EV 在再生医学中的巨大潜力是显而易见的。从上清液中提取和分离 EV 的方法多种多样，例如基于离心、沉淀、分子大小、亲和力和微流体的技术。超速离心法被广泛认为是分离 EV 的金标准⁹。用于 EV 分离的超速离心的基本原理是基于这样一个事实，即样品中的颗粒具有不同的沉降系数，导致它们在不同的分离层中沉降和聚集。然而，尚未建立强调超速离心过程中预防措施的详细方案。

因此，本研究客观地概述了 ADSC 培养、上清液收集和 EVs 超速离心程序和关键点，具有逻辑信息流和清晰、正式的语言。这为未来的实验提供了有价值的参考。

方案

协议步骤的概述如图 1 所示。材料 表中列出了研究中使用的试剂和设备的详细信息。

1. 培养基制备

1. 使用 450 mL 基础培养基、50 mL 不含外泌体的胎牛血清和 5 mL 三联抗生素制备不含外泌体的 ADSC 培养基。

2. ADSC 的复苏和培养

注意:复苏 ADSC。

1. 事先打开超净台的紫外线辐射并消毒 30 分钟。
2. 事先在 37 °C 水浴中预热培养基。
3. 从液氮中检索 2 管冷冻的 ADSC （P3），并在 37 °C 恒温水浴中搅拌直至完全解冻。
   注意: 冷冻管的开口不应与水接触，以防止污染。
4. 使用 75% 酒精对冻存管进行消毒，然后将其移至超净台上。使用移液管吸出细胞悬液，并将其放入 15 mL 离心管中。
5. 将离心管放入低速离心机中，并在 4 °C 下以 250 x g 离心 5 分钟。
6. 准备四个 10 cm 培养皿，并将 9 mL 培养基放入每个培养皿中。标记名称、细胞类型、世代和实验日期，然后在 37 °C 恒温细胞培养箱中预热。
7. 对离心管进行消毒，并将其移至超净台上。用移液管去除上清液。
8. 加入 4 mL 培养基，轻轻搅拌溶液（1 x 10⁵ 个细胞/mL），直至其均匀分散。
   注:提取上清液时注意不要去除细胞沉淀。
9. 向每个培养皿中加入 1 mL 细胞悬液。用十字法摇晃盘子。
   注意:将板放在水平面上，并以交叉模式搅拌（向上、向下、向左和向右移动）重复 5-6 次。避免圆周运动，因为它们可能会导致细胞在中心积聚。
10. 用光学显微镜以 40 倍放大倍率观察细胞，然后将培养皿放入培养箱中。
    注意:观察细胞的主要目的是确定它们是否均匀分布，因为分布不均匀会影响后续生长。
11. 为细胞准备交换培养基。
    1. 事先打开超净台的紫外线辐射并消毒 30 分钟。
    2. 事先在 37 °C 水浴中预热培养基。
    3. 在光学显微镜下以 40 倍放大倍率观察细胞状态。汇合度约为 50%。
       注意:汇合水平计算为细胞粘附在壁上并完全拉伸后细胞占据的面积与培养皿表面积的比率。
    4. 消毒后将培养皿转移到超净台（生物安全 2 级）上，并去除培养基。
    5. 用 2 mL PBS 溶液轻轻冲洗每个培养皿两次。
    6. 向每个培养皿中加入 10 mL 培养基。将培养皿转移到培养箱中。

3. 收集 ADSCs 上清液并提取 EV

1. 事先打开超净台的紫外线辐射并消毒 30 分钟。
2. 在显微镜下观察细胞状态。汇合度约为 80%。
3. 消毒后将培养皿转移到超净台上。用移液管小心收集上清液，并将其放入 50 mL 离心管中。
   注意:细胞可以冷冻或丢弃。如果不需要无菌，可以在手术台上执行以下步骤。此时，可以暂停实验，然后稍后重新启动。如果实验停止，请将上清液储存在 4 °C 冰箱中不超过一周。不建议长期存放，因为它可能会影响 EV 的活动。最佳方法是立即提取 EV。
4. 离心（300 x g，10 分钟，在室温下）以去除悬浮细胞。用移液管收集上清液。
   注意:不要倒。留下少许上清液，以防止沉淀被吸走。
5. 离心以去除细胞碎片（2000 x g ，10 分钟，4 °C），然后继续用移液管收集上清液。
   注意:关键点与步骤 3.4 相同。
6. 用 0.22 um 膜过滤上清液，以去除大颗粒和细胞碎片。
   注:过滤前用 2 mL 无菌 PBS 过滤上清液以润湿滤膜。
7. 在超速离心机中离心（10,000 x g ，30分钟，4°C）。
8. 接下来，在 4 °C 下以 1,00,000 x g 离心 70 分钟，以去除沉淀并收集上清液。
   注意:通过多次离心纯化获得的 EV 以提高其纯度。肉眼可能无法看到颗粒。因此，轻柔操作移液器并在底部留下少许上清液以避免沉淀至关重要。
9. 用移液管去除上清液。用 PBS 重悬沉淀并离心（1,00,000 x g，70 分钟，4 °C）。
   注意:肉眼可能无法看到颗粒。因此，当用移液管吸出上清液时，温和彻底地去除上清液以最大限度地提高 EV 的纯度至关重要。
10. 去除上清液并获得 EVs 沉淀。用 1 mL PBS 重悬，将其转移到 1 mL 离心管中，并储存在 4 °C 冰箱中以供后续检测。
    注意:肉眼可能无法看到颗粒。因此，当用移液管吸出上清液时，温和彻底地去除上清液以最大限度地提高 EV 的纯度至关重要。如果长时间不需要样品，请将其存放在 -80 °C 冰箱中。

结果

首先，对 ADSCs 进行表征和鉴定，包括其形态学¹⁰ 和表面抗体。根据 图 2A，很明显 ADSCs 呈纺锤形排列，并在密集生长后形成涡旋。将培养的细胞分化为脂肪生成细胞、成骨细胞和成软骨细胞，并用油红 O 、 茜素红 和 阿尔新蓝¹¹ 染色。诱导分化实验和流式细胞术验证了它们确实是具有多向分化潜力的 ADSC。然而，22% 的细胞在结果中为 CD45 阳性，这不会影响结论，因为有足够的阳性和阴性抗体支持它（图 2A、B）。

接下来，识别提取的 EV 至关重要。主要包括形态、粒径和标志蛋白三个方面。TEM 结果清楚地揭示了具有双层膜¹² 的杯状 EV 结构（图 3A）。NTA 表明 EV 的粒径分布约为 50-150 nm，浓度约为 1.6 x 10¹⁰ 粒/mL（图 3B）。Western Blot 分析还显示，EV 的标志蛋白，包括 CD9、CD63 和 TSG101¹³，表达顺畅（图 3C）。

图 1:协议步骤概述。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:ADSC 的表征。 （A） ADSCs 的形态呈梭形。在培养基中培养 ADSCs 分别用于脂肪生成、成骨和软骨生成分化。通过油红 O 染色鉴定成脂分化。茜素红染色和阿尔新蓝染色分别证实了成骨和软骨形成分化。比例尺:100 μm。（B） ADSCs 的流式细胞术分析 MSC 表面标志物（CD90、CD105、CD29 和 CD73）和造血细胞特异性标志物（CD31、CD34、CD45 和 HLA-DR）。门控策略:先圈出空白组。在此基础上，根据每组标记抗体依次圈 CD90 、 CD105 、 CD29 、 CD73 、 CD31 、 CD34 、 CD45 和 HLA-DR。该图改编自 Han， Y. D. et ^al.13。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:EV 的表征。 （A） TEM 结果清楚地揭示了双层膜的杯状 EV 结构。比例尺:200 nm。（B） NTA 表明 EV 的粒径分布约为 50-150 nm，浓度约为 1.6 x 10¹⁰ 粒/mL。（C） 通过 Western blot 检测外泌体中 TSG101、CD9 和 CD63 的表达。该图改编自 Han， Y. D. et ^al.13。 请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

在正式的实验过程中，有几点对于获得最佳实验结果至关重要。根据我们以前的经验，建议选择第 3-6 代 ADSC，因为它们可以确保最佳的细胞状态。在 P3 之前，红细胞、内皮细胞和其他杂细胞可能没有被筛选出来。P6 之后，细胞可能会逐渐老化，这会影响分泌的 EV 的状态。其次，当细胞汇合度在 80% 和 90% 之间时，必须收集上清液，以确保尽可能多地分泌 EV。为了保持 EV 的最大纯度，研究人员在前三次离心过程中必须小心，并确保没有残留液体，以防止吸入杂质和颗粒。在最后两次离心过程中，确保在保护沉淀的同时完全去除上清液。

超速离心具有成本效益，无需进一步处理。该技术已广泛用于 EV 研究，并且已证明在获得 EV 方面具有令人满意的效率，表征实验证实了这一点。尽管如此，还是有一些不可避免的缺点。首先，电动汽车回收率低。其次，电动汽车有时会聚集。此外，可以分离非细胞成分，一些 EV 在此过程中可能会破裂，导致碎片积累 14,15,16。为了解决这些缺陷，大多数研究都集中在纯化电动汽车上^12,13。然而，该方案涵盖了从细胞培养到外泌体纯化的整个过程，因为我们认为整个过程会影响最终提取的 EV 的状态和纯度。在操作过程中遵守上述准则至关重要。此外，收集更多的上清液并实施 3D 细胞培养可能是有益的，因为大量研究表明，与 2D 培养相比，3D 培养在刺激 EV 分泌方面更有效^17,18。

该协议概述了使用超速离心从 ADSC 中提取 EV 的过程。它提供实用指导，使实验者能够在操作过程中尽可能避免细节。总之，该协议帮助实验者提高样品质量，并提醒我们不仅应该关注每个步骤的细节，还应该将实验作为一个整体来考虑。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Acrodisc Sys Organics	4652	的Supor膜针式过滤器	m
细胞培养基础培养基	OriCell	BHDM-03011
无 EXO + 培养添加剂的胎牛血清（用于人脂肪来源的间充质干细胞）	OriCell	HUXMD-05002
倒置显微镜	OLYMPUS	Lx70-S8F2
低速离心机	安徽中国科学技术大学 Zonkia Scientific Instruments Co.，Ltd.	SC-3612
Normocin	InvivoGen	ant-nr-05
Optima Max-XP 台式超速离心机	Beckman Coulter	393315
青霉素-链霉素-庆大霉素溶液 （100x）	Solarbio	P1410