EUCAST 已开发出一种用于自动化血培养的直接抗菌药物敏感性试验（AST）方案。然而，通过在自动化微生物鉴定系统中采用直接接种物制备方案，可避免对该方法依赖于质谱法进行微生物鉴定的需求。该方法可在样本采集后 24 小时内提供 AST 报告。
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摘要
摘要
革兰阴性菌（GN）败血症是一种医疗急症，在资源有限的环境中，其管理依赖于传统的微生物培养技术，通常需要3-4天才能获得结果。鉴于此类检测周转时间（TAT）较长，EUCAST和CLSI均已制定了直接从自动血培养瓶阳性报警样本（+aBCs）中测定抗菌药物敏感性试验（AST）结果的操作规程。EUCAST快速AST（RAST）方案于2018年首次推出，该方案针对四种常见的GN败血症致病菌，规定了抑菌圈直径的折点值，即 大肠杆菌，肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌，以及 鲍曼不动杆菌 复合体的检出可被报告。然而，已将此方法纳入常规工作流程的临床实验室依赖于基于质谱的微生物鉴定技术，该技术不易获得，从而限制了其在资源有限环境中的应用。为克服这一限制，我们评估了一种直接接种法（DIP），联合使用商用的自动化微生物鉴定与抗菌药物敏感性试验系统（aMIAST），以实现在血培养瓶阳性报警后8小时内完成早期微生物鉴定。我们于2023年1月至10月期间评估了该方案在阳性报警血培养（aBC）中鉴定四种需报告的革兰阴性菌（RR-GN）的效果。DIP所得的微生物鉴定结果与aMIAST中标准接种法（SIP）的结果进行了比较。在204例单一致病性革兰阴性菌阳性的血培养（+naBC）样本中，SIP方法在105例+naBC中鉴定出4种RR-GN之一大肠杆菌： 50, 肺炎克雷伯菌： 20, 铜绿假单胞菌： 9 和 A. baumannii 复合体：26）。其中，DIP 正确鉴定出 94%（98/105），主要错误率和极主要错误率分别为 6%（7/105）和 1.7%（4/240）。当采用 EUCAST RAST 方法进行微生物鉴定的 DIP 检测时，可在接收样本后 24 小时内提供初步临床报告。该方法有望显著缩短周转时间（TAT），从而实现早期启动适当的抗菌治疗。
引言
脓毒症是一种重要的全球健康问题，定义为因宿主对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍。《全球疾病负担研究》估计，2017年全球有4890万例脓毒症病例，脓毒症相关死亡人数达1100万，约占全球死亡总数的20%1约三分之二rd 由革兰氏阴性细菌病原体引起的血流感染（BSI）导致的死亡率2革兰阴性菌（GN）感染导致死亡的主要原因包括 大肠杆菌, 肺炎克雷伯菌, 铜绿假单胞菌，以及 鲍曼不动杆菌, 占33种细菌病原体病例总数的约40%2.
血培养仍是诊断血流感染（BSI）的金标准，快速进行微生物鉴定并获得抗菌药物敏感性试验（AST）结果是临床管理的关键。据估计，在脓毒症治疗中，每延迟一小时使用适当的抗菌药物，死亡风险增加9%3。在资源有限的环境中，即使使用自动化系统，现有微生物学工具从血培养阳性到获得AST结果的周转时间（TAT）仍需约48–72小时。由于这一不理想的TAT，临床常经验性使用广谱抗菌药物，从而加剧了抗菌药物耐药（AMR）日益严重的问题。鉴于迫切需要缩短脓毒症微生物培养技术的TAT，EUCAST和CLSI正逐步推动直接从阳性报警的血培养瓶（+aBC）中进行AST4,5。
2018年，EUCAST首次提出了快速药敏试验（RAST）方法，即通过纸片扩散法（Kirby-Bauer法）在较短的孵育时间（如4小时、6小时和8小时）内直接从+aBC进行药敏试验测定6,7该方法目前已被验证可用于检测含有引起血流感染最常见的8种病原体之一的革兰阳性菌的抗菌药物敏感性 E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa，以及 A. baumannii 复合物 在革兰氏阴性菌中 金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌 和 肺炎链球菌 在革兰氏阳性菌中8不同时间点进行药敏试验（AST）的折点依据上述所列微生物种类而定。因此，在对AST结果进行类别解释之前，必须先完成微生物鉴定。然而，快速药敏试验（RAST）标准并未规定在此时间范围内实现微生物鉴定的具体方法。
大多数在其所在环境中评估 EUCAST RAST 方法的研究，在平板培养基上短时间孵育后，采用基于质谱的微生物鉴定技术来鉴定微生物9,10,11,12,13,14,15,16,17。然而，质谱仪尚未广泛普及，尤其是在中低收入国家（LMICs），这极大地限制了该方法的潜在应用价值。少数研究报道了在未使用质谱技术的情况下于其所在中心实施该方法的情况18,19,20。Tayşi 等人18在解读药敏试验（AST）结果前，根据革兰染色形态和氧化酶试验，将革兰阴性菌（GN） broadly 分类为肠杆菌目（Enterobacterales）、假单胞菌属（Pseudomonas）和不动杆菌属（Acinetobacter） spp.。Gupta 等人19和 Siddiqui 等人20来自同一中心的其他研究则通过从阳性报警的血培养肉汤混合物中制备细菌沉淀，并将其接种于传统生化试验中，完成种水平的微生物鉴定。尽管 Tayşi 等人18未对其鉴定方法的准确性进行评价，Gupta 等人19报告称，在 165/176（94%）的病例中，其方法可鉴定出可报告 RAST 结果的革兰阴性菌（RR-GN），即大肠埃希菌（E. coli）、肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）、铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和鲍曼不动杆菌复合群（A. baumannii complex）。然而，在后一种方法中，RAST 结果的判读是在传统生化试验完全孵育（即接种后 18–24 小时）完成后，仅依据 8 小时的抑菌圈直径折点进行回顾性分析，因此平均报告时间约为 2 天。
为了进一步缩短临床报告的周转时间（TAT），我们提出一种替代方法，利用自动化微生物鉴定系统（aMIAST）实现对阳性血培养（+aBCs）中革兰氏阴性菌（GN）的早期识别。在基于质谱的微生物鉴定系统出现之前，这些自动化鉴定系统被认为是微生物鉴定的临床标准，其原理是将待测细菌接种于含有微型生化试验的鉴定卡中，通过检测细菌引起的比色或荧光变化，并将结果与系统内置的菌株数据库进行比对以实现鉴定。这类系统的平均鉴定时间约为4至8小时，但其应用受限于制造商建议需对微生物进行过夜培养后，方可接种相应的鉴定卡。这一要求极大地限制了其在缩短报告时间方面的实用性。
目前仅有少数研究评估了利用这些自动化系统直接从阳性血培养瓶（+aBCs）中鉴定微生物的方法21,22,23,24,25,26,27。对于含有单一种革兰阴性菌（GN）的阳性血培养瓶，大多数研究表明，直接从阳性血培养液混合物中离心获得的菌体沉淀进行接种，其鉴定结果与标准菌落培养法具有极好的一致性。然而，对于革兰阳性菌，两者的一致性率则不够理想。由于阳性血培养瓶的平均报阳时间在8小时至16小时之间，而在自动化微生物鉴定系统中鉴定革兰阴性菌所需时间约为4至8小时，我们推测，若在自动化微生物鉴定中采用直接接种法，可在样本接收后24小时内完成对含有RR-GN的阳性血培养瓶的临床报告。
研究场所
本研究于2023年1月至10月期间，在印度中部一家拥有950张床位、具有国家重要性的学术型三级医疗中心（INI）的临床细菌学实验室进行。该实验室配备有连续血液培养监测系统（CBCMS）和自动化微生物鉴定与药敏试验系统（aMIAST）。细菌学实验室全天候运行，配有技术人员和微生物学家，可对任何阳性报警的血培养瓶（+aBCs）进行处理和报告。
本研究所采用的微生物学方法
研究的工作流程如图1所示。对于革兰阴性杆菌呈单态生长的需氧血培养物（+naBC），直接接种于相应的鉴定卡片，采用EUCAST RAST方案进行微生物鉴定和药敏试验（AST）。这些结果与需氧血培养物的标准诊疗方法（SoC）进行比较，标准方法即：将样本接种于传统的平板培养基——绵羊血琼脂（SBA）、巧克力琼脂（CA）和麦康凯琼脂（MA），在需氧条件下孵育16至24小时，待出现单个菌落后，使用aMIAST系统提供的鉴定和药敏卡片进行鉴定与药敏试验。在初始革兰染色或平板培养基上显示为革兰阳性球菌、革兰阳性杆菌、出芽酵母样细胞，或含有两种及以上不同微生物的血培养样本，均被排除在本研究之外。
方案
该研究由博帕尔全印度医学科学研究所（AIIMS Bhopal）授予古普塔博士（Dr. Ayush Gupta）的院内科研基金资助，并已获得机构人类伦理委员会（IHEC）批准，批准文号：IHEC-LOP/2022/IL072。
注意：样本体积 5 ml 的选择依据来自 Quesada 等人25 和 Munoz-Davila 等人27 的研究。
1. 使用aMIAST进行细菌鉴定的标准接种物方案（SIP）
- 佩戴洁净手套，在II级生物安全柜（BSC）内，使用含70%异丙醇的棉签对+naBC的隔膜进行消毒。
- 使用带有21 G针头的无菌注射器抽取约1 mL血液-肉汤混合物。
- 将针头中的血液-肉汤混合物挤出一大滴至平板培养基表面，即SBA、CA和MA平板。对平板进行划线接种后，将培养皿置于37 °C ± 2 °C的孵育箱中，在有氧条件下孵育18–24小时。
- 孵育结束后，在生物安全柜中检查平板上是否出现孤立菌落，并进一步通过aMIAST进行鉴定和抗菌药物敏感性试验（AST）。
- 对于每个分离株，将aMIAST聚苯乙烯管放入aMIAST试管架中，并使用连接在生理盐水瓶上的分配器向管中加入3 mL无菌生理盐水。
- 用无菌直接种环接触3至5个形态相似的菌落，将细菌接种物转移至第一支试管中。
- 使用浊度计，在接种后的试管中用无菌生理盐水调节菌悬液浊度至0.47–0.63麦氏单位（McFarland）。
- 将革兰阴性aMIAST鉴定卡的毛细管附件插入第一支试管中。
- 将选定的卡片放置在卡匣的适当位置。卡匣中的接种物已准备就绪，进入aMIAST系统的加样区域。
注意：菌悬液配制后至接种卡片前的时间不得超过30分钟。 - 将卡匣装入加样室指定位置，样品条形码朝内。
- 关闭门，然后在用户界面屏幕上点击加样。加样过程为70秒循环。循环完成后，系统上的蓝色指示灯将闪烁。将卡片装入aMIAST系统后，仪器会自动将接种物分配至卡片内的各个微小反应腔室中。
- 从加样室取出卡匣，关闭门，然后将其放入加载室。系统将自动扫描条形码，并与虚拟卡匣电子工作列表进行核对。吸管将自动密封，卡片自动装入转盘。aMIAST上闪烁的蓝色箭头表示加载已完成。
- 操作完成后清除卡匣废弃物。废弃物处理请参阅产品说明书中的相关程序，或遵循其他标准操作规范。利用试管中剩余的菌悬液在CLED琼脂平板上进行次代培养，以检查分离株的纯度。
- 待仪器完成分析后读取结果。
2. 使用 aMIAST 进行细菌鉴定的直接接种物方案（DIP）
- 佩戴无菌手套，在生物安全柜内使用含有70%异丙醇的棉签清洁+naBC的隔膜。
- 使用带有21 G针头的无菌注射器，从+naBC的血培养液混合物中吸取5 mL分装样品，在用70%异丙醇消毒橡胶隔膜后，转移至血清分离管（SST）中（图2A）。
- 将此分装样品在160 × g 条件下离心10分钟，使血培养液混合物中的血细胞沉淀。第一次离心后，观察上清液，此时血细胞已沉降。
- 在生物安全柜内打开小瓶盖，使用无菌吸头和移液器小心移除上清液，并通过移除顶部将其转移至新的普通血清采集管（红色盖）中。
- 盖上管盖，再次在2000 × g 条件下离心10分钟。第二次离心后，管底将形成细菌沉淀。
- 使用无菌移液器和吸头吸取并弃去上清液。细菌沉淀将保留在管底，用于接种aMIAST鉴定卡。
注意：第一次在160 × g 条件下的离心使用了血清分离管（SST）。该方法基于Quesada等25和Munoz-Davila等27，的研究，其中首次离心步骤分别在约30 × g 和60 × g 条件下进行。来自+aBC的血培养液混合物首先在SST中以低速离心，以沉淀血细胞。 - 将aMIAST聚苯乙烯管放入aMIAST管架中，并使用连接在生理盐水瓶上的分配器加入3 mL无菌生理盐水。
- 使用无菌接种环，从管底取细菌沉淀，并接种至aMIAST管中。
- 重复步骤1.7–1.14。
3. 采用EUCAST RAST方案进行AST4
- 在生物安全柜中准备好未接种的90 mm圆形穆勒-欣顿琼脂（MHA）平板。
- 佩戴无菌手套，在生物安全柜内用含70%异丙醇的拭子清洁+naBC的隔膜。
- 使用无菌注射器，从+naBC中吸取125 µL ± 25 µL未稀释的血培养肉汤混合物，并将其加入每块MHA平板的中心。
- 用无菌棉拭子以三个方向轻轻涂布肉汤，并在每块平板上贴上≤6个抗菌药物纸片。
- 将平板置于35 °C ± 1 °C的有氧培养箱中培养8小时。培养结束后，观察分离菌的纯度。
- 在培养8小时 ± 5分钟时读取抑菌圈直径。结合aMIAST中的细菌鉴定结果，参照RAST短时培养折点表解读结果。
- 仅当分离菌被鉴定为RR-GN之一，且MHA和CLED平板上仅生长单一菌落形态时，报告药敏试验（AST）结果。
4. 质量控制
- 使用推荐的参考菌株，按照制造商说明对aMIAST的SIP协议执行内部质量控制。
- 按照下述方法，每周使用推荐的大肠杆菌（E. coli）参考菌株对RAST方法进行内部质量控制。
- 将4支无菌玻璃试管置于试管架中。在第一支试管中加入3 mL无菌生理盐水，第二、第三和第四支试管中各加入990 µL无菌生理盐水。
- 从平板培养基上过夜培养的分离菌落制备QC菌株的0.5麦氏浊度悬浮液。
- 使用无菌移液器和吸头，将10 µL悬浮液从第一支试管转移至第二支试管。
- 混匀后，将10 µL悬浮液从第二支试管转移至第三支试管，再依次转移至第四支试管。
- 从第四支试管中，使用带针头的无菌注射器吸取1 mL接种物，并将其加入未接种的aBC中。
- 同时，使用带针头的无菌注射器向aBC中加入5 mL无菌绵羊血，然后将其放入CBCMS中孵育，直至因aBC底部液体乳剂传感器颜色变化而提示阳性。
- 分别按照步骤1-3所述重复操作，进行SIP、DIP和RAST鉴定。预期结果为：QC菌株应能被aMIAST的两种鉴定方法正确鉴定，且RAST平板上的抑菌圈直径应在规定范围内28。
5. 统计学分析
- 以SIP法进行微生物鉴定作为金标准，若DIP法获得相同的鉴定结果，则视为一致。
- 若使用SIP法鉴定为RR-GN（即E. coli、K. pneumoniae、P. aeruginosa或A. baumannii复合群）而在DIP法中结果不一致，则视为主要错误（ME）；反之，若DIP法错误地将非RR-GN鉴定为RR-GN，则视为非常主要错误（VME），因其可能导致发出错误鉴定报告。
- 计算RR-GN的一致率，即SIP法鉴定出的RR-GN总数中结果一致的RR-GN所占比例乘以100。
- 计算主要错误率（ME率），即SIP法鉴定为RR-GN的+naBCs中，DIP法将其鉴定为非RR-GN的样本数占SIP法鉴定出的RR-GN总+naBCs数的比例乘以100。
- 计算非常主要错误率（VME率），即DIP法中被错误鉴定为RR-GN的+naBCs数量占接受DIP法检测的+naBCs总数的比例乘以100。
- 计算分离鉴定时间（TTI），即从血培养仪（CBCMS）报警时刻起，至两种方法各自完成病原体鉴定所用的时间。
- 计算DIP与SIP之间的TTI差异，即DIP相对于SIP在鉴定时间上的缩短量；此计算仅针对鉴定结果一致且含有RR-GN的+naBCs样本。记录CBCMS和aMIAST系统时钟对应的时间点。
- 使用电子表格管理数据并进行分析；对连续变量采用Mann-Whitney U检验，双侧p值≤0.05视为具有统计学意义。
结果
总体结果
在研究期间，共对240例+naBCs使用DIP和SIP两种方法通过aMIAST进行鉴定。其中，15%（36/240）的+naBCs在平板培养基上经一夜培养后被发现为多微生物感染。在204例+naBCs中，通过SIP鉴定出的RR-GN比例为51.5%（105/204）。其中，47.6%（50/105）为E. coli，19%（20/105）为K. pneumoniae，8.6%（9/105）为P. aeruginosa，24.8%（26/105）为A. baumannii复合群。所有SIP鉴定结果的详细描述见表1。
微生物鉴定中的诊断准确性
在105份RR-GN样本中，有98份（93.3%）和99份（94.2%）分别在种级和属级鉴定结果上与DIP一致。各微生物的符合率分别为：E. coli为94%（47/50），K. pneumoniae为90%（18/20），P. aeruginosa为100%（9/9），A. baumannii复合群为92.3%（24/26），如表1所示。在7份+naBC样本中，使用DIP进行种级鉴定时结果不一致，其中aMIAST要么未鉴定出结果（3份），要么鉴定为非RR-GN（4份），如表2所示。由于这些结果不会促使临床微生物学家发出报告，因此被归类为重大错误（ME）。本研究中，种级鉴定的ME发生率为6.7%（7/105）。通过SIP方法，aMIAST鉴定出的非RR-GN比例为48.5%（99/204）。其中，60份（60.6%）在种级鉴定上与DIP结果一致。在99份非RR-GN样本中，DIP在4份+naBC样本中鉴定出RR-GN，如表2所示。此类不一致可能导致报告错误，被定义为极重大错误（VME）。使用DIP的总体VME发生率为1.7%（4/240）。所有革兰阴性菌的鉴定结果及错误类型的详细描述见补充表1。
缩短分离鉴定时间（TTI）
DIP 中一致阳性 naBCs 的 TTI 显著短于 SIP 中的 TTI（中位数（IQR）：507.5 分钟（685–404）对比 2171 分钟（2532–1855），P2 对比 P1，p<0.00001（Mann-Whitney 检验））。两种方案在 TTI 上的中位数差异为 1635 分钟（IQR：1964–1299）。
图1：研究工作流程：展示对报阳血培养瓶中单形革兰阴性菌分别采用标准接种法和直接接种法进行处理的研究流程。缩写：+aBC = 报阳血培养瓶，+naBC = 报阳且含单形革兰阴性菌的血培养瓶，DIP = 直接接种法，SIP = 标准接种法，SBA = 羊血琼脂，CA = 巧克力琼脂，MA = 麦康凯琼脂，RR-GN = 可报告的革兰阴性菌快速药敏结果，TAT = 周转时间 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：直接接种法用于细菌鉴定：展示执行直接接种法过程中培养瓶的图像。缩写：+naBC = 革兰氏阴性菌阳性报警的血培养瓶 请点击此处查看该图的放大版本。
| RAST 可报告的革兰阴性菌 | 检测的分离株数量 (n) | 一致 | 错误鉴定 | 无鉴定结果 |
| n (%) | n (%) | n (%) | ||
| 总计 | 105 | 98 (93.3%) | 4 (3.8%) | 3 (2.8%) |
| Escherichia coli | 50 | 47 (94%) | 1 | 2 |
| Klebsiella pneumoniae | 20 | 18 (90%) | 1 | 1 |
| Acinetobacter baumannii 复合群 | 26 | 24 (92.3%) | 2# | 0 |
| Pseudomonas aeruginosa | 9 | 9 (100%) | 0 | 0 |
| # 一株分离株被正确鉴定至属水平，但未鉴定至种水平（Acinetobacter baumannii 复合群被鉴定为 A. haemolyticus） | ||||
表1：直接接种方案中细菌鉴定结果。 结果仅针对RAST可报告的革兰阴性菌。缩写：n = 分子，% = 百分比。
| 革兰阴性菌 | 测试的总分离株数 | 主要错误 | 极重要错误，n (%) | ||
| 数量 | 错误鉴定 | 无鉴定结果 | （鉴定为） | ||
| n (%) | n | n | |||
| Escherichia coli | 50 | 3 (6%) | 1 (A. haemolyticus) | 2 | 0 |
| Klebsiella pneumoniae | 20 | 2 (10%) | 1 (Ralstonia pickettii) | 1 | 0 |
| Acinetobacter baumannii complex | 26 | 2 (7.7%) | 2 (A. hemolyticus, Cupriaviadus pauculus) | - | 0 |
| Salmonella spp. | 10 | NA | 1 (10%) | ||
| (E. coli) | |||||
| Enterobacter cloacae complex | 8 | NA | 1 (12.5%) | ||
| (E. coli) | |||||
| Acinetobacter lwoffi | 14 | NA | 1 (7.1%) | ||
| (A. baumannii complex) | |||||
| Sphingomonas paucimobilis | 9 | NA | 1 (11.1%) | ||
| (K. pneumoniae) | |||||
| 缩写说明：n：分子，%：百分比，ID：鉴定，NA：不适用 | |||||
| A：Acinetobacter，E：Escherichia，K：Klebsiella | |||||
表2：直接接种法中主要和极主要错误的详细信息。 缩写：n = 分子，% = 百分比，ID = 鉴定，NA = 不适用，A = Acinetobacter，E = Escherichia，K = Klebsiella。
补充表1： 两种方案中生物体鉴定的详细结果，以及直接接种方案中错误结果的分析。请点击此处下载该文件。
讨论
通过使用DIP，我们成功鉴定了RR-GNs，且具有较高的诊断准确性。aBC出现阳性标记后的平均TTI仅为507分钟（约8.5小时）。因此，若将其与EUCAST RAST法联合用于药敏试验（AST）测定，可在8小时的AST读取时间点获得菌株鉴定结果。该方法有望推动EUCAST RAST法的实施，从而无需依赖基于质谱的鉴定技术。这对于希望在常规工作流程中实施EUCAST RAST法以缩短临床报告时间并克服主要实施障碍的资源有限地区而言，具有重要意义。
在EUCAST RAST方法引入之前，已有多个研究者评估了从阳性血培养（+aBC）直接检测多种自动化微生物鉴定与药敏试验系统（aMIAST）的准确性21,22,23,24,25,26,27,29,30,31。在这些研究中，直接检测方案在制备细菌沉淀时，有的采用单次离心步骤29,30,31,32，有的则采用两次离心步骤21,22,24,25,26,27。在单次离心法中，将阳性血培养（+aBC）中的血-肉汤混合物置于血清分离管（SST）中高速离心，使细菌沉淀于硅胶层上方，随后取该沉淀制备菌悬液，用于接种鉴定卡片。在两次离心法中，首先将阳性血培养（+aBC）中的血-肉汤混合物在SST管中低速离心，以沉淀血细胞；然后从该管中取出含细菌的上清液，转移至新管并进行高速离心；随后弃去上清液，取沉淀物接种相应的鉴定卡片。在这些研究中，结果的一致率范围为62%–100%，但总体而言，两次离心法的准确性更高。
我们发现该方法操作简便，可在常规诊断实验室中由普通工作人员完成 >10名轮岗的实验室技术人员验证了该方法的稳健性。在含有RR-GN之一的+naBCs样本中，DIP正确鉴定出微生物的比例约为94%（98/105）。不同类别微生物的符合率也相近，分别为94%、90%、100%和92.3%。 E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa 和 A. baumannii 复合体。我们还发现，对于任何革兰阴性菌的整体一致性率不理想，约为77%（157/204）。然而，大多数误判发生在非发酵类革兰阴性菌，例如 不动杆菌 除……以外的其他种 鲍曼不动杆菌 复合物， 假单胞菌 除……以外的物种 aeruginosa, 莫拉氏菌属 种，以及 Sphingomonas paucimobilis 通常被视为皮肤常见污染物。其他作者也注意到与非发酵革兰阴性菌的误鉴定情况。21,23这可能是由于这些细菌在aMIAST鉴定卡中的反应性较低所致。
我们发现，在常规临床诊断实验室中，使用DIP方法可显著缩短+naBCs中细菌的检测时间（TTI）。DIP的中位TTI约为SIP中位TTI的四分之一（507分钟 vs 2171分钟）。该DIP方法的TTI约为8.5小时，其中还包括了aBC报阳至aMIAST卡片接种操作之间的时间间隔，因为使用aMIAST进行分离分析的平均耗时仅为5.45小时±1.6小时。结合本研究中一致阳性aBCs的平均报阳时间728分钟±301分钟（约12小时），该细菌鉴定方法有望在常规诊断实验室中实现接收aBC后的同日报告结果。
DIP 方法也存在一些局限性。首先，由于接种物制备属于超说明书使用，因此结果应被视为初步结果，EUCAST RAST 的药敏试验结果亦应如此。尽管如此，该方法仍能及时、以较高的诊断准确性实现主要目标，即仅识别耐药革兰阴性菌（RR-GNs）。其次，存在实际的检测资源浪费可能性，因为在约 60% 以上的阳性血培养（+naBCs）样本中，由于存在多微生物感染或鉴定出非耐药革兰阴性菌，我们无法提供报告。这种资源浪费问题同样适用于当前所有新型自动化直接血培养药敏试验方法。第三，本研究中多微生物感染率以及常见皮肤污染物的检出率较高，原因在于样本采集操作不规范。第四，我们未使用目前细菌鉴定的金标准方法——质谱分析法，对所测试分离株的身份进行确认。
本研究成功证实，即使采用表型检测方法，仍有可能实现阳性血培养的当日报告，尤其是在革兰阴性菌血症的情况下。这一方法有望显著缩短低收入和中等收入国家（LMICs）启动适当抗菌治疗所需的时间，因为在这些地区，细菌鉴定和药敏试验（AST）的微生物学诊断在很大程度上依赖于传统的表型检测方法。该策略应通过多中心研究加以验证，其对患者预后的影响以及作为抗菌药物管理工具的潜力，应成为未来在LMICs开展临床试验的重点方向。
总之，DIP 方法用于 aMIAST 可补充 EUCAST RAST 方法，从而实现对耐药革兰阴性菌（RR-GNs）的早期鉴定。该方法避免了对高级微生物鉴定和药敏试验技术的依赖，因为这些技术的报告时间与本方法相当。对于革兰阴性菌，在充分优化的条件下，可通过传统的表型方法实现当天报告。此方法有望缩短广谱抗菌药物的治疗周期，并在资源有限的医疗环境中促进抗菌药物的合理使用。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由博帕尔AIIMS向Ayush Gupta博士提供的院内研究基金资助。我们感谢实验室技术人员和住院医师在常规及紧急工作时间内认真完成并解读了各项检测。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>抗菌药敏纸片 | |||
| 阿米卡星纸片 30 µg | Himedia，孟买，印度 | SD035-1VL | 抗菌药物敏感性试验 |
| 阿莫西林-克拉维酸钾片（20/10） µg) | HiMedia，孟买，印度 | SD063-1VL | 抗菌药物敏感性试验 |
| 头孢噻肟纸片 5 µg | Himedia，孟买，印度 | SD295E-1VL | 抗菌药物敏感性试验 |
| 头孢他啶药敏纸片 10 µg | Himedia，孟买，印度 | SD062A-1VL | 抗菌药物敏感性试验 |
| 环丙沙星纸片（5 µg) | HiMedia，孟买，印度 | SD060-1VL | 抗菌药物敏感性试验 |
| 复方新诺明纸片（23.75/1.25） µg) | Himedia，孟买，印度 | SD010-1VL | 抗菌药物敏感性试验 |
| 庆大霉素纸片 10 µg | Himedia，孟买，印度 | SD016-1VL | 抗菌药物敏感性试验 |
| 亚胺培南纸片 10 µg | Himedia，孟买，印度 | SD073-1VL | 抗菌药物敏感性试验 |
| 左氧氟沙星纸片 5 µg | Himedia，孟买，印度 | SD216-1VL | 抗菌药物敏感性试验 |
| 美罗培南纸片 10 µg | Himedia，孟买，印度 | SD727-1VL | 抗菌药物敏感性试验 |
| 哌拉西林-他唑巴坦纸片（30/6） µg) | Himedia，孟买，印度 | SD292E-1VL | 抗菌药物敏感性试验 |
| 妥布霉素纸片 10 µg | Himedia，孟买，印度 | SD044-1VL | 抗菌药物敏感性试验 |
| ATCC 大肠杆菌 25922 | Microbiologics，明尼苏达州，美国 | 0335A | 推荐用于RAST中革兰氏阴性菌质控的菌株 |
| BacT-Alert 3D 480 | 生物梅里埃，马西’ 法国埃图瓦勒 | 412CM8423 | 全自动连续血液培养系统 |
| II级生物安全柜A2型 | Dyna Filters Pvt. Limited，浦那，印度 | DFP-2/21-22/149 | 用于防护有害物质 以及病原体并维持质量控制 |
| 血琼脂基础培养基第2号 | 希米迪亚，孟买，印度 | M834-500G | 血琼脂和巧克力琼脂的制备 |
| 临床离心机型号 SP-8BL | Laby Instruments，印度安巴拉 | HLL/2021-22/021 | 低速和高速离心以分离上清液 |
| Dispensette S 模拟可调式瓶顶移液器 | BrandTech，美国康涅狄格州埃塞克斯 | V1200 | 精确分配盐水量 |
| 麦康凯琼脂 | Himedia，孟买，印度 | M008-500G | 用于鉴别乳糖发酵与非发酵革兰氏阴性杆菌的鉴别培养基 |
| 微量移液器（100-1000） µL | Axiflow Biotech Private Limited，德里，印度 | NJ478162 | 第一次离心后转移上清液，第二次离心后弃去上清液 |
| 微量移液器吸头（200-1000） µL) | Tarsons Products Pvt. Ltd.，印度加尔各答 | 521020 | 第一次离心后转移上清液，第二次离心后弃去上清液 |
| 穆勒-欣顿琼脂 | HiMedia，孟买，印度 | M173-500G | 纸片扩散法（K irby-Bauer法）进行抗菌药物敏感性试验 |
| 镍铬丝环 D-4 | HiMedia，孟买，印度 | LA019 | 用于在培养基上划线接种 |
| 镍铬合金直丝 | HiMedia，孟买，印度 | LA022 | 用于穿刺接种 |
| Nulife 无菌手套 | MRK healthcare Pvt Limited，印度孟买 | 安全注意事项 | |
| 普通试管（红色管帽试管），Advance BD 真空采血管 | Becton-Dickinson，美国马里兰州科基斯维尔 | 367815 | 第二次离心后获得沉淀 |
| 绵羊血 | Labline Trading Co.，印度海得拉巴 | 70014 | 血琼脂和巧克力琼脂的制备 |
| SST II 管，Advance BD 真空采血管 | Becton-Dickinson，美国马里兰州科基斯维尔 | 367954 | 首次离心后上清液的分离 |
| 无菌棉签（带木棒） | Himedia，孟买，印度 | PW005-1X500NO | 血培养肉汤的涂布培养法用于抗菌药物敏感性试验 |
| 无菌一次性使用注射器 5ml/cc | Nihal Healthcare，印度索兰 | 2213805NB2 | 从 +aBC 制备等份样本 |
| VITEK DensiCHEK McFarland 标准比浊参考试剂盒 | 生物梅里埃，马尔西’ 法国埃图瓦勒 | 422219 | 用于检测悬液浊度的密度计 |
| VITEK 生理盐水溶液（0.45% NaCl） | 生物梅里埃，马尔西’ 法国埃图瓦勒 | V1204 | 麦克法兰比浊标准的调整 |
| VITEK 试管架 | 生物梅里埃，马尔西’ 法国埃图瓦勒 | 533306-4 REV | 在接种身份证卡片前，正确放置试管 |
| VITEK 胶管 | 生物梅里埃，马尔西’ 法国埃图瓦勒 | 用于接种物制备的试管 | |
| VITEK-2 Compact 60 | 生物梅里埃，马尔西’ 法国埃图瓦勒 | VKC15144 | 自动化鉴定与药敏试验系统 |
| VITEK-2 GN 卡 | 生物梅里埃，马尔西’ 法国埃图瓦勒 | 21341 | 革兰氏阴性杆菌的鉴定 |
参考文献
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