Method Article

使用自动微生物鉴定系统进行直接微生物鉴定，以促进 EUCAST RAST 方法，无需质谱法

DOI:

10.3791/66588

⸱

May 24th, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, All India Institute of Medical Sciences, Bhopal, 2Department of Microbiology, All India Institute of Medical Sciences, Bhubaneswar

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EUCAST 开发了一种用于自动血培养的直接药敏试验 （AST） 方案。然而，通过在自动微生物鉴定系统中使用直接接种物制备方案，可以消除它对基于质谱的微生物鉴定的依赖。这种方法可以在样品收集后 24 小时内提供 AST 报告。

Abstract

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革兰氏阴性 （GN） 脓毒症是一种医学急症，在资源有限的环境中，管理依赖于常规微生物培养技术，可在 3-4 天内提供结果。认识到这种周转时间 （TAT） 的延迟，EUCAST 和 CLSI 都制定了直接从带有阳性标记的自动血培养瓶 （+aBC） 中确定 AST 结果的方案。EUCAST 快速 AST （RAST） 方案于 2018 年首次推出，其中可以报道 GN 脓毒症的四种常见病因，即 大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和 鲍曼不动杆菌 复合体。然而，那些在常规工作流程中实施这种方法的临床实验室依赖于基于质谱的微生物鉴定，而这种鉴定并不容易获得，因此无法在资源有限的环境中实施。为了规避它，我们使用商业自动微生物鉴定和抗菌药物敏感性测试系统 （aMIAST） 评估了直接接种方案 （DIP），以便在 aBC 阳性标记后 8 小时内进行早期微生物鉴定。我们在 2023 年 1 月至 2023 年 10 月期间评估了该方案，以确定阳性标记的 aBC 中的四个 RAST 可报告 GN （RR-GN）。将 DIP 中的微生物鉴定结果与 aMIAST 中的标准接种物制备方案 （SIP） 进行比较。在 204 个具有单态性 GN （+naBC） 的 +aBC 中，通过 SIP 在 105 个 +naBC 中鉴定出 4 个 RR-GN 中的一个（大肠杆菌: 50， 肺炎克雷伯菌: 20， 铜绿假单 胞菌:9 和鲍曼不动杆菌 复合物:26）。其中，94% （98/105） 被 DIP 正确识别，而主要错误和非常重大错误率分别为 6% （7/105） 和 1.7% （4/240）。当使用 EUCAST RAST 方法进行微生物鉴定的 DIP 时，可以在收到样品后 24 小时内提供临时临床报告。这种方法有可能显著降低 TAT，从而及早建立适当的抗菌治疗。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脓毒症是一个重要的全球健康问题，被定义为由于宿主对感染的反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍。全球疾病负担研究估计，2017 年全球有 4890 万例脓毒症病例和 1100 万例脓毒症相关死亡病例，占全球死亡总数的近 20%1。大约 2/3 导致死亡的血流感染 （BSI） 是由革兰氏阴性细菌病原体引起的2。革兰氏阴性菌 （GN） 死亡的主要原因是大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌，它们约占 33 种细菌病原体病例的 40%2。

血培养仍然是诊断 BSI 的金标准，快速微生物鉴定和药敏试验 （AST） 结果是管理的关键。据估计，脓毒症 3 中，每延迟一小时使用适当的抗菌药物，死亡率就会增加9%。在资源有限的环境中，使用可用的微生物学工具，即使使用自动化系统，具有 AST 结果的微生物学阳性血培养报告的周转时间 （TAT） 约为 48-72 小时。由于这种低于标准的 TAT，广谱抗菌剂被经验性地使用，导致了日益严重的抗菌素耐药性 （AMR） 问题。认识到迫切需要减少脓毒症微生物培养技术的 TAT，EUCAST 和 CLSI 正在转向直接从带有阳性标记的血培养瓶 （+aBC） 进行 AST（4,5）。

2018 年，EUCAST 首次引入了快速 AST （RAST） 方法，用于通过柯比-鲍尔纸片扩散法在较短的孵育时间（即 4 小时、6 小时和 8 小时）直接从 +aBC 6,7 确定 AST。该方法目前已验证用于确定 +aBCs 的 AST，其中包含 BSI 的 8 种最常见原因之一，即革兰阴性菌中的大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌复合物，以及革兰氏阳性菌中的金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌和肺炎链球菌 8.根据上面列出的微生物种类，提供了不同时间间隔的 AST 测定断点。因此，在对 AST 结果进行分类解释之前，微生物鉴定是必要的。但是，RAST 标准并未指定在此时间范围内实现微生物鉴定的方法。

大多数在其环境中评估 EUCAST RAST 方法的研究在铺板培养基上短暂孵育后使用基于质谱的微生物鉴定来鉴定微生物9、10、11、12、13、14、15、16、17.然而，质谱仪器并未广泛使用，尤其是在中低收入国家 （LMIC），这极大地限制了该方法的潜在用途。很少有研究报告在不使用质谱法的情况下在他们的中心实施这种方法 18,19,20。Tayşi 等人18 报道了在解释 AST 结果之前，根据革兰氏染色形态学和氧化酶测试，将 GN 广泛分类为肠杆菌属、假单胞菌属和不动杆菌属。在该中心的其他研究中，由 Gupta 等人 19 和 Siddiqui 等人 20 进行，通过从阳性标记的血汤混合物中制备细菌沉淀并将其接种在常规生化测试中来完成物种水平的微生物鉴定。虽然 Tayşi 等人18 没有评论他们的方法微生物鉴定的准确性，但 Gupta 等人19 报告说，在他们的方法中，165/176 （94%） 病例中，RAST 可报告的革兰氏阴性 （RR-GN），即大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌 复杂。然而，使用后一种方法，只有在常规生化结果完全孵育后，即接种后 18-24 小时，才使用 8 小时区直径断点回顾性地读取 RAST 结果，平均报告时间约为 2 天。

为了进一步减少临床报告的 TAT，我们提出了一种替代方法，可以使用 aMIAST 及早识别 +aBC 中存在的 GN。在引入基于质谱的微生物鉴定系统之前，这些自动鉴定系统被认为是微生物鉴定的标准，其中当接种在盒中的微型生化测试中时，测试细菌通过比色和/或荧光变化进行鉴定，并将结果与其分离物数据库相匹配。在这些系统中进行鉴定的平均时间约为 4 小时至 8 小时，但是，它们受到以下事实的限制:制造商建议在接种各自的鉴定卡之前让微生物过夜生长。此要求极大地限制了它们在减少报告时间方面的有用性。

很少有研究评估使用这些自动化系统直接从 +aBC 中鉴定微生物的方法 21,22,23,24,25,26,27。在含有单态 GN 的 +aBC 的情况下，大多数研究表明，从阳性血汤混合物制成的细菌沉淀直接接种与标准菌落孵育之间具有出色的一致性。然而，在革兰氏阳性的情况下，一致性率并不理想。由于 +aBCs 的平均阳性时间在 8 小时到 16 小时之间，并且在自动微生物鉴定系统中鉴定 GN 需要 ~4 小时到 8 小时，我们假设通过在自动微生物鉴定中采用直接接种方案，我们可以完成 +aBCs 的临床报告，GN 具有 RR-GN收到样品后 24 小时内。

研究设置
本研究于 2023 年 1 月至 2023 年 10 月在印度中部一家拥有 950 个床位的国家重要学术三级保健研究所 （INI） 的临床细菌学实验室进行。该实验室配备了连续血培养监测系统 （CBCMS） 和 aMIAST。细菌学实验室全天候运作，有技术人员和微生物学家来处理和报告任何有阳性标记的血培养瓶 （+aBCs）。

此处使用的微生物方法
该研究的工作流程如图 1 所示。显示单形性 GN （+naBC） 的 +aBC 通过直接接种相应的识别卡进行处理，以便使用 EUCAST RAST 协议进行识别和 AST。将这些结果与 +aBCs 的标准护理 （SoC） 方法进行了比较，即通过羊血琼脂 （SBA）、巧克力琼脂 （CA） 和麦康凯琼脂 （MA） 在常规铺板培养基上进行传代培养，有氧孵育 16 小时至 24 小时，然后在出现分离菌落时通过 aMIAST 提供鉴定和 AST 卡。在初始革兰氏染色或铺板培养基上显示革兰氏阳性球菌、革兰氏阳性杆菌、出芽酵母细胞和 ≥2 种不同微生物的血培养被排除在研究之外。

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该研究由 AIIMS 博帕尔提供给 Ayush Gupta 博士的校内研究资助，获得机构人类伦理委员会 （IHEC） 视频信号:IHEC- LOP/2022/IL072 的批准。

注:根据 Quesada 等人 25 和 Munoz-Davila 等人 27 所做的研究，使用 5 ml 的样品体积。

1. 使用 aMIAST 进行细菌鉴定的标准接种方案 （SIP）

  1. 戴上干净的手套，在 IIa 级生物安全柜 （BSC） 内，用含有 70% 异丙醇的棉签对 +naBC 的隔膜进行消毒。
  2. 使用带有 21 G 针头的无菌注射器抽取大约 1 mL 的血汤混合物。
  3. 将 1 大滴血汤混合物从针头分配到电镀培养基的表面，即 SBA、CA 和 MA。划线板并将培养板在 37 °C ± 2 °C 的培养箱中在有氧条件下孵育 18-24 小时。
  4. 孵育后，检查 BSC 中分离菌落的外观，并通过 aMIAST 进一步进行鉴定和 AST。
  5. 对于每种分离物，将 aMIAST 聚苯乙烯管放入 aMIAST 管架中，并使用连接到盐水瓶的分配器在其中加入 3 mL 无菌盐水。
  6. 用无菌直接种丝接触 3 到 5 个形态相似的菌落，并将细菌接种物转移到第一管中。
  7. 使用密度计在接种管中使用无菌盐水在 0.47-0.63 McFarland 之间调节浊度。
  8. 将革兰氏阴性 aMIAST 识别卡的毛细管附件放入第一根管中。
  9. 将所选存储卡放在纸盒上的适当位置。盒中的接种物已准备就绪，可进入 aMIAST 的填充部分。
    注意: 接种卡前的暂停时间不得超过 30 分钟。
  10. 将样品盒装入填充室中的位置，样品条形码朝内。
  11. 关上门，然后按 User Interface Screen 上的 Fill。填充是一个 70 秒的周期。循环完成后，系统上的蓝色指示灯将闪烁。将卡片放入 aMIAST 系统中，机器将接种物分配到卡片的小腔内。
  12. 从填充室中取出盒，关闭门，然后放入加载室。条形码会自动扫描并根据维护虚拟盒式电子工作列表进行检查。吸管自动密封，卡片自动装入转盘。aMIAST 上闪烁的蓝色箭头表示加载已完成。
  13. 完成后清除暗盒废液。请参阅产品资料中的废弃物处理程序或遵循其他标准做法。使用试管中剩余的悬浮液在 CLED 琼脂上进行传代培养，以检查分离株的纯度。
  14. 仪器完成分析后读取结果。

2. 使用 aMIAST 进行细菌鉴定的直接接种方案 （DIP）

  1. 戴上无菌手套，在生物安全柜内，用含有 70% 异丙醇的棉签清洁 +naBC 的隔膜。
  2. 使用带有 21 G 针头的无菌注射器，从 +naBC 的血汤混合物中取出 5 mL 等分试样，并在用 70% 异丙醇消毒橡胶隔膜后将其转移到血清分离管 （SST） 中（图 2A）。
  3. 将此等分试样以 160 x g 离心 10 分钟，以使血细胞沉降在血汤混合物中。第一次离心后，观察血细胞将在其中沉淀的上清液。
  4. 打开生物安全柜内的样品瓶盖，使用无菌吸头和移液管小心地去除上清液，然后去除其顶部，将其转移到新的普通采血瓶（红色顶部）中。
  5. 将盖子盖在小瓶上，然后再次以 2000 x g 离心 10 分钟。第二次离心后，底部会形成细菌沉淀。
  6. 吸出上清液，并使用无菌移液管和吸头丢弃。细菌颗粒将保留在试管底部，用于接种 aMIAST 识别卡。
    注:在第一次离心中使用血清分离管，浓度为 160 x g。这是基于 Quesada 等人25 和 Munoz-Davila 等人27 所做的研究，其中第一个离心步骤分别在大约 30 x g 和 60 x g 下完成。首先将来自 +aBC 的血汤混合物在 SST 中以低速离心以沉淀出血细胞。
  7. 将 aMIAST 聚苯乙烯管放入 aMIAST 管架中，并使用连接到盐水瓶的分配器向其中添加 3 mL 无菌盐水。
  8. 使用无菌接种环，从小瓶底部取出细菌沉淀，并将其接种在 aMIAST 管中
  9. 重复步骤 1.7-1.14。

3. 通过 EUCAST RAST 协议 4 的 AST

  1. 在生物安全柜中准备好未接种的 90 mm 圆形 Mueller-Hinton 琼脂 （MHA） 板。
  2. 戴上无菌手套，在生物安全柜内，用含有 70% 异丙醇的棉签清洁 +naBC 的隔膜。
  3. 使用无菌注射器，从 +naBC 中吸出 125 μL ± 25 μL 未稀释的血汤混合物，并添加到中心的每个 MHA 板中。
  4. 使用无菌棉签将肉汤沿三个方向轻轻涂抹在盘子上≤并在每个板上涂抹 6 个抗菌盘。
  5. 将板在 35 °C± 1 °C 的好氧培养箱中孵育 8 小时。孵育完成后，观察分离物的纯度。
  6. 在 8 小时± 5 分钟读取抑制区。在 aMIAST 中检查细菌鉴定结果后，使用 RAST 断点表解释短时间孵育的结果。
  7. 仅当分离物被鉴定为 RR-GN 之一并且 MHA 和 CLED 板生长单一形态型时，才报告 AST 结果。

4. 质量控制

  1. 根据制造商的说明，使用推荐的参考菌株对 aMIAST 的 SIP 方案进行内部质量控制。
  2. 使用推荐的大 肠杆菌 参考菌株每周对 RAST 方法进行内部质量控制，如下所述。
    1. 在管架上放置 4 个无菌玻璃管。在第一管中分配 3 mL 无菌盐水，在第二管、第三管和第四管中分配 990 μL 无菌盐水。
    2. 在铺板培养基上从过夜培养物的分离菌落中制备 0.5 McFarland QC 菌株悬浮液。
    3. 使用无菌移液器和吸头，将 10 μL 悬浮液从第一管转移到第二管。
    4. 混合后，将 10 μL 悬浮液从第二管转移到第三管，然后转移到最后一管。
    5. 从最后一管中，使用带针头的无菌注射器取出 1 mL 接种物，并将其添加到未接种的 aBC 中。
    6. 使用带针头的无菌注射器同时在 aBC 中加入 5 mL 无菌羊血，并在 CBCMS 中孵育，直到由于 aBC 底部液体乳剂传感器的颜色变化而标记为阳性。
    7. 重复步骤 1-3 中说明的步骤，分别通过 SIP、DIP 和 RAST 进行识别。预期结果是 QC 菌株应通过 aMIAST 的两种鉴定方案正确识别，并且 RAST 板中的区域直径应在规定范围内28。

5. 统计分析

  1. 考虑使用 SIP 作为金标准进行微生物鉴定，如果通过 DIP 获得相同的鉴定，则将其视为一致。
  2. 如果 RR-GN，即使用 SIP 鉴定的大 肠杆菌、 肺炎克雷伯菌、 铜绿假单胞菌和 鲍曼不动杆菌 复合体之一在 DIP 中不一致，则将其视为严重错误 （ME），而将相反视为非常重大错误 （VME），因为它有可能发布错误识别的报告。
  3. 计算 RR-GN 的一致率，即一致 RR-GN 总数与 SIP 识别的 RR-GN 总数乘以 100 的比率。
  4. 计算 ME 率为被鉴定为具有非 RR-GN 的 +naBCs 数量与通过 SIP 识别的具有 RR-GN 的 +naBCs 总数乘以 100 的比率。
  5. 将 VME 率计算为被错误识别为 DIP 中具有 RR-GN 的 +naBC 数量与总数的比率。的 DIP 测试的 +naBC 乘以 100。
  6. 将分离鉴定时间 （TTI） 计算为从 CBCMS 标记血培养标记开始，两种方案鉴定分离株所需的时间。
  7. 计算 DIP 和 SIP 之间的差异作为 TTI 的降低。仅针对具有 RR-GN 的一致 +naBCs 计算此值。请注意 CBCMS 和 aMIAST 时钟中的相应时间点。
  8. 使用电子表格管理数据和分析。对连续变量使用 Mann-Whitney U 检验，将 ≤ 0.05 的双侧 p 值视为统计意义显著性。

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

一般结局
在研究期间，使用 DIP 和 SIP 通过 aMIAST 鉴定了 240 个 +naBCs。其中，15% （36/240） +naBCs 在铺板培养基上孵育过夜后被发现是多微生物。在 204 个 +naBCs 中，SIP 鉴定的 RR-GN 比例为 51.5% （105/204）。其中，47.6% （50/105） 为 大肠杆菌，19% （20/105） 为肺炎克雷伯菌，8.6% （9/105） 铜 绿假单 胞菌及 24.8% （26/105） 鲍曼不动杆菌 复合体。 表 1 中提供了 SIP 的所有识别结果的详细说明。

微生物鉴定的诊断准确性
在 105 个 RR-GN 中，98 个 （93.3%） 和 99 个 （94.2%） 分别与 DIP 一致，直到物种和属水平鉴定。如表 1 所示，大肠杆菌的生物体一致性率为 94% （47/50），肺炎克雷伯菌为 90% （18/20），铜绿假单胞菌为 100% （9/9），鲍曼不动杆菌复合体为 92.3% （24/26）。在 7 个 +naBCs 中，结果不一致，直到使用 DIP 进行物种水平鉴定，其中 aMIAST 要么给出未识别 （3） 要么鉴定出非 RR-GN （4），如表 2 所示。由于这些结果不会强迫临床微生物学家报告，因此它们被认为是重大错误 （ME）。我们研究中的 ME 率为 6.7% （7/105），直到物种水平鉴定。SIP 在 aMIAST 中非 RR-GN 的比例为 48.5% （99/204）。其中，60 例 （60.6%） 与 DIP 一致，直到物种水平鉴定。在 99 个非 RR-GN 中，使用 DIP 在 4 个 +naBC 中鉴定出一个 RR-GN，如表 2 所示。这种不一致可能会导致报告错误，并被视为非常重大错误 （VME）。使用 DIP 的总体 VME 率为 1.7% （4/240）。补充表 1 显示了所有革兰氏阴性菌的鉴定结果和错误的完整描述。

缩短分离鉴定 （TTI） 时间
DIP 中一致 +naBCs 的 TTI 显著小于 SIP 中的 TTI（中位数 （IQR）:507.5 分钟 （685-404） vs 2171 分钟 （2532-1855），P2 vs P1，p<0.00001 （Mann-Whitney 检验））。两种方案之间 TTI 的中位差异为 1635 分钟 （IQR: 1964-1299）。

figure-results-1
图 1:研究工作流程: 描述了研究中通过标准和直接接种方案处理单形革兰氏阴性菌的阳性标记血培养瓶的工作流程。缩写:+aBC = 阳性标记的血培养瓶，+naBC = 阳性标记的单形革兰氏阴性菌血培养瓶，DIP = 直接接种方案，SIP = 标准接种方案，SBA = 羊血琼脂，CA = 巧克力琼脂，MA = 麦康凯琼脂，RR-GN = RAST 可报告的革兰氏阴性菌，TAT = 周转时间 请点击此处查看此图的较大版本。

figure-results-2
图 2:用于细菌鉴定的直接接种方案: 显示直接接种方案执行期间的小瓶图像。缩写:+naBC = 带有革兰氏阴性菌的阳性标记血培养瓶 请单击此处查看此图的较大版本。

RAST 可报告的革兰氏阴性菌测试的分离株 （n）和谐误认无身份证明
n (%)n (%)n (%)
总10598 (93.3%)4 (3.8%)3 (2.8%)
大肠杆菌5047 (94%)12
肺炎克雷伯菌2018 (90%)11
鲍曼不动杆菌复合体2624 (92.3%)2#0
铜绿假单胞菌99 (100%)00
# 一种分离株在属水平上被正确鉴定，但在物种水平上未被正确鉴定（鲍曼不动杆菌复合体被鉴定为溶血性不动杆菌）

表 1:直接接种方案中的细菌鉴定结果。 结果仅适用于 RAST 可报告的革兰氏阴性菌。缩写:n = 分子，% = 百分比。

革兰氏阴性菌测试的分离株总数重大错误非常重大错误，n （%）
数误认无 ID（确定为）
n (%)nn
大肠杆菌503 (6%)1 （溶血性 A. haemolyticus）20
肺炎克雷伯菌202 (10%)1 （Ralstonia pickettii）10
鲍曼不动杆菌复合体262 (7.7%)2 （A. hemolyticus， Cupriaviadus pauculus）-0
沙门氏菌 属10那1 (10%)
（大肠杆菌）
阴沟肠杆菌复合体8那1 (12.5%)
（大肠杆菌）
Lwoffi 不动杆菌14那1 (7.1%)
（鲍曼不动杆菌复合体）
鞘氨醇单胞菌9那1 (11.1%)
（肺炎克雷伯菌）
缩写 - n:分子，%:百分比，ID:鉴定，NA:不适用，
A: 不动杆菌， E: 埃希菌， K: 克雷伯氏菌

表 2:直接接种方案的主要和非常主要错误的详细信息。 缩写:n = 分子，% = 百分比，ID = 鉴定，NA = 不适用，A = 不动杆菌，E = 埃希氏菌，K = 克雷伯氏菌。

补充表 1: 两种方案中生物体鉴定的详细结果以及直接接种方案中的错误结果。 请点击此处下载此文件。

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

使用 DIP，我们成功地鉴定了 RR-GNs，具有相当的诊断准确性。aBC 阳性标记后的平均 TTI 仅为 507 分钟 （~ 8.5 h）。因此，当与 EUCAST RAST 方法一起进行 AST 测定时，它可以在 8 小时 AST 读数时间内给出分离物鉴定。这种方法有可能实施 EUCAST RAST 方法，从而消除对基于质谱的鉴定的需求。对于希望在常规工作流程中实施 EUCAST RAST 方法以减少临床报告时间并规避其实施的主要障碍的资源匮乏环境来说，这是一个福音。

在引入 EUCAST RAST 方法之前，多位作者已经评估了 +aBC 直接测试对各种 aMIAST 系统21、22、23、24、25、26、27、29、30、31 的准确性。在这些研究中，直接检测方案在单离心机29、30、31、32 或双离心机21、22、24、25、26、27 之后的不同用于制造细菌颗粒。在一步法中，将来自 +aBC 的血汤混合物在血清分离管 （SST） 中高速离心，以沉淀硅凝胶层上方的细菌。该颗粒用于制备用于接种身份证的接种物。在双离心法中，首先将来自 +aBC 的血汤混合物在 SST 中以低速离心以沉淀出血细胞。从该管中除去含有细菌的上清液并转移到新管中，并进行高速离心。从该管中弃去上清液，用沉淀接种适当的鉴定卡。在这些研究中，一致性率从 62%-100% 不等，但总的来说，双离心法的准确性更高。

我们发现该方法易于执行，并且在常规诊断实验室中进行，由 >10 名实验室技术人员轮换，证明了该方法的稳健性。在含有一种 RR-GN 的 ~94% （98/105） +naBC 中，DIP 正确识别了微生物。不同类别生物体的一致性率也相当，因为大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌复合物的一致性分别为 94%、90%、100% 和 92.3%。我们还发现，任何革兰氏阴性菌的总体一致性均不理想，为 ~77% （157/204）。然而，这些错误鉴定大多是与非发酵革兰氏阴性菌有关，例如鲍曼复合体以外的不动杆菌属、铜绿假单胞菌属、莫拉氏菌属和少鞘氨醇单胞菌，它们通常被认为是皮肤的常见污染物。其他作者也注意到了与非发酵革兰氏阴性菌的错误识别21,23，这可能是由于这些细菌在 aMIAST 鉴定卡中的反应性低。

我们发现使用 DIP 时 +naBCs 中细菌的 TTI 显着降低。在常规临床诊断实验室中进行时，DIP 的中位 TTI 比 SIP 的中位 TTI （507 min vs 2171 min） 低约 4 倍。该 ~8.5 小时的 TTI 还包括 aBC 阳性标记和 aMIAST 卡接种性能之间的间隔，因为 aMIAST 分离分析的平均时间仅为 5.45 小时± 1.6 小时。在我们的研究中，将一致的 +naBCs 的平均阳性时间增加 728 分钟± 301 分钟（~12 小时），这种细菌鉴定方法有可能在常规诊断实验室收到 aBC 后提供当天报告。

DIP 也存在一定的限制。首先，由于它是接种物制剂的标签外使用，因此结果应被视为初步结果，EUCAST RAST 的 AST 结果也应被视为初步结果。尽管如此，它的主要目的是及时识别具有相当诊断准确性的 RR-GN。其次，存在浪费测试资源的实际可能性，如大约 60% 的 +naBCs;由于多种微生物感染或发现非 RRGN，我们无法报告。这种资源浪费适用于任何用于血培养的新型自动化直接 AST 方法。第三，由于样本采集方法不佳，本研究中的多种微生物感染率和常见皮肤污染物的鉴定率较高。第四，我们没有用质谱法确认受试分离株的身份，质谱法是目前细菌鉴定的金标准。

这项研究成功地确定，即使进行表型测试，也可以在同一天报告阳性血培养，尤其是在革兰氏阴性菌血症中。这有可能大大缩短在中低收入国家开始适当抗菌治疗的持续时间，因为用于细菌鉴定和 AST 的微生物诊断严重依赖传统的表型测试。这种方法应通过进行多中心研究来验证，其对患者预后的潜在影响，并作为一种抗菌药物管理工具，应成为未来低收入和中等收入国家临床试验的重点。

总而言之，aMIAST 的 DIP 补充了 EUCAST RAST 方法，以实现 RR-GN 的早期识别。这消除了依赖高级微生物鉴定和 AST 技术的需要，因为使用这些方法进行报告的时间与这种方法相当。在革兰氏阴性菌的情况下，如果它们得到最大程度的优化，可以通过传统的表型方法实现当天报告。这有可能缩短广谱抗菌治疗的持续时间，并促进资源有限地区的抗菌药物管理。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可披露的。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该研究由 AIIMS Bhopal 提供给 Ayush Gupta 博士的校内研究资助。我们感谢实验室技术人员和住院医生的贡献，他们在日常和紧急情况下勤奋地执行和阅读测试。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
抗菌盘
阿米卡星盘 30 &gHimedia，印度孟买SD035-1VL药敏试验 
Amoxyclav 椎间盘（20/10 µg）印度孟买Himedia SD063-1VL药敏试验 
头孢噻肟盘 5 µgHimedia，印度孟买SD295E-1VL药敏试验 
头孢他啶 disk 10 µgHimedia，印度孟买SD062A-1VL药敏试验 
环丙沙星圆盘（5 µg）印度孟买Himedia SD060-1VL药敏试验 
复方新诺明圆盘（23.75/1.25 µg）印度孟买Himedia SD010-1VL药敏试验 
庆大霉素盘 10 & 微量;gHimedia，印度孟买SD016-1VL药敏试验 
亚胺培南盘 10 & micro;gHimedia，印度孟买SD073-1VL药敏试验 
左氧氟沙星圆盘 5 & 微量;gHimedia，印度孟买SD216-1VL药敏试验 
美罗培南圆盘 10 µG Himedia，印度孟买SD727-1VL药敏试验 
哌拉西林-他唑巴坦圆盘（30/6 µg）Himedia，印度孟买SD292E-1VL药敏试验 
妥布霉素圆盘 10 µgHimedia，印度孟买SD044-1VL药敏试验 
ATCC 大肠杆菌 25922微生物制剂，美国明尼苏达州0335A质量控制的革兰氏阴性菌菌株
梅里埃，Marcy d'Etoille， 法国412CM8423连续式自动血液培养系统
生物安全柜 II 型A2 Dyna Filters Pvt. Limited， Pune， IndiaDFP-2/21-22/149用于防止危险和传染源并保持质量控制
血琼脂碱 2 号 Himedia， 孟买， 印度M834-500G血琼脂和巧克力琼脂的制备
临床离心机模型SP-8BLLaby Instruments，印度安巴拉HLL/2021-22/021低速和高速离心分离上清液
Dispensette S 模拟可调瓶口分液器 BrandTech， Essex CT， EnglandV1200分配准确量的生理盐水
MacConkey 琼脂 Himedia，印度孟买M008-500G用于乳糖发酵罐/非发酵罐的差别培养基革兰氏阴性杆菌
微量移液器（100-1000 µL）Axiflow Biotech Private Limited，印度德里NJ478162第一次离心后转移上清液，第二次离心后丢弃上清液微量
移液器吸头（200-1000 µL）‎Tarsons Products Pvt. Ltd.， 加尔各答， 印度521020第一次离心后转移上清液，第二次离心后丢弃上清
Mueller-Hinton 琼脂 Himedia，印度孟买M173-500G通过 Kirby-Bauer 圆盘扩散法进行药敏试验
镍铬合金环 D-4Himedia，印度孟买LA019用于在培养基上划线
Nichrome 直线Himedia，印度孟买LA022用于刺接种
Nulife 无菌手套MRK healthcare Pvt Limited，印度为了安全注意事项
普通样品瓶（带红色顶部的小瓶），Advance BD 真空采血器Becton-Dickinson，Cockeysville，MD，USA367815第二次离心后获得沉淀
绵羊血Labline Trading Co.，海得拉巴，印度70014血琼脂和巧克力琼脂
SST II 管的制备，Advance BD 真空采血器Becton-Dickinson，Cockeysville，MD，美国367954第一次离心中的上清液分离
无菌棉签（带木棍）Himedia，孟买，印度PW005-1X500NO抗菌药物敏感性测试的血培养液的草坪培养
无菌一次性皮下注射器 5ml/ccNihal Healthcare，Solan，印度2213805NB2从 +aBC
VITEK DensiCHEK McFarland 参考试剂盒制备等分试样生物梅里埃，Marcy d'Etoille， 法国422219密度计检查悬浮
VITEK 盐水溶液 （0.45% NaCl）bioMerieux， Marcy d'Etoille， FranceV1204McFarland 标准浊度
VITEK 管架的调整 生物梅里埃，Marcy d'Etoille， 法国533306-4 REV用于在 ID 卡接种前正确放置试管的支架
VITEK 试管bioMerieux， Marcy d'Etoille， 法国管
VITEK-2 Compact 60bioMerieux， Marcy d'Etoille， 法国VKC15144自动识别和 AST 系统
VITEK-2 GN 卡bioMerieux， Marcy d'Etoille、法国21341革兰氏阴性杆菌的鉴定
推荐用于 RAST BacT-Alert 3D 480 生物液 孟买 用于液 的浊度 接种

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