EUCAST 已开发出一种用于自动化血培养的直接抗菌药物敏感性试验（AST）方案。然而，通过在自动化微生物鉴定系统中采用直接接种物制备方案，可避免对该方法依赖于质谱法进行微生物鉴定的需求。该方法可在样本采集后 24 小时内提供 AST 报告。
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摘要
摘要
革兰阴性菌（GN）败血症是一种医疗急症，在资源有限的环境中，其管理依赖于传统的微生物培养技术，通常需要3-4天才能获得结果。鉴于此类检测周转时间（TAT）较长，EUCAST和CLSI均已制定了直接从自动血培养瓶阳性报警样本（+aBCs）中测定抗菌药物敏感性试验（AST）结果的操作规程。EUCAST快速AST（RAST）方案于2018年首次推出，该方案针对四种常见的GN败血症致病菌，规定了抑菌圈直径的折点值，即 大肠杆菌，肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌，以及 鲍曼不动杆菌 复合体的检出可被报告。然而，已将此方法纳入常规工作流程的临床实验室依赖于基于质谱的微生物鉴定技术，该技术不易获得，从而限制了其在资源有限环境中的应用。为克服这一限制，我们评估了一种直接接种法（DIP），联合使用商用的自动化微生物鉴定与抗菌药物敏感性试验系统（aMIAST），以实现在血培养瓶阳性报警后8小时内完成早期微生物鉴定。我们于2023年1月至10月期间评估了该方案在阳性报警血培养（aBC）中鉴定四种需报告的革兰阴性菌（RR-GN）的效果。DIP所得的微生物鉴定结果与aMIAST中标准接种法（SIP）的结果进行了比较。在204例单一致病性革兰阴性菌阳性的血培养（+naBC）样本中，SIP方法在105例+naBC中鉴定出4种RR-GN之一大肠杆菌： 50, 肺炎克雷伯菌： 20, 铜绿假单胞菌： 9 和 A. baumannii 复合体：26）。其中，DIP 正确鉴定出 94%（98/105），主要错误率和极主要错误率分别为 6%（7/105）和 1.7%（4/240）。当采用 EUCAST RAST 方法进行微生物鉴定的 DIP 检测时，可在接收样本后 24 小时内提供初步临床报告。该方法有望显著缩短周转时间（TAT），从而实现早期启动适当的抗菌治疗。
引言
脓毒症是一种重要的全球健康问题，定义为因宿主对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍。《全球疾病负担研究》估计，2017年全球有4890万例脓毒症病例，脓毒症相关死亡人数达1100万，约占全球死亡总数的20%1约三分之二rd 由革兰氏阴性细菌病原体引起的血流感染（BSI）导致的死亡率2革兰阴性菌（GN）感染导致死亡的主要原因包括 大肠杆菌, 肺炎克雷伯菌, 铜绿假单胞菌，以及 鲍曼不动杆菌, 占33种细菌病原体病例总数的约40%2.
血培养仍是诊断血流感染（BSI）的金标准，快速进行微生物鉴定并获得抗菌药物敏感性试验（AST）结果是临床管理的关键。据估计，在脓毒症治疗中，每延迟一小时使用适当的抗菌药物，死亡风险增加9%3。在资源有限的环境中，即使使用自动化系统，现有微生物学工具从血培养阳性到获得AST结果的周转时间（TAT）仍需约48–72小时。由于这一不理想的TAT，临床常经验性使用广谱抗菌药物，从而加剧了抗菌药物耐药（AMR）日益严重的问题。鉴于迫切需要缩短脓毒症微生物培养技术的TAT，EUCAST和CLSI正逐步推动直接从阳性报警的血培养瓶（+aBC）中进行AST
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方案
该研究由博帕尔全印度医学科学研究所（AIIMS Bhopal）授予古普塔博士（Dr. Ayush Gupta）的院内科研基金资助，并已获得机构人类伦理委员会（IHEC）批准，批准文号：IHEC-LOP/2022/IL072。
注意：样本体积 5 ml 的选择依据来自 Quesada 等人25 和 Munoz-Davila 等人27 的研究。
1. 使用aMIAST进行细菌鉴定的标准接种物方案（SIP）
- 佩戴洁净手套，在II级生物安全柜（BSC）内，使用含70%异丙醇的棉签对+naBC的隔膜进行消毒。
- 使用带有21 G针头的无菌注射器抽取约1 mL血液-肉汤混合物。
- 将针头中的血液-肉汤混合物挤出一大滴至平板培养基表面，即SBA、CA和MA平板。对平板进行划线接种后，将培养皿置于37 °C ± 2 °C的孵育箱中，在有氧条件下孵育18–24小时。
- 孵育结束后，在生物安全柜中检查平板上是否出现孤立菌落，并进一步通过aMIAST进行鉴定和抗菌药物敏感性试验（AST）。
- 对于每个分离株，将aMIAST聚苯乙烯管放入aMIAST试管架中，并使用连接在生理盐水瓶上的分配器向管中加入3 mL无菌生理盐水。....
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结果
总体结果
在研究期间，共对240例+naBCs使用DIP和SIP两种方法通过aMIAST进行鉴定。其中，15%（36/240）的+naBCs在平板培养基上经一夜培养后被发现为多微生物感染。在204例+naBCs中，通过SIP鉴定出的RR-GN比例为51.5%（105/204）。其中，47.6%（50/105）为E. coli，19%（20/105）为K. pneumoniae，8.6%（9/105）为P. aeruginosa，24.8%（26/105）为A. baumannii复合群。所有SIP鉴定结果的详细描述见表1。
微生物鉴定中的诊断准确性
在105份RR-GN样本中，有98份（93.3%）和99份（94.2%）分别在种级和属级鉴定结果上与DIP一致。各微生物的符合率分别为：E. coli为94%（47/50），K. pneumoniae为90%（18.......
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讨论
通过使用DIP，我们成功鉴定了RR-GNs，且具有较高的诊断准确性。aBC出现阳性标记后的平均TTI仅为507分钟（约8.5小时）。因此，若将其与EUCAST RAST法联合用于药敏试验（AST）测定，可在8小时的AST读取时间点获得菌株鉴定结果。该方法有望推动EUCAST RAST法的实施，从而无需依赖基于质谱的鉴定技术。这对于希望在常规工作流程中实施EUCAST RAST法以缩短临床报告时间并克服主要实施障碍的资源有限地区而言，具有重要意义。
在EUCAST RAST方法引入之前，已有多个研究者评估了从阳性血培养（+aBC）直接检测多种自动化微生物鉴定与药敏试验系统（aMIAST）的准确性21,22,23,24,25,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由博帕尔AIIMS向Ayush Gupta博士提供的院内研究基金资助。我们感谢实验室技术人员和住院医师在常规及紧急工作时间内认真完成并解读了各项检测。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>抗菌药敏纸片 | |||
| 阿米卡星纸片 30 µg | Himedia，孟买，印度 | SD035-1VL | 抗菌药物敏感性试验 |
| 阿莫西林-克拉维酸钾片（20/10） µg) | HiMedia，孟买，印度 | SD063-1VL | 抗菌药物敏感性试验 |
| 头孢噻肟纸片 5 µg | Himedia，孟买，印度 | SD295E-1VL | 抗菌药物敏感性试验 |
| 头孢他啶药敏纸片 10 µg | Himedia，孟买，印度 | SD062A-1VL | 抗菌药物敏感性试验 |
| 环丙沙星纸片（5 µg) | HiMedia，孟买，印度 | SD060-1VL | 抗菌药物敏感性试验 |
| 复方新诺明纸片（23.75/1.25） µg) | Himedia，孟买，印度 | SD010-1VL | 抗菌药物敏感性试验 |
| 庆大霉素纸片 10 µg | Himedia，孟买，印度 | SD016-1VL | 抗菌药物敏感性试验 |
| 亚胺培南纸片 10 µg | Himedia，孟买，印度 | SD073-1VL | 抗菌药物敏感性试验 |
| 左氧氟沙星纸片 5 µg | Himedia，孟买，印度 | SD216-1VL | 抗菌药物敏感性试验 |
| 美罗培南纸片 10 µg | Himedia，孟买，印度 | SD727-1VL | 抗菌药物敏感性试验 |
| 哌拉西林-他唑巴坦纸片（30/6） µg) | Himedia，孟买，印度 | SD292E-1VL | 抗菌药物敏感性试验 |
| 妥布霉素纸片 10 µg | Himedia，孟买，印度 | SD044-1VL | 抗菌药物敏感性试验 |
| ATCC 大肠杆菌 25922 | Microbiologics，明尼苏达州，美国 | 0335A | 推荐用于RAST中革兰氏阴性菌质控的菌株 |
| BacT-Alert 3D 480 | 生物梅里埃，马西’ 法国埃图瓦勒 | 412CM8423 | 全自动连续血液培养系统 |
| II级生物安全柜A2型 | Dyna Filters Pvt. Limited，浦那，印度 | DFP-2/21-22/149 | 用于防护有害物质 以及病原体并维持质量控制 |
| 血琼脂基础培养基第2号 | 希米迪亚，孟买，印度 | M834-500G | 血琼脂和巧克力琼脂的制备 |
| 临床离心机型号 SP-8BL | Laby Instruments，印度安巴拉 | HLL/2021-22/021 | 低速和高速离心以分离上清液 |
| Dispensette S 模拟可调式瓶顶移液器 | BrandTech，美国康涅狄格州埃塞克斯 | V1200 | 精确分配盐水量 |
| 麦康凯琼脂 | Himedia，孟买，印度 | M008-500G | 用于鉴别乳糖发酵与非发酵革兰氏阴性杆菌的鉴别培养基 |
| 微量移液器（100-1000） µL | Axiflow Biotech Private Limited，德里，印度 | NJ478162 | 第一次离心后转移上清液，第二次离心后弃去上清液 |
| 微量移液器吸头（200-1000） µL) | Tarsons Products Pvt. Ltd.，印度加尔各答 | 521020 | 第一次离心后转移上清液，第二次离心后弃去上清液 |
| 穆勒-欣顿琼脂 | HiMedia，孟买，印度 | M173-500G | 纸片扩散法（K irby-Bauer法）进行抗菌药物敏感性试验 |
| 镍铬丝环 D-4 | HiMedia，孟买，印度 | LA019 | 用于在培养基上划线接种 |
| 镍铬合金直丝 | HiMedia，孟买，印度 | LA022 | 用于穿刺接种 |
| Nulife 无菌手套 | MRK healthcare Pvt Limited，印度孟买 | 安全注意事项 | |
| 普通试管（红色管帽试管），Advance BD 真空采血管 | Becton-Dickinson，美国马里兰州科基斯维尔 | 367815 | 第二次离心后获得沉淀 |
| 绵羊血 | Labline Trading Co.，印度海得拉巴 | 70014 | 血琼脂和巧克力琼脂的制备 |
| SST II 管，Advance BD 真空采血管 | Becton-Dickinson，美国马里兰州科基斯维尔 | 367954 | 首次离心后上清液的分离 |
| 无菌棉签（带木棒） | Himedia，孟买，印度 | PW005-1X500NO | 血培养肉汤的涂布培养法用于抗菌药物敏感性试验 |
| 无菌一次性使用注射器 5ml/cc | Nihal Healthcare，印度索兰 | 2213805NB2 | 从 +aBC 制备等份样本 |
| VITEK DensiCHEK McFarland 标准比浊参考试剂盒 | 生物梅里埃，马尔西’ 法国埃图瓦勒 | 422219 | 用于检测悬液浊度的密度计 |
| VITEK 生理盐水溶液（0.45% NaCl） | 生物梅里埃，马尔西’ 法国埃图瓦勒 | V1204 | 麦克法兰比浊标准的调整 |
| VITEK 试管架 | 生物梅里埃，马尔西’ 法国埃图瓦勒 | 533306-4 REV | 在接种身份证卡片前，正确放置试管 |
| VITEK 胶管 | 生物梅里埃，马尔西’ 法国埃图瓦勒 | 用于接种物制备的试管 | |
| VITEK-2 Compact 60 | 生物梅里埃，马尔西’ 法国埃图瓦勒 | VKC15144 | 自动化鉴定与药敏试验系统 |
| VITEK-2 GN 卡 | 生物梅里埃，马尔西’ 法国埃图瓦勒 | 21341 | 革兰氏阴性杆菌的鉴定 |
参考文献
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990–2017: analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
- Ikuta, K. S., et al.
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