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用于体积电子显微镜的视网膜样品制备

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DOI：

10.3791/66589

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2024年5月24日

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1State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, 2Laboratory of Retinal Physiology and Disease, School of Ophthalmology and Optometry, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案详细描述了为体积电子显微镜制备视网膜样本的步骤，重点在于视网膜光感受器终末的结构特征。

摘要

体积电子显微镜（Volume EM）已成为一种强大的工具，可用于以纳米级精度可视化细胞和组织的三维结构。在视网膜中，多种类型的神经元在内丛状层和外丛状层建立突触连接。尽管传统的电子显微镜技术已为研究视网膜亚细胞器提供了有价值的见解，但其局限性在于仅能提供二维图像数据，这可能妨碍精确测量。例如，在二维图像中难以准确量化对突触传递至关重要的三种不同突触囊泡池的大小。体积EM通过提供大规模、高分辨率的三维数据解决了这一问题。值得注意的是，样品制备是体积EM中的关键步骤，显著影响图像的清晰度和对比度。在此背景下，我们提出了一种用于视网膜光感受器轴突终末三维重建的样品制备方案。该方案包括三个关键步骤：视网膜解剖与固定、样品包埋过程以及感兴趣区域的选择。

引言

视网膜中密集排列着相互交错的神经元轴突和树突，它们之间形成突触1。由于视网膜结构精细、复杂且微小，显微镜技术是研究其解剖结构不可或缺的工具。尽管电子显微镜（EM）在研究细胞器超微结构以及在纳米级别精确定位特定蛋白质方面具有无与伦比的优势2，但它所生成的图像仅限于二维（2D）平面，可能导致关键信息的丢失。

新兴的高分辨率体积电子显微镜（Volume EM）技术的发展，为获取更全面、更大规模的三维（3D）结构信息提供了支持。一些3D EM方法已被其他研究者综述过3,4,5。3D EM能够重建神经元的形态和连接细节，从而实现对目标结构的精确定量分析。这表明，通过体积EM获得的数据更加系统、完整和准确。

视网膜感光细胞作为视觉信号传导中的初级神经元6,7，其轴突终末与二级双极细胞和水平细胞的树突形成突触，以传递兴奋性信号8,9。这些终末结构被称为视锥细胞的突触足（cone pedicles）和视杆细胞的突触球（rod spherules），包含三个关键组分：线粒体、突触带（synaptic ribbons）和突触小泡。尽管以往研究主要集中于带状突触的整体结构，但对于主要组分（包括线粒体、突触带、小泡池）及其在终末内的空间排布等精细结构的研究仍明显缺乏10,11,12,13。对各组分进行精确而系统的分析，并阐明它们在感光细胞终末内的相互关联，对于揭示其空间组织特征以及全面理解视觉信息处理功能至关重要。在感光细胞中，线粒体主要分布于内节、胞体及终末区域。本文重点关注感光细胞终末中的线粒体。聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）是一种具有高分辨率（x、y 和 z 方向分辨率 < 5 nm）和相对较大体积通量的三维电镜技术4,14，是精确可视化感光细胞终末三维结构的有力工具。

聚焦离子束-扫描电子显微镜（FIB-SEM）和连续块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）均为基于扫描电子显微镜（SEM）的体积电子显微镜技术，通过扫描样品表面来获取组织图像。当电子束扫描样品时，二次电子或背散射电子（BSE）的强度差异形成对比，从而揭示样品表面的超微结构特征15。本质上，在SEM中检测树脂包埋组织样品横截面产生的BSE或二次电子，即可获得包埋样品的图像16,17。当BSE或二次电子产生较少时，仅能获取样品表面的信息。要实现一致的对比度和高质量的连续图像，必须在样品中充分沉积重金属。因此，在利用SEM进行连续成像时，特定的样品制备方案对于后续的分割、三维重建与分析至关重要。锇-硫代碳酰肼-锇（OTO）法是生物样品三维电子显微镜成像中典型的样品制备方法，可有效保存含脂膜的结构并维持良好的对比度18,19。

本文中，我们开发了用于体积电子显微镜（Volume EM）视网膜样品制备的OTO方法。该方法特别聚焦于视网膜的解剖、确定视网膜组织的最佳固定时间，以及详细说明三维样品制备中的具体操作步骤和注意事项。此外，目标结构的分割与三维重建也是该扩展应用中的关键步骤。由于视网膜是一种体积小且取材困难的结构，进行电镜观察时需要迅速而精确的操作，并使用预先配制、新鲜的试剂以及严格控制的固定时间。

方案

动物护理和使用方案经温州医科大学伦理委员会批准，并遵循视觉与眼科研究协会（ARVO）制定的指南。所有小鼠均在12小时光照、12小时黑暗循环条件下饲养，并提供标准饲料饮食。

1. 视网膜解剖与固定

  1. 通过腹腔注射2,2,2-三溴乙醇（0.25 mg/g体重）对小鼠（C57BL/6J，雄性，8周龄，20–25 g）进行麻醉。通过夹捏脚趾后无后肢回缩反应或无眨眼反射来确认麻醉深度。随后，在仍处于麻醉状态下进行颈椎脱位，以实施安乐死。
    注意：选择三溴乙醇是因为其在诱导小型动物模型快速且可靠的麻醉方面具有充分的文献支持，尤其适用于短期操作。尽管优先使用药用级麻醉剂，但在某些实验方案中，三溴乙醇因其特定优势而成为合适的替代选择，前提是正确配制和给药。已采取所有必要预防措施以确保其安全有效使用。本研究遵循伦理原则，通过确保适当的配制、给药和监测，以降低与其使用相关的潜在风险。
  2. 使用弯头剪刀摘除眼球，并将眼球浸入含有2%戊二醛和2%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（PB，0.1 M，pH 7.4）混合溶液中。
  3. 在解剖显微镜下使用镊子去除眼球的前段结构和玻璃体。
  4. 用两把镊子剥离巩膜，直至视网膜完全从眼杯中分离。
  5. 用刀片迅速将视网膜切成100–200 µm厚的条状，用巴斯德吸管将视网膜条转移至新的微量离心管（EP管）中，管内含有2%戊二醛和2%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（PB，0.1 M，pH 7.4），在室温（RT）下于旋转仪上固定2小时。完成后，将EP管转移至4 °C继续固定24小时。

2. 样品包埋过程

  1. 用 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）清洗视网膜条 5 次，每次 15 分钟 ，然后将视网膜条在含 1.5% 亚铁氰化钾和 1% OsO4（在磷酸盐缓冲液中，pH 7.4）的溶液中，置于含 4 mM CaCl2 的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液中，于冰上避光孵育 1.5 小时。
    注意：避光孵育并避免使用磷酸盐可防止样品中出现沉淀和伪影。
  2. 用 ddH2O 清洗视网膜条 3 次 ，每次 10 分钟，然后在室温避光条件下用 1% 硫羰基二肼（thiocarbohydrazide）水溶液处理 30 分钟。
  3. 用 ddH2O 漂洗 3 次 ，每次 15 分钟，然后将视网膜条在 2% OsO4（在磷酸盐缓冲液中，pH 7.4）中避光室温孵育 45 分钟。
  4. 用 ddH2O 清洗 3 次 ，每次 15 分钟，然后将视网膜条在 1% 醋酸铀酰水溶液中 4 °C 避光浸泡过夜 。
  5. 次日，用 ddH2O 清洗 3 次 ，每次 15 分钟，然后将视网膜条在 0.66% 硝酸铅的 L-天冬氨酸溶液（0.03 M，pH 5.5）中于 65 °C 处理 40 分钟。
  6. 用 ddH2O 清洗 3 次 ，每次 15 分钟，然后用梯度浓度的乙醇（30%、50%、70%、90% 和 100%）对视网膜条进行脱水处理，每种浓度处理 20 分钟。
  7. 用等体积乙醇与丙酮的混合液处理视网膜条 20 分钟，随后用丙酮清洗 2 次 ，每次 20 分钟。
  8. 将视网膜条在丙酮/树脂（体积比 7:3）的混合液中避光室温 浸润过夜，然后在丙酮/树脂（体积比 3:7）中避光室温继续浸润 24 小时。
    注意：树脂的精确组成为：Epon812 10.06 mL，DDSA 4 mL，MNA 5.94 mL，DMP-30 0.2 mL。
  9. 次日更换离心管，将视网膜条在纯树脂中 45 °C 浸润 24 小时。再次更换树脂，于 60 °C 包埋 48 小时。
    注意：升高温度的目的是为了提高树脂的渗透性。

3. 感兴趣区域的选择

  1. 将树脂块切成1 µm厚的切片，用1%甲苯胺蓝染色，并在光学显微镜下观察视网膜的一般结构，以选择大致的兴趣区域。
  2. 使用溅射镀膜仪在树脂块表面镀上铂层，随后在0.23 nA电流和30 kV加速电压下，利用聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）进行切削，获得70 nm厚的切片。
  3. 使用FIB-SEM以2000倍放大率对切片进行预筛选，以确定精确的兴趣区域。
  4. 采用FIB-SEM采集数据，电子束电流为0.69 nA，加速电压为2 kV。其他参数如下：停留时间 = 2 µs，体素尺寸 = 1.8 nm × 1.8 nm × 15 nm。

结果

图1A显示了使用传统化学双重固定法制备的视网膜光感受器终末图像，图1B显示了使用OTO方法制备的视网膜光感受器终末图像。两者均通过聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）采样。可以明显看出，采用OTO方法能够最大程度地保留细胞膜结构，甚至囊泡的轮廓也清晰可见。此外，使用OTO方法获得的图像对比度也更清晰。

图2展示了用于重建视光感受器终末超微结构特征的实验流程。重建工作聚焦于四种类型的视光感受器终末，包括M-视锥细胞足突、S-视锥细胞足突、rod1球状突和rod2球状突。重点在于视光感受器终末内的关键组分，如线粒体、突触带和突触小泡池。

图3展示了在视杆光感受器终末中重建的线粒体和突触带状体。值得注意的是，视杆细胞2号球状终末的突触带状体呈现出独特的马蹄形结构，通常每个球状终末内仅含一个带状体。此外，图2显示视杆细胞球状终末中含有两个线粒体，其位置稳定地位于终末中央区域，且位于突触带状体的上方。所有结构均通过逐页手动追踪完成。

电子显微镜图像，A-B，细胞超微结构比较，细胞器，高倍放大。
图1：使用聚焦离子束-扫描电子显微镜（FIB-SEM）采集的传统化学双重固定法与OTO法图像示例。（A）传统化学双重固定法。（B）OTO法。比例尺：1000 nm。请点击此处查看该图的放大版本。

电子显微镜图像处理：对齐、分割、三维重建、细胞结构分析。
图 2：利用聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）对光感受器终末进行三维重建的工作流程。 使用三维数据可视化软件完成图像对齐后，对连续切片图像进行人工分割与三维重建，以用于后续分析。(A) 原始连续图像。(B) 对齐后的图像。(C) 分割后的图像。(D) 重建后的图像。请点击此处查看该图的高清版本。

细胞结构示意图；纳米级成像；突出显示亚细胞组分；显微镜技术。
图3：三维重建。 代表性三维重建图像中，光感受器终末呈白色，线粒体呈橙色，突触带呈蓝色。比例尺：500 nm。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

我们采用了OTO的体积电子显微镜样品制备方案，以分析视网膜组织中光感受器终末的结构。重点在于详细描述整个操作流程，从视网膜的分离与固定开始，直至展示光感受器轴突终末三维重建的结果。

视网膜组织与脑组织不同，其显著特征在于缺乏区域差异性。视网膜由三层神经元胞体层和两层突触连接层组成，尽管其神经元和突触成分复杂，但仍呈现出规则且具有层次性的结构20。在分离视网膜时，必须尽量减小组织条带的宽度，以确保后续样品制备过程中获得均匀的对比度。光感受器轴突末梢是研究的关键结构，位于视网膜的外丛状层（OPL）。视网膜的层次化和有序结构有利于目标结构的高效定位，可在透射电镜观察中实现精确取样，并确保后续三维重建结果的准确性。

体积电子显微镜（Volume EM）利用连续切片技术，可在纳米尺度上实现视网膜内局部神经环路及突触连接的三维可视化21,22。该技术能够自动生​​成高分辨率的三维图像，而聚焦离子束-扫描电子显微镜（FIB-SEM）有望揭示生理与病理活动的复杂细节。因此，在样品制备过程中，保持整个样品块内图像对比度的稳定性至关重要。为实现均匀的导电性，我们采用预包埋的OTO方法，这是一种经典且被广泛认可的有效增强扫描电子显微镜（SEM）对比度的方法18,23,24。该方法结合了双锇染色与硫羰肼处理，确保大样品具备最佳的整体导电性。此外，双锇处理有助于更优地保存脂质膜结构，从而提升研究的精确性。视网膜样品具有层级结构，组织块较小且易于试剂渗透，OTO方法可更好地维持细胞膜轮廓及图像对比度的均匀性。

该方案的成功依赖于多个关键因素。首先，快速获取视网膜组织并精确控制固定时间，对于维持最佳的亚细胞结构至关重要。其次，确保锇酸和硫代碳酰肼的浓度适当，是保持连续图像中膜结构对比度的关键。其中，锇酸尤为关键，它可与脂质分子结合，增强背散射电子（BSE）信号。

我们的视网膜样品制备方案操作简便，无需额外设备，且最大限度地缩短了处理时间。这一特点凸显了其在其他体积电子显微技术中的潜在适用性，表明该方法具有良好的通用性和在不同实验体系中易于推广的优势。OTO方法显著增强了聚焦离子束-扫描电镜（FIB-SEM）图像的对比度。然而，细胞膜的细节，尤其是双层结构，可能仍显得较为模糊。我们目前的样品制备方案在一定程度上牺牲了细胞结构中部分细微特征。未来我们将致力于开发优化的方法，以解决并改善这一局限性。

致谢

本工作部分得到了中国国家重点研发计划（2022YFA1105503）、神经科学国家重点实验室（SKLN-202103）以及中国浙江省自然科学基金（Y21H120019）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2,2,2-三溴乙醇Sigma-AldrichT48402
丙酮Electron Microscopy Science10000
Amira 6.8Thermo Fisher Scientific
CaCl2SigmaC-2661
包埋模具北京中京科技有限公司GP10590
Epon 树脂Electron Microscopy Science14900
乙醇Sigma64-17-5
戊二醛Electron Microscopy Science16020
Helios NanoLab 600i 双束扫描电镜FEI
L-天冬氨酸Sigma56-84-8
硝酸铅Sigma10099-74-8
Na2HPO4.12H2OSigma71650磷酸缓冲液的组分
NaH2PO4.H2OSigma71507磷酸缓冲液的组分
OsO4TED PELLA4008-160501
多聚甲醛Electron Microscopy Science157-8
亚铁氰化钾Sigma14459-95-1
二甲胂酸钠Sigma6131-99-3
溅射镀膜仪LeicaACE200
硫代碳酰肼Sigma2231-57-4
醋酸铀酰TED PELLACA96049

参考文献

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