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在小鼠中模拟高强度重复低级别爆炸暴露

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DOI：

10.3791/66592

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2024年5月24日

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1United States Army Special Operations Command, 2CU Anschutz Center for COMBAT Research, Department of Emergency Medicine, University of Colorado School of Medicine, 3University of Washington School of Nursing, 4University of Delaware School of Nursing, 5Veterans Affairs Northwest Mental Illness Research, Education, and Clinical Center (MIRECC), VA Puget Sound Health Care System, 6Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, University of Washington School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了利用小鼠产生重复低强度爆炸暴露的方法。

摘要

接触爆炸冲击波是暴露人群发生脑损伤的重要风险因素。尽管大强度爆炸对大脑的影响已较为明确，但在军事训练中常见的较小强度爆炸所造成的影响仍缺乏充分认识。这种轻微的低强度爆炸暴露在不同军事职业和训练强度下差异显著，某些部队在数年内仅经历少数几次暴露，而其他部队可能在数周内经历数百次暴露。动物模型在识别低强度爆炸暴露后的损伤机制及长期临床健康风险方面具有重要作用。为准确反映上述广泛差异的暴露情况，需要建立能够模拟此类多样化暴露条件的动物模型，以揭示不同风险特征下急性与慢性损伤的结局。

尽管少数几次低强度爆炸暴露后的效应易于通过机制研究进行建模，但职业过程中长期反复发生的暴露可能更适合采用在数周至数月内频繁重复暴露的爆炸损伤模型来模拟。本文展示了在小鼠中建立高度重复性低强度爆炸暴露的建模方法。该方法基于已建立且广泛应用的气动激波管开放场爆炸暴露模型，可通过调整超压参数以及暴露次数或间隔时间进行规模缩放。这些方法可用于开展机制性研究，或重现所研究临床群体中常见的爆炸暴露情况。

引言

低强度爆炸（LLB）暴露是指个体或结构受到相对较弱的爆炸力作用，通常源于小型工业事故、受控拆除作业或某些军事训练活动。相比之下，高强度爆炸（HLB）暴露则涉及强烈且可能具有破坏性的爆炸力，常见于军事战斗、恐怖袭击或大规模意外爆炸事件中。因此，LLB与HLB之间的主要区别在于爆炸事件的强度，以及由此决定的暴露个体在出现身体或功能损伤前对重复暴露的耐受能力。在这方面，HLB暴露的影响通常比LLB暴露更为明显。正因如此，经历显著LLB暴露的个体可能面临更高的风险，其损伤或功能缺陷会缓慢发展，在累积效应变得可察觉之前往往难以被发现。

目前的研究旨在加深我们对爆炸暴露特性（如强度或重复性）如何导致损伤的理解，以便更好地指导预防和医疗管理。在军事医学中，了解爆炸暴露的临床意义至关重要，因此需要能够为这些结果提供依据的动物模型。尽管动物模型已帮助阐明了高强度爆炸（HLB）的影响，但低强度爆炸（LLB）暴露的影响在很大程度上仍未得到充分研究。大量建模研究考察了爆炸超压接近或高于每平方英寸10磅（psi）峰值压力时的效应1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18，但很少有研究报告聚焦于1至7 psi范围内的压力水平19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36，而这一范围在军事训练环境中更为常见37,38,39,40，且接近历史上规定的4 psi环境安全暴露阈值。因此，广泛传播针对LLB常用峰值压力的研究方法，可能有助于加快在军事医学和部队优化方面的临床洞察。

越来越多的流行病学研究发现，军事人员低强度爆炸暴露（LLB）的职业风险与多种临床诊断之间存在显著关联41,42,43,44。这些研究支持一种尚不明确的剂量依赖性关系，重复的LLB暴露显示出更高的风险41。这表明，在军事环境中，累积爆炸暴露程度的增加在决定临床结局方面起着关键作用。

以往关于10 psi以下低强度爆炸（LLB）的动物模型研究主要采用炸药或冲击管系统来探究暴露效应。尽管这些模型通常仅考察一次至三次暴露的影响，但它们仍增进了人们对低强度爆炸暴露所导致的机制性19,20,30,31、神经病理学29,31,33以及行为学后果19,20,23,25,32,34的理解，此类暴露在军事训练环境中具有典型性。

针对由开阔场地炸药产生的单次低强度冲击波（LLB）的研究已报道了与创伤后应激障碍常相关的轻微脑部病理学改变和行为变化的证据。Woods 及其同事24在 2.5–5.5 psi 条件下未能检测到显微镜下可见的脑损伤，但他们通过质谱分析检测到了脑组织糖鞘脂的定量变化。采用相同的峰值压力和实验设计，Rubovitch 及其同事25观察到爆炸后出现行为改变，但在光学显微镜下测量时同样未发现明显的脑部病理变化。然而，在后续的病理学研究中，通过电子显微镜在暴露于 6.7 psi LLB 的小鼠脑内明确发现了脑髓鞘、线粒体、神经元及神经血管系统的超微结构损伤29,30,31,32,33。有趣的是，多项使用开阔场地炸药、压力约为 10 psi 或更低的 LLB 研究报告称，单次暴露后约有 3–8% 的死亡率25,36。

此前已有多个使用实验室激波管的研究报道了类似结果。在研究激波管产生的单次低强度爆炸（LLB）时，已有证据表明，暴露于一次1.7 psi爆炸后，会出现神经细胞骨架损伤以及神经元放电模式的改变22。在4 psi条件下，暴露于LLB的大鼠出现胼胝体功能障碍，并伴随神经行为学缺陷23。与空气中测得的爆炸持续时间相比，Chavko及其同事27发现，暴露于5.8 psi的大鼠脑组织中，爆炸超压的正压相持续时间显著延长。Ahmed及其同事35在一项小鼠研究中发现，暴露于7.5 psi后，血清中特定的炎症、代谢、血管和神经损伤相关蛋白水平在暴露后一个月内仍可检测到明显变化，这可能为类似的损伤反应提供生物标志物支持。有趣的是，该研究还报告了暴露后24小时出现4.5%的死亡率。

在一项研究中，对大鼠单次暴露20分钟并接受三次冲击管低强度冲击波（LLB）作用，结果显示1.4至8.7 psi范围内的LLB可引起颅内压（ICP）呈psi依赖性升高，较低psi值引起的ICP变化持续时间更长20，并导致认知功能改变19,20。同一研究团队利用猪模型进一步发现，当动物被置于模拟人类操作装备时的炮手位置，接受来自多种军事装备产生的三次4 psi LLB暴露，足以引发组织学上的神经病理学改变21。

这些研究共同揭示了在有限暴露和恢复条件下，低强度爆炸暴露（LLB）可能产生的多种影响。重复的LLB暴露似乎会引发持续的认知与行为缺陷，这强调了深入理解其累积效应的重要性，以便我们能更准确地判断这些效应何时可能具有临床显著性；这一点对于反复暴露于高强度LLB的军事训练人员尤为相关。为实现这一目标，亟需开展新的研究，因为现有文献尚不足以充分模拟常规军事训练中常见的暴露情景——此类情景通常在数天内经历一次以上的多次爆炸暴露。

特种作战部队（SOF）在日常训练中可能会经历显著且高度重复的低强度冲击波暴露（LLB）。最近一项研究估计，在一次爆炸突入破障小组中，所有岗位人员在一周训练期间所承受的累计峰值压力可高达184 psi42。该估算部分基于保守假设：每天使用6次破障装药，每次平均产生4 psi的峰值压力，数据由人员佩戴的冲击波测量仪测得；该数值未计入闪光震撼弹及其他装置的影响45。常规训练周期可能持续数周。为了便于研究类似特种作战部队成员训练过程中所经历的临床LLB效应，本文提出一种在实验室冲击管系统中模拟高度重复性LLB暴露的模型。该方法基于已建立的气动式冲击管系统46,47,48，可实现2 psi及以上压力水平的高度可重复性研究。该方法不受天气等外部因素影响，实验中未观察到动物死亡，且可在实验室环境中进行。因此，该方法支持对同一受试对象进行持续、每日重复的LLB暴露，适用于持续数周至数月的研究，从而为军事训练效应提供高保真度的实验研究平台。

方案

所有操作均根据退伍军人事务普吉特湾医疗保健系统机构动物护理和使用委员会批准的方案 #1588223 进行，并遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》。

1. 动物护理

注意：LLB 的动物模型仅受限于动物的可获得性以及激波管容纳其体型的能力。本文所述的激波管是专门为小鼠实验设计的。

  1. 使用3至4月龄的雄性或雌性C57BL/6J小鼠，或其他符合实验需求的经批准小鼠品系/品系。将小鼠饲养在特定病原体阴性设施中，保持12小时光照-黑暗循环。 随意摄取 可自由获取食物和水。小鼠通常以每笼4至5只进行群养。维持实验动物设施温度在20–22 °C。
  2. 将装有爆炸组和假手术组小鼠的笼子转移至附近的暂养区。另准备单独的空笼子，用于将小鼠个体转移至冲击室及从冲击室移出。

2. 冲击管制备

  1. （安全检查）确认已完成针对特定系统的必要安全检查。确保气体供应（氦气）和主电源已关闭或断开。
  2. 根据需要准备特定数量的低强度爆破所用的膜片（图1.1）。根据本方案中使用的激波管型号，按要求裁剪膜片尺寸：
    1. 将一张塑料保鲜膜裁成5.5" × 5.5"的正方形，用于密封卷轴，使其能够加压。
    2. 将一张标准8.5" × 11"复印纸（75 g/m2）裁为5.5" × 11"；将裁好的纸张对折，形成5.5" × 5.5"的正方形。
    3. 取一张500 G聚酯膜（厚度125 µm）。
      注：此类膜片在标准低强度爆破中不会破裂或显著变形，可在当天实验过程中重复使用。
  3. 取一块保鲜膜正方形和一块折叠好的纸张，将其平铺在平坦表面上（图1.2）。将折叠的纸张放在保鲜膜上方，并尽可能对齐两者（图1.3）。为加快重复爆破操作，可预先准备好所有膜片堆叠结构。
  4. 将聚酯膜卷成小管状（直径约等于食指；图1.4,1.5），插入驱动段与卷轴之间。将其完全插入装置中后松开，使其在分隔驱动段与卷轴的橡胶密封圈处展开。推动卷轴朝向驱动段，以固定聚酯膜位置；此操作将使卷轴与激波管的被驱动段之间解除密封。
  5. 将手指置于保鲜膜上半部分下方，小心地将保鲜膜和纸张一起向自己方向滚动，确保两者同步卷起且不发生错位（图1.6）。
  6. 将膜片堆叠结构插入激波管的卷轴段与被驱动段之间（图1.7）。
  7. 让膜片堆叠自然展开，使塑料密封面朝向卷轴，纸张面朝向激波管的被驱动段（图1.8）。
    注：此方向可形成气密密封，使系统能够加压。
  8. 闭合卷轴组件（图1.9,1.10）。根据需要用手动或液压方式拧紧螺栓，固定驱动段-卷轴-激波管组件，以便系统加压。（安全检查； 图1.10）
    注：对于液压系统，应确保闭合组件达到目标压力，以防止点火失败，否则可能需要更换膜片并延缓低强度爆破暴露过程。我们采用液压方式将组件闭合至500 psi。

3. 动物准备

  1. 打开麻醉室下方的循环水加热垫，将温度设置为 37 °C（图 1.11）。在加热垫上方放置一张吸水性医用垫。
  2. 在饲养室中，从鼠笼中取出一只小鼠，放入一个空的转运笼内。将装有小鼠的转运笼带入冲击波实验间。
  3. 将氧气流速调节至 1.0 L/min（lpm），并开启真空废气清除系统（图 1.12）。
  4. 将异氟烷开启至 5%（以快速诱导无意识状态），并将气流导入啮齿类动物麻醉室（图 1.13）。
  5. 将小鼠放入麻醉室中以诱导麻醉（图 1.14）。
  6. 当小鼠完全麻醉且稳定呼吸持续 30 秒后，将手伸入麻醉室，对小鼠进行耳缘打孔，以便在整个研究后续过程中进行明确的长期个体识别。此步骤需在当前阶段完成，以避免干扰冲击后的恢复时间。随后，将无菌眼用润滑剂涂抹于双眼，防止角膜干燥。
  7. 将小鼠从麻醉室中取出，将其鼻部插入鼻罩（图 1.15）。将麻醉气体（如异氟烷）的气流从诱导室切换至鼻罩。
  8. 使用小片实验室胶带轻轻固定小鼠四肢于手术台面上（图 1.16）。
  9. 在固定小鼠四肢后，用金属丝扎带分别绕过每只肢体并拧紧，将小鼠在腕部和踝部牢固固定于手术台面（图 1.17）。用一根较大的扎带绕过胸部，松松打结，确保不影响小鼠呼吸。该扎带将作为次级固定装置，以防任何肢体固定松脱。
  10. 抬起小鼠尾巴，将其置于左脚下方，以确保在将手术台面推入冲击管时尾巴不会被夹伤（图 1.18）。

4. LLB 操作步骤

  1. 打开激波管的动物暴露区域，将小鼠朝向入射激波方向放置（图1.19）。
  2. 将担架固定/悬挂在动物暴露区域内（图1.20）。
  3. 严密关闭动物暴露区域的门，确保麻醉气管未被门夹住（图1.21）。
  4. 将麻醉气体浓度降低至2.5–3%异氟烷，流速1 L/min，并在后续实验过程中维持该参数。
  5. 根据需要启动系统电源（图1.22）。
  6. 找到并连接压缩氦气的供气管路（图1.23, 1.24）。
  7. 离开激波室，进入相邻房间的操作控制台，确保激波室内无人员或动物滞留。
    注意：根据机构规定或操作条件，可能需要佩戴听力保护装置。此类情况包括控制台与激波管位于同一开放空间内的装置布局。
  8. 从控制台启动数据采集软件以记录激波事件（见图1.25中的绿色框）。
    注意：在本实验中，我们以20千赫兹（kHz）的采样率采集传感器数据，并使用LabView软件进行后续处理。建议传感器采样率不低于10 kHz，以获得高质量的压力-时间曲线。
  9. 解除所有安全锁（例如电源控制钥匙，如图1.26中绿色箭头所示）。
  10. 关闭两个气体排放口，对卷筒进行被动加压（图1.27）。请勿使用驱动侧。持续充气，直至隔膜在目标峰值psi压力下自行破裂，该压力由所用隔膜片数决定。
  11. 记录动物位置处的峰值压力、正压相持续时间和冲量（图1.28）。关闭充气装置。
  12. 返回激波管，断开氦气供气管，关闭激波控制电路的电源（图1.29）。
  13. 若需对同一只动物进行多次低强度激波（LLB）暴露，需打开卷筒，取出隔膜堆，然后卷起并插入另一组隔膜堆（图1.30, 1.31, 1.32）。展平隔膜堆后重新闭合装置。
    注意：为模拟特种作战部队（SOF）训练中经验定义的低强度激波暴露临床场景，我们每天对小鼠进行5–6次LLB暴露，每日累计暴露压力保守控制在约20 psi45以内。侧重于机制研究和剂量-效应关系的研究可选择每次暴露使用固定次数的LLB，并设定明确的超压参数。
  14. 完成当前动物的最后一次LLB暴露后，将其从激波管中取出，保持麻醉状态（图1.33）。
  15. 在动物仍处于麻醉状态下解开束缚，将其从麻醉鼻罩中取出，并仰卧放置于加热水垫上（图1.34）。
  16. 将动物放置于水垫后，启动计时器，记录小鼠自行翻转至腹侧（即腹部朝下）所需的时间（图1.35）。将该时间记录为翻正时间。待小鼠恢复后，将其放回饲养笼，并根据需要继续监测。

5. 多日实验步骤

  1. 为了模拟特种作战部队（SOF）近距离战斗训练中使用爆破装药所产生的常规低强度冲击波（LLB）暴露，在小鼠身上进行每周5天（周一至周五）、持续3个标准工作周共15天的重复性每日暴露实验。

6. 改变峰值LLB压力

  1. 通过使用强度更高的膜材料或简单地叠加额外的膜来提高峰值压力。例如，使用 Mylar Roll Clear 0.005 (500 G) 膜可产生约 20 psi 的峰值压力（当同时用作驱动膜和卷绕膜时），或使用 Mylar Roll Clear 0.002 (200 G) 膜可产生约 10 psi 的峰值压力。
  2. 调整正压相持续时间和冲击波冲量参数以满足实验需求。为调节正压相持续时间和冲量，可在条件允许时通过更换压缩气体源47,49或改变驱动段长度，经实验确定目标条件。上述方案使用氦气以产生尖锐的峰值压力和类似于理想化 Friedlander 曲线的压力波形。

7. 组织采集

注意：组织采集步骤可根据实验需求进行调整。

  1. 通过腹腔注射戊巴比妥（210 mg/kg）对小鼠进行麻醉。
  2. 将小鼠放入带有栅栏的鼠笼或预制的网状容器中，并将装有小鼠的笼子置于通风橱内。
  3. 待小鼠失去反应后，将其仰卧放置在笼子顶部的栅栏上，并将其口部闭合在其中一根栅栏周围，以帮助其在灌注过程中保持固定。
  4. 抓住腹部皮肤并向上提起，使用一把较大的剪刀在腹腔上剪开一个开口，注意不要损伤任何器官。继续沿肋骨基部向下剪开，以便更自由地展开胸廓。
  5. 使用止血钳从侧面接近小鼠，夹住胸廓正上方的组织，并向后旋转止血钳，使胸廓底部处于易于操作的角度。使用镊子或类似工具固定止血钳位置。
  6. 使用小型手术剪刀小心剪开膈肌，以暴露心脏。用镊子轻轻调整心脏角度，使其底部正对胸廓开口方向。操作应迅速，以确保灌注时心脏仍在跳动。
  7. 若需采集血液，用镊子夹住心脏，并使用带有0.5" 25 G针头的3 mL注射器小心穿刺右心室。从心室底部进针，沿长轴方向刺入，注意避免穿透心室对侧壁。轻缓抽吸注射器，直至采集到0.5–1.0 mL血液或血流停止，随后拔出注射器。
  8. 使用手术剪刀在右心房剪开一个小切口，以便血液和灌注液排出。用镊子固定心脏，小心将25 G蝶形针插入左心室，从底部进针。用固定夹或手固定蝶形针位置。
  9. 对动物进行灌注。
    1. 将装有50 mL磷酸盐缓冲液（PBS）的注射器连接至蝶形针，以约10 mL/min的速度进行灌注。观察肝脏是否变白，作为灌注成功的标志。注射器排空后，将其从蝶形针上断开。
    2. 若为显微镜检查准备组织，将空的PBS注射器替换为装有50 mL 10%中性缓冲福尔马林（NBF）或4%甲醛溶液的注射器。重复上述步骤进行福尔马林灌注。
      注意：灌注过程中应观察到小鼠出现抽搐；操作完成后应出现全身强直或僵硬。
  10. 从心脏移除蝶形针，并将小鼠从笼子栅栏上取下，准备组织采集。
  11. 根据需要取出并进一步解剖目标器官；采集新鲜未固定材料时，注意在冰上操作。
  12. 将采集的未固定组织在液氮中速冻，并于-80 °C保存，直至用于检测蛋白质或RNA靶标的实验方案。
  13. 对于已固定的组织，将其转移至标记好的50 mL锥形管中，管内装有福尔马林（每个器官使用一个独立的管子）。

结果

在研究小鼠暴露于爆炸冲击力后的实验结果时，通过压力随时间变化的分析来记录和表征该事件，对于评估实验的成功至关重要。该方法通过测量爆炸过程中压力的动态变化，帮助研究人员理解爆炸对生物系统的影响。

在成功的实验中，压力记录呈现出明确且受控的波形模式。压力迅速上升，并在预期时间内达到峰值（图2）。随后的压力下降遵循可预测的曲线，以Friedlander波形为例，表明能量得到了有效耗散。在损伤评估方面，即使在15-20分钟内进行多达六次的重复性低强度冲击波（LLB）暴露，LLB实验中也未出现明显的损伤迹象（图3）。然而，对重复性LLB暴露后翻正时间的分析表明，接受冲击的实验小鼠恢复意识的速度快于假暴露小鼠（图4）。因此，重复性LLB暴露会导致暴露后急性神经行为觉醒反应出现可重复的变化。

不理想的实验可能会表现出不规则的压力曲线。当峰值压力意外降低时，可能表明气体过早或缓慢释放，导致驱动段激波管内气体膨胀无法迅速向下游传播，并在目标区域作用于动物。气体压力的过早损失通常是由于驱动段或轴套部分密封不当所致，这可能源于膜片缺陷或驱动段-轴套-激波管组件紧固不充分。在此类情况下，生物样本可能表现出较轻的创伤迹象。

数据分析涉及将压力-时间曲线与观察到的生物学反应相关联。成功的实验表明，所选择的爆炸参数（如峰值压力和持续时间）能够引发预期或已确立的、正在研究中的生物学反应。特定压力特征与生物学结果之间的相关性有助于建立因果关系。由于在最后一次低强度冲击波（LLB）暴露后长达6个月的时间点均未观察到动物丢失，本方案支持开展纵向研究（图5）。

暴露于低水平爆炸波（LLB）后的临床表现范围较为隐匿且尚不明确。历史上，重复暴露于低水平爆炸波被认为对人和小鼠均未造成明显损伤，这一观点得到了支持：在2-5 psi的暴露后，个体能够迅速恢复正常行走、行为及体力活动。然而，缺乏显著的急性神经感觉症状或行为改变，并不能排除存在负面隐匿性效应的可能性。由于与低水平爆炸波相关的表型表现至多较为轻微，其全部效应范围仍处于积极研究之中，可能需要较长时间或反复暴露才能诱发具有临床意义的结果。

冲击管实验流程；示意图显示动物准备、设备设置和操作步骤。
图1：重复性小鼠低强度冲击伤（LLB）冲击管模型的操作步骤。 在完成冲击管的准备（步骤1-10）和动物准备（步骤11-18）后，将小鼠暴露于一次或多次低强度冲击波（LLB）中（步骤19-32），随后将其从管中取出（步骤33）。然后将小鼠仰卧置于预热的加热垫上（步骤34）。记录动物翻转至腹侧所需的时间，作为翻正时间（步骤35）。缩写：LLB = 低强度冲击。 请点击此处查看该图的放大版本。

psi与层数的关系图，瞬态衰减曲线；使用1-4层的分析，显示psi的变化。
图2：接近4 psi时的代表性压力-时间曲线。（A）叠加的铝箔片在2–4.5 psi峰值范围内提供线性峰值压力。代表性压力随时间（毫秒）变化曲线（红色）为3–6次激波管爆炸实验的平均结果，与理想化的Friedlander曲线（蓝色）对比，分别对应（B）1层、（C）2层、（D）3层和（E）4层的情况。请点击此处查看该图的高清版本。

散点图分析每次实验的暴露时间；按暴露次数进行数据聚类。
图3：受试间间隔。 单次冲击波的设置与执行平均需要 9.8 ± 1.9 分钟（均值 ± 均值标准误（sem））。每次额外的冲击暴露需增加 1.7 ± 0.4 分钟（均值 ± sem）。每个圆点代表单个动物的实验结果。请点击此处查看该图的放大版本。

标准化翻正时间与研究天数的关系图；展示了爆炸效应及交互作用。
图4：连续3周高强度LLB暴露期间的每日翻正时间。 该图表示在3周低强度冲击波（LLB）暴露期间经假手术组归一化后的翻正时间。LLB小鼠每日接受6次冲击暴露，持续15天，共进行90次LLB暴露。平均超压特征为（± sem）峰值3.05 ± 0.07 psi，正相持续时间0.94 ± 0.04 ms，冲击量2 ± 0.1 psi * ms。 p-值反映双向ANOVA分析结果。缩写：LLB = 低强度爆炸。 请点击此处以查看此图的放大版本。

生存概率图，假手术组与LLB组在200天内的Kaplan-Meier曲线。
图5：实验室冲击管LLB模型对动物在多次重复LLB暴露后损耗的影响。 假手术组（N = 24）和LLB组小鼠（N = 32）从首次LLB暴露（第1天）至全部研究暴露阶段（结束于第19天）以及6个月恢复期后（第199天）的损耗率。在观察期间，假手术组与LLB组之间的损耗率无显著差异。LLB小鼠平均接受了62次暴露，平均峰值压力为4.78 ± 0.01 psi，冲量为3.16 ± 0.023 psi∙ms。暴露每周进行5天（即周一至周五），持续3个连续周，以模拟近期报道的特种作战部队（SOF）在常规破障训练中的超压暴露45。缩写：LLB = 低强度爆炸；SOF = 特种作战部队。 请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

如果我们对某种损伤的理解不够充分，就无法对其进行有效的治疗，而目前我们对高度重复的低强度爆炸暴露（LLB）相关的损伤机制仍缺乏充分理解。许多特种作战部队（SOF）人员报告称，在执行作战任务后的五到十年内，出现了被认为与高度重复的LLB暴露相关的健康损害50,51。部分SOF人员在经历LLB暴露后会立即出现类似急性创伤性脑损伤（TBI）的神经认知效应39。此外，临床医生报告指出，由爆炸暴露引发的症状往往对传统治疗方法不敏感，这可能导致SOF人员和临床医生寻求替代疗法52,53。尽管SOF人员频繁暴露于LLB及超压机制中45，且相关症状表现出较高的严重性和治疗抵抗性，并存在已记录的与爆炸相关的星形胶质细胞瘢痕形成模式51，但其长期健康后果仍相对未知。临床医生和军队领导层依赖建模研究来揭示损伤机制和病理生理过程。这些模型对于制定政策和策略，以早期识别、阻断、预防和治疗病理过程至关重要。

至关重要的是，对常见军事低强度爆炸暴露（LLB）进行小鼠建模，有望为健康预测模型提供依据。临床实践需要能够识别哪些个体面临更高的爆炸相关病理风险、哪些爆炸特性会引发最严重后果，以及根据暴露的慢性程度、剂量或特异性，疾病进程可能如何演变的LLB预测模型。因此，建立重复性LLB暴露模型对于提出假设和预测暴露将如何影响特种作战部队（SOF）及其他服役人员的健康结局至关重要。预测模型和损伤机制模型将有助于诊断与治疗，并为基于症状和暴露情况的返岗决策提供依据。

近年来，小鼠爆震性创伤性脑损伤（bTBI）的研究取得了显著进展，特别是已开发出能够预测人类慢性重复性轻度bTBI后果的模型54,55。尽管利用激波管研究中高强度爆震暴露已有充分发展，并在PubMed数据库中收录了数百篇相关文章46,56,57,58，但针对接近常规军事训练超压（<6 psi峰值压力40）的低强度爆震（LLB）研究中，激波管的应用尚不成熟；近期PubMed检索显示，此类研究文献不足十篇19,20,22,23,26,27,28。为了推动这一尚未充分研究领域的进展，本文所介绍的模型重点关注在小鼠中实现稳定LLB超压的关键因素、爆震后恢复及监测方法，同时指出了该模型相较于开放场地炸药实验的若干显著优势。我们提出，所述实验室LLB模型有望促进建立用于预测慢性重复性LLB后临床结局的模型。

与野外爆炸冲击模型相比，实验室低强度冲击波（LLB）模型在动物福利方面具有显著优势。野外模型可能导致3-8%的死亡率25,36，而本实验室LLB模型则未观察到动物死亡。这一差异至关重要，尤其是在模拟军事训练中常见的高累积暴露情况时，现实中几乎不存在因LLB暴露导致受训人员死亡的情况。由于该模型未出现明显的呼吸暂停或致死性肺损伤等死亡原因，因而保证了其实验结果的可靠性与一致性，使其成为研究重复性LLB临床相关效应的首选模型。

本方案专用于一种具有三段式结构的"开放式"激波管，该结构包括驱动段、过渡段（spool）和被驱动段。通过适当修改本方案，其他类型的激波管也可能实现高度重复的低强度爆炸（LLB）实验。开放式激波管设计常用于研究爆炸引起的神经损伤46,47,48。这种激波管具有开放的出口端，使产生的激波能够自由地沿管长方向传播，在到达管体另一端之前作用于目标（例如实验动物）。该设计有助于重现和研究相对纯净的一次性爆炸超压，其特性近似于开阔场地中真实爆炸所产生的超压波形48。因此，可通过将实测的爆炸超压波形与理想化的弗里德兰德（Friedlander）波形进行比较，评估激波管产生特定超压事件的保真度。为了模拟低强度爆炸（LLB）暴露，我们采用了一种此前已描述过的48、定制构建的开放式激波管，该装置最初设计用于模拟在约25英尺 standoff 距离下引爆200磅以上三硝基甲苯（TNT）所产生的效应。为实现高幅值超压，将气体加压至驱动段内，该段通过隔膜与过渡段隔离，以密封驱动段内的气体。过渡段同样通过另一层隔膜与开放式段隔离。这第二层隔膜允许对过渡段独立加压。双腔系统使得驱动段内的气体可被加压至超过隔膜正常破裂压力的水平。这是因为加压的过渡段作为缓冲层，支撑着驱动段与过渡段之间的隔膜，从而防止其提前破裂。当激波管操作者需要在目标位置产生特定压力的激波时，电子阀门会释放过渡段内的气体，使过渡段压力迅速下降，从而导致驱动段中处于过压状态的气体冲破驱动段和过渡段的隔膜，并快速沿管长方向膨胀，最终作用于目标区域中的动物。实现此类高性能激波管中低强度爆炸（LLB）研究的关键改进在于：我们封闭了驱动段，仅使用过渡段并结合低阈值隔膜进行实验。

为确保LLB实验的可靠性和可重复性，在实验设置过程中必须采取某些措施。牢固固定手腕和脚踝处的四肢至关重要，这可以最大限度地减少身体运动和爆炸暴露的变异性，并防止可能干扰实验结果的意外损伤。此外，将手腕和脚踝向内旋转有助于引导肢体运动朝向动物身体中线，从而降低可能影响后续运动功能评估的远端损伤风险。保持头部和脊柱曲度的伸直是确保各受试对象爆炸暴露均匀的另一关键因素，因为这有助于减少关节活动范围的潜在差异。对于持续多日或数周的实验方案，建议增加异氟烷麻醉剂的使用浓度。这一调整有助于在整个延长的实验过程中维持稳定的麻醉深度。根据我们的经验，将异氟烷浓度增加0.5%足以维持充分的麻醉状态。

然而，并非所有爆炸管设计都适用于通过鼻罩输送麻醉气体，特别是对于那些具有全封闭结构、不允许将导管插入驱动段的设计。在这种情况下，使用注射类麻醉剂可能是更合适的选择。我们建议先确定实施连续多次爆炸所需的时间，然后给予足量的麻醉剂以在整个实验过程中维持动物的无意识状态。在开发这种改进方法的过程中，可能需要增加额外的动物福利监测措施，以确保麻醉效果的持续稳定。此外，使用注射类麻醉剂可能会使急性期后的反应监测（例如记录翻正时间）无法进行。

动物实验中的伦理考量至关重要，本基于实验室的低强度冲击波（LLB）模型包含了全面的爆炸后恢复与监测方案。爆炸暴露后的仁道终点包括呼吸困难、无法自行翻身、经过2小时观察期后仍不能行走、类似癫痫的运动、动作笨拙、视力受损，以及内出血或四肢骨折的迹象，这些均需密切观察。值得注意的是，在我们的实验中，接受LLB冲击的小鼠未出现上述任何情况。然而，在高强度冲击波（HLB）实验中可能发生肢体骨折，通常由操作失误引起。为降低此类风险，应在将动物固定于担架时将其手足向身体中线旋转。该技术可防止冲击气流将四肢向后扫动而导致骨骼断裂。

这种重复性低强度冲击波（LLB）模型的优势不仅体现在伦理层面，还涵盖实践与方法学方面的优点。其基于实验室的设计免除了处理炸药的需求，从而提高了安全性和可及性。该模型具有高度可重复性和可定制性，研究人员可通过使用不同类型的气体、设备设置以及隔膜强度来调控暴露参数。本研究中选用氦气，因其能够模拟开阔场地爆炸的动力学特征49，可提供可靠的基线数据47,59,60。通过经验性调整保留隔膜的厚度或强度，可实现对峰值压力的调节，从而针对特定实验需求进行精细优化。最后，LLB模型消除了季节或天气变化对数据、动物暴露及其他实验因素的影响。这种一致性确保了结果的稳健性和可靠性，使该重复性LLB模型成为纵向及高重复性冲击研究中不可或缺的工具。

理解爆炸相关的神经创伤需要阐明损伤机制、爆炸强度的度量标准以及阈值。然而，目前对于人体在爆炸情境下脑损伤的机制仍存在不确定性。以往提出的爆炸暴露后人体损伤标准主要依赖于动物研究，但由于跨物种间缺乏完整的缩放准则，将这些研究结果直接应用于人类仍具挑战性61。基于动物体重的肺损伤缩放是一个例外，因为已有公认的准则可供参考62,63。然而，基于体重64,65或脑质量66提出的脑效应缩放规律，忽略了已知和未知的解剖学差异，尤其是与脑内部及周围保护结构相关的差异。质量缩放预测体型较小的物种具有更高的损伤风险，但这一预测已被鸟类67,68,69和人类70的研究结果所反驳。因此，建立准确的缩放规律需要通过实证手段，明确不同物种中外部爆炸事件强度与脑内效应之间的关系。对于低强度爆炸（LLBs），无论是在动物模型还是人类中，关于单次或慢性暴露的影响均知之甚少。因此，本方法可能推动在低强度爆炸范围内开展必要的实证研究，以促进未来缩放规律的建立。

总之，这种基于实验室的激波管模型代表了研究小鼠长期低强度爆炸暴露慢性效应的重要进展。通过引入可产生稳定超压的建模方法，重视爆炸后的恢复与监测，并突出其相较于其他模型的显著优势，这种基于实验室的低强度爆炸模型可能为深入理解与长期低强度爆炸暴露相关损伤提供一种可靠且符合伦理的研究选择。

披露

作者无财务利益需要披露。

致谢

JSM 获得了美国退伍军人事务部（VA）生物医学实验室研究办公室的资助 & 发展（JSM，I01BX004896）以及美国退伍军人事务部西北部精神疾病研究、教育与临床中心（VA Northwest Mental Illness Research Education and Clinical Center），后者是美国国会授权成立的退伍军人事务部机构，致力于研究爆炸所致脑损伤及其共病创伤后应激障碍。JSM报告获得2022财年创伤性脑损伤与心理健康发展研究计划转化研究奖（FY22 Traimed Brain Injury and Psychological Health Research Program Translational Research Award，编号W81XWH-22-TBIPHRPTRA，奖项编号HT94252310755）的非关联资助。作者感谢Andrew Shutes-David提供的编辑协助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Adroit 热循环热泵（120 V）Parkland ScientificHTP-1500
复印纸，75 g/m2 重量Staples897804
一次性吸水蓝色垫片VWR82020-845
Forane 吸入用溶液MedLine10019-360-60
氦气LindeUN1046
实验室胶带（1"）VWR89098-076
LabView 软件EmersonV 2011
医用氧气Central Welding SupplyUN1072
Mylar，厚度 0.005Tapp Plastics22934
塑料保鲜膜Santa Cruz Biotechnologysc-3687
塑料扎带 VWR11215-940
气动冲击管（含驱动段和线轴段；目标区域尺寸适用于小鼠，配备采样频率为 20 kHz 的压力传感器，以及控制与数据采集软件）BakerRisk, San Antonio, TX定制
可重复使用重型加热垫（12" × 18"）Parkland Scientific121218
剪刀式啮齿类动物耳标打孔器Kent ScientificINS750076-2
适用于传统蒸发器的滑动顶盖室Kent ScientificVetFlo-0530SM
VetFlo 异氟烷蒸发器Kent ScientificVetFlo-1210S

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