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方法文章

通过包封无细胞表达系统重构细菌谷氨酸受体通道

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DOI：

10.3791/66595

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2024年3月8日

 ,  , 
1Neuroscience Program, University of Michigan, Ann Arbor, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 5Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了使用倒置乳液法将无细胞表达（CFE）系统包裹于巨型单层囊泡（GUV）内，以研究模型膜蛋白在脂双层中的合成与整合。

摘要

无细胞表达（CFE）系统是合成生物学中的强大工具，可实现合成细胞中生物传感和能量再生等细胞功能的仿生模拟。然而，要重建多种细胞过程，需要成功将膜蛋白重构到合成细胞的膜中。尽管可溶性蛋白在常见的CFE系统中通常能够成功表达，但将膜蛋白重构到合成细胞的脂双层中仍具挑战性。本文展示了一种基于在合成细胞内封装并孵育CFE反应的方法，用于在作为模型合成细胞的巨型单层囊泡（GUVs）中重构模型膜蛋白——细菌谷氨酸受体（GluR0）。利用该平台，本文展示了将GluR0的N端信号肽替换为蛋白视紫红质信号肽后，对GluR0在杂合GUVs膜中成功实现共翻译转运的影响。该方法提供了一种可靠的流程，有望实现多种膜蛋白在合成细胞中的无细胞重构。

引言

自下而上的合成生物学在过去的十年中受到越来越多的关注，作为一个新兴领域，其在生物工程、药物递送和再生医学中具有广泛的应用前景1,2合成细胞作为自下而上合成生物学的基石，其发展尤其受到广泛科学界的关注，原因在于合成细胞具有广阔的应用前景，以及类似天然细胞的物理和生化特性，这些特性有助于 体外 生物物理研究3,4,5,6合成细胞通常在细胞大小的巨型单层囊泡（GUVs）中构建，用以重现不同的生物学过程。细胞骨架的重建7,8光依赖性能量再生9细胞通讯10,11，以及生物传感12 是人工细胞中重建类细胞行为的若干尝试实例。

尽管某些细胞过程依赖可溶性蛋白，但天然细胞的许多特性（如感知和通讯）通常利用膜蛋白，包括离子通道、受体和转运蛋白。合成细胞发展中的一个主要挑战是膜蛋白的重建。虽然传统上在脂双层中重建膜蛋白的方法依赖于去污剂介导的纯化，但这些方法费时费力，对于对表达宿主有毒性的蛋白效果不佳，且通常不适用于在GUVs中重建膜蛋白13。

一种替代的蛋白质表达方法是无细胞表达（cell-free expression, CFE）系统。CFE系统在合成生物学中已成为一种强大工具，可实现 体外 使用细胞裂解物或纯化的转录-翻译系统表达多种蛋白质14. CFE系统也可被封装在GUVs中，从而实现区室化的蛋白质合成反应，这些反应可被编程用于多种应用，例如构建具有光捕获功能的合成细胞9 或机械敏感型生物传感器15,16与重组蛋白表达方法类似，膜蛋白在无细胞表达系统中的表达在技术上具有挑战性17聚集、错误折叠以及无细胞表达系统（CFE系统）中翻译后修饰的缺失是阻碍利用CFE系统成功合成膜蛋白的主要瓶颈。使用CFE系统进行自下而上膜蛋白重构的困难，部分原因在于缺乏依赖信号肽、信号识别颗粒、转运体及分子伴侣的复杂膜蛋白生物合成途径。然而，近年来多项研究表明，在翻译过程中存在微粒体或脂质体等膜结构可促进膜蛋白的成功表达。18,19,20,21此外，Eaglesfield 等人和 Steinküher 等人发现，在膜蛋白的N端引入特定的疏水结构域（即信号肽）可显著提高其表达水平22,23综上所述，这些研究表明，如果蛋白质翻译过程在GUV膜存在的情况下进行，并且使用了适当的N端信号肽，则可以克服膜蛋白在合成细胞中重组的难题。

本文介绍了一种利用重组元件蛋白合成（PURE）无细胞表达系统（CFE）在巨大脂质体（GUVs）中重构膜蛋白的封装方案。选择细菌谷氨酸受体24（GluR0）作为模型膜蛋白，研究其N端信号肽对其膜重构的影响。通过构建一种突变型GluR0（记为PRSP-GluR0），研究了蛋白视紫红质信号肽（proteorhodopsin signal peptide）的作用——该信号肽此前已被Eaglesfield等人22证明可提高膜蛋白的重构效率，并将其表达情况及膜定位与携带天然信号肽的野生型GluR0（后文简称WT-GluR0）进行比较。本方案基于倒置乳液法25，并进行了若干改进，使其更适用于CFE系统的封装。在该方法中，首先将CFE反应体系与油相脂质溶液进行乳化，形成含有CFE系统的微米级液滴，并由单层脂质膜稳定。随后将乳化液滴铺展于另一层富含脂质单层的油-水界面之上。通过离心力驱动乳化液滴穿过油-水界面。在此过程中，液滴获得第二层脂质单层，从而形成双层脂质囊泡。含有CFE反应体系的GUVs随后被孵育，在此期间膜蛋白得以表达并整合入GUV的膜结构中。尽管本方案具体针对GluR0的无细胞表达，但也可用于其他膜蛋白的无细胞合成，或应用于不同的合成细胞研究，如细胞骨架重构或膜融合研究26。

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方案

本研究所用的试剂和设备见材料表。

1. 小型单层囊泡（SUVs）存在下的体相CFE反应

  1. SUV 制备
    注意：此步骤必须在通风橱中进行，并遵循氯仿操作的安全说明。
    1. 在玻璃小瓶中制备 5 mM 1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC）SUV，方法是转移 76 µL 溶于氯仿的 25 mg/mL POPC 储备液。
    2. 轻轻旋转玻璃小瓶的同时，向瓶内通入温和的氩气流，使脂质在瓶底形成干燥薄膜。随后将玻璃小瓶放入干燥器中，瓶盖轻轻旋紧以允许过量氯仿蒸发。
    3. 将玻璃小瓶在干燥器中放置 1 小时。然后加入 0.5 mL 超纯去离子水以溶解脂质膜，并涡旋约 2 分钟。
    4. 通过将两个滤膜支撑片浸泡在去离子水中，并将其放置在内部膜支撑结构的两侧，组装小型挤出装置。接着将一片 100 nm 聚碳酸酯滤膜浸泡后置于两个内部膜支撑结构之间，并用挤出器外壳和固定螺母夹紧。将此装置放入挤出器支架中。
    5. 用超纯去离子水冲洗两支 1 mL 气密注射器各 3 次。
    6. 将脂质-水混合样品装入其中一支 1 mL 气密注射器中，并使用摆臂夹具将其固定在微型挤出器的一端。将第二支注射器插入挤出器的另一端，并确保其完全压下。
      注意：在将脂质-水混合物装入注射器时，确保在通过微型挤出器前注射器内无空气残留。
    7. 通过微型挤出装置将脂质-水混合物从初始注射器缓慢推入空注射器中。重复此步骤 11 次以形成 SUV。将所得 SUV 转移至 1.5 mL 微量离心管中。
      注意：SUV 溶液可在 4 °C 下保存最多 2 周。
  2. 无细胞表达（CFE）反应体系组装
    1. 按照制造商提供的无细胞表达方案进行 CFE 反应体系的组装，具体细节略有修改，如下所述。
    2. 混合以下组分：10 µL 溶液 1（含氨基酸、NTPs、tRNAs、酶底物及必要缓冲液），1 µL 溶液 2（含蛋白质，溶于 20% 甘油），2 µL 溶液 3（核糖体（20 µM）），适量编码可溶性 sfGFP-sfCherry(1-10)27 （后文简称可溶性 sfGFP）、WT-GluR0-sfGFP 或 PRSP-GluR0-sfGFP 的 DNA（每 1000 个碱基对 10–60 ng），1 µL 小鼠 RNase 抑制剂，以及 4 µL 5 mM SUV 溶液（用于膜蛋白）或 4 µL 水（用于可溶性蛋白）。
    3. 加入超纯去离子水将反应体系终体积调至 20 µL。
      注意：在组装 CFE 体系时，所有组分必须保持在冰上。所有材料对温度敏感，若升至室温可能发生降解。
  3. CFE 反应孵育与监测
    1. 将 CFE 溶液转移至 96 孔圆锥形 V 底板中。为防止反应过程中液体蒸发，使用密封膜覆盖板孔。
    2. 将板置于酶标仪中，在 37 °C 下孵育 4–5 小时，同时每 2 分钟监测一次 GFP 信号，激发/发射波长设为 488 nm/528 nm，增益设为 100。

2. GUVs 中封装的 CFE 反应

  1. 制备 GUV 外层缓冲液
    1. 在 1.5 mL 微量离心管中，加入 1.5 µL 的 1 M 精胺，37.5 µL 的 100 mM ATP，25 µL 的 100 mM GTP，12.5 µL 的 100 mM CTP，12.5 µL 的 100 mM UTP，25 µL 的 1 M 磷酸肌酸，18 µL 的 1 M 醋酸镁，93.33 µL 的 3 M 谷氨酸钾，50 µL 的 1 M HEPES KOH（pH 7.4），1.15 µL 的 332 mM 亚叶酸，100 µL 的 2 M 葡萄糖，以及 50 µL 的 20 种氨基酸混合物储备液（每种氨基酸浓度为 6 mM，按 Sun 等人28描述的方案配制）。
    2. 用超纯去离子水将溶液终体积补至 1 mL。
      注意：所有组分必须保持在冰上。最后加入氨基酸混合物，以避免氨基酸降解28。该溶液可分装为 330 µL 每份，于 -20 °C 保存至使用。
  2. 制备油相脂质混合物
    注意：此步骤需在通风橱中进行，并遵循氯仿操作的安全说明。
    1. 在通风橱中，将 17.3 µL 的 25 mg/mL POPC 储备液与 1.08 µL 的 50 mg/mL 聚丁二烯-嵌段-聚环氧乙烷（PEO-b-PBD）共聚物在 15 mL 玻璃小瓶中混合。
      注意：最终油相脂质溶液中脂质浓度为 0.5 mM，其中 POPC 和 PEO-b-PBD 分别占 95% 和 5%。PEO-b-PBD 用于增强蛋白表达过程中的膜稳定性，但保持较低摩尔比以减少共聚物自聚集形成独立于脂质分子的胶束倾向29,30。
    2. 在轻轻旋转玻璃小瓶的同时，小心通入氩气流以蒸发氯仿。
    3. 用移液器向含有干燥脂质的 15 mL 玻璃小瓶中加入 1.2 mL 轻质矿物油。
    4. 以最大速度涡旋振荡 10–20 秒，使脂质与油充分混合。溶解后的脂质-共聚物混合物呈浑浊状。
    5. 为确保油中所有可能存在的脂质聚集体完全溶解并均匀分散，将玻璃小瓶置于约 50 °C 的烘箱中加热 20 分钟，随后再次以最大速度涡旋振荡 10–20 秒。
  3. CFE 反应体系组装与包封（图 1 总结了以下步骤）。
    1. 在 1.5 mL 微量离心管中，将 270 µL 第 2.1 步制备的 CFE 外层缓冲液、15 µL 的 5 M NaCl 和 15 µL 的 4.5 M KCl 混合，配制成 300 µL 的 GUV 外层溶液。
      注意：在此步骤中，向 GUV 外层溶液中加入 0.45 µL 的 1 M 1,4-二硫苏糖醇（DTT）。添加 NaCl 和 KCl 的目的是调节外层溶液的渗透压，使其与内层 CFE 溶液相匹配。NaCl 和 KCl 的具体添加量取决于所需的渗透压调整值。可根据需要单独或联合使用 NaCl 或 KCl 进行调节。
    2. 将 300 µL 脂质-油混合物轻轻移加至 GUV 外层溶液上方。
      注意：添加脂质-油混合物时，应避免油相与水相外层溶液混合。加样后，脂质-油混合物与 GUV 外层溶液之间应形成清晰可见的界面。
    3. 将油-水界面在室温下孵育 2 小时，使脂质单层在界面处形成并稳定。
    4. 同时，按照第 1.2.1 节组装含有编码膜蛋白变体或可溶性 GFP 的质粒 DNA 的 CFE 反应体系。用 4 µL 的 1 M 蔗糖替代 4 µL 的 5 mM SUV 溶液或水。该反应液将作为 GUV 内层溶液。
      注意：使用渗透压计测量内外溶液的渗透压，并据此通过添加 NaCl 或水调节外层溶液的渗透压。CFE 反应体系的渗透压通常约为 1600 mOsm/Kg。向反应体系中添加蔗糖可提高内层溶液密度，从而使囊泡在离心步骤中能够穿过油-水界面。可替代蔗糖的试剂为 Opti-Prep 密度梯度溶液。
    5. 向含有 CFE 反应体系的微量离心管中加入 600 µL 脂质-油混合物，并剧烈吹打约 1 分钟，使反应体系在脂质-油溶液中乳化，并在合成细胞周围形成脂质单层。
      注意：最终溶液不应含有气泡，且呈不透明状。
    6. 将内层溶液乳化液轻轻移加至 1.5 mL 微量离心管中已建立油-水界面的油层上方。
      注意：操作时应避免扰动或破坏界面。
    7. 在 4 °C 条件下，以 2,000 x g 离心 10 分钟。
      注意：该离心速度已针对本方案优化。Adir 等人31报道了不同的离心速度。
    8. 离心结束后，使用移液器小心移除微量离心管中多余的油相和外层溶液，直至剩余体积约为 100 µL。
      注意：GUV 沉淀通常可见于微量离心管底部。然而，无可见沉淀并不一定意味着无 GUV 生成。除使用移液器外，也可通过抽吸方式去除外层溶液上方的过量油相。关键是要确保完全去除脂质-油溶液，GUV 溶液中的油污染会导致图像质量下降。
    9. 通过轻柔吹打，将 GUV 沉淀重悬于剩余的 100 µL 溶液中。随后将 GUV 溶液转移至洁净的 96 孔透明平底板中进行孵育。

3. 包封的 CFE 反应孵育与成像

  1. 使用封板膜覆盖培养板，防止蒸发。将培养板在 37 °C 下孵育 5–6 小时。可使用酶标仪，并按照步骤 1.3.2 的说明为孵育步骤准备酶标仪。
  2. 孵育结束后，将 96 孔板置于倒置显微镜的成像台上，显微镜需配备 EMCCD 相机（或 sCMOS 相机）、DAQ-MX 控制的激光器（或集成激光合束系统）以及 CSU-X1 转盘共聚焦系统（或激光扫描共聚焦系统）。聚焦于含有 GUV 的任意 ROI 区域，并使用 Plan-Apochromat 60 x/1.4 NA 物镜，在 488 nm 激发波长下采集图像。
  3. 以 .tiff 格式保存 GUV 的图像。
  4. 在图像处理软件（例如 ImageJ 或 Fiji）中打开图像。打开亮度/对比度 设置面板，调节亮度和对比度至合适水平，使荧光蛋白清晰可见。
  5. 若目标是比较不同表达蛋白的信号强度，首先在图像 > 堆栈 子菜单下的图像合成为堆栈 面板中，将含有不同蛋白的 GUV 单张图像合并为图像堆栈。然后，使用亮度/对比度 面板统一调节所有图像的亮度和对比度。

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结果

在将CFE反应进行封装之前，两种携带天然及蛋白视紫红质信号肽的GluR0-sfGFP变体（信号肽序列见原文） 补充材料 表1），可溶性sfGFP在大量反应中分别表达，并通过酶标仪检测sfGFP信号以监测其表达情况（图 2A）。膜蛋白在无或有100 nm SUVs的条件下表达。此外，利用关联sfGFP信号与其浓度的标准曲线（补充图1），合成蛋白质的浓度被估算（补充表 2）。显然，可溶性sfGFP的表达量在所有三种蛋白中最高，这表明膜蛋白的表达对无细胞表达系统（CFE）造成了负担，从而减缓了反应速度并降低了产量。此外，平均而言，在含有小单层囊泡（SUVs）的条件下表达膜蛋白的反应，其sfGFP信号高于缺乏SUVs的反应。该观察结果与Steinküher等人的研究发现一致，即膜蛋白的表达会降低CFE系统合成蛋白质的能力。23然而，鉴于在体相 CFE 反应中已成功证明蛋白质的表达，可以推断包封的 CFE ...

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讨论

几乎所有依赖分子或信息跨细胞膜传递的细胞过程，例如细胞信号传导或细胞兴奋，都需要膜蛋白的参与。因此，膜蛋白的重建已成为实现各种合成细胞设计以满足不同应用需求的主要瓶颈。传统的去垢剂介导的膜蛋白在生物膜中的重建方法需要使用大单层囊泡（GUV）生成技术，例如温和溶胀法或电形成法。溶胀法通常产生尺寸较小的囊泡，而当包封复杂溶液时（这在构建合成细胞时常遇到），电形成法的产率会显著下降32。此外，去垢剂会使膜蛋白溶解，而在重建过程中去除去垢剂可能导致蛋白质错误折叠33,34。相比之下，本文所介绍的方法依赖于膜蛋白在翻译过程中的共翻译插入脂双层，这一过程更接近细胞内天然的蛋白质生物合成途径22。

从技术角度来看，与电形成法和连续液滴界面交叉封装法（cDICE）等其他常见的封装方法相比7,

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

APL 感谢美国国家科学基金会（EF1935265）、美国国立卫生研究院（R01-EB030031 和 R21-AR080363）以及美国陆军研究办公室（80523-BB）的支持

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 nm 聚碳酸酯滤膜STERLITECH1270193
96 孔透明底板ThermoFisher Scientific165305
BioTek Synergy H1M 杂交多模式读板仪Agilent11-120-533
磷酸肌酸Millipore Sigma10621714001
CSU-X1 共聚焦扫描单元YokogawaCSU-X1 
密度梯度介质（Optiprep）Millipore SigmaD1556可选在内层溶液中替换为蔗糖
滤膜支撑片Avanti610014
Fisherbrand 微量离心管（1.5 mL）Fisher Scientific05-408-129 
亚叶酸钙盐水合物Millipore SigmaF7878
葡萄糖Millipore Sigma158968
HEPESMillipore SigmaH3375
iXon X3 相机 AndorDU-897E-CS0 
L-谷氨酸钾盐一水合物Millipore SigmaG1501
轻质矿物油Millipore SigmaM5904
四水合乙酸镁 Millipore SigmaM5661
微型挤出器套件（含注射器架和挤出支架）Avanti610020
Olympus IX81 倒置显微镜 OlympusIX21
Olympus PlanApo N 60x 油镜物镜 Olympus1-U2B933 
PEO-b-PBDPolymer SourceP41745-BdEO
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP 质粒 DNA自制N/A
pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) 质粒 DNA自制N/A
pET28b-WT-GluR0-sfGFP 质粒 DNA自制N/A
氯仿中的 POPC 脂质 Avanti850457C
氯化钾Millipore SigmaP9541
PUREfrex 2.0Cosmo Bio USAGFK-PF201
核糖核苷酸溶液套装New England BioLabsN0450
鼠源 RNase 抑制剂New England BioLabsM0314S
RTS 氨基酸样品套装BiotechrabbitBR1401801
氯化钠Millipore SigmaS9888
亚精胺Millipore SigmaS2626
蔗糖Millipore SigmaS0389
VAPRO 5600 型蒸汽压渗透压仪ELITechGroupVAPRO 5600

参考文献

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