在BALB/c-nu小鼠中建立肝癌模型及三棱加参方治疗作用的研究

摘要

本文介绍了研究三棱加参方对原位移植性肝细胞癌BALB/c-nu小鼠治疗作用及血管抑制作用的逐步实验方案。

摘要

肝癌的高致死率以及对化学药物的耐药性，促使人们不得不寻找治疗肝癌的有效传统草药处方。可重复、易于操作且能高度模拟肝癌病理生理过程的动物模型，是成功筛选有效候选药物的前提。同时，可靠的药物疗效评价指标和方法也是抗肝癌药物研发的重要保障。

三棱加参方，一种含中药的代表性处方 Sparganium stoloniferum，Buch.-Ham.（三棱） Panax ginseng C. A. Mey.（人参）， Rheum officinale 巴氏（大黄），以及 川芎 川芎（Hort. (Chuanxiong)）被用于滋补肝脏、清热解毒、活血化瘀，以治疗肝癌。本实验方案描述了三棱加参冻干粉的制备方法以及在 BALB/c-nu 小鼠中建立原位肝癌模型的过程。组织病理学染色、癌标志物的免疫组化检测， 体内 对小鼠进行成像，并采用鸡胚尿囊膜试验探索三棱加参方对肝癌组织恶性增殖的抑制作用及抗血管生成效应。数据显示，三棱加参方能够有效抑制肝癌组织的恶性增殖，表现为肿瘤体积减小、病理损伤改善以及癌性标志物ki67水平降低。

对血管生成的更强抑制作用还表明，三棱加参方可能具有治疗和预防肝癌进展与恶化的作用。整个实验方案展示了中药成分在小鼠肝癌治疗中的综合性过程，为肝癌模型的建立与优化，以及防治肝癌药物的研发提供了参考。

引言

肝癌是一种起源于肝脏的致命性癌症，是全球癌症相关死亡的第二大原因¹。美国和一些发展中国家的肝病发病率处于较高水平，预计到2030年全球肝癌病例可能超过100万例²。由于吸烟、肥胖、饮酒等不健康的生活习惯，以及乙型肝炎、丙型肝炎和其他病毒的侵害，肝癌的发病率和死亡率逐年显著上升³。肝癌是一种具有不同组织学特征且预后较差的异质性恶性肿瘤，其发病类型广泛，包括肝细胞癌、肝内胆管癌和纤维板层型肝癌⁴。肝癌通常在晚期才被诊断，许多晚期患者不适合接受放射治疗⁵。多激酶抑制剂索拉非尼是晚期肝癌患者广泛接受的药物，但患者通常在短期内即产生明显耐药性⁶。目前，免疫检查点抑制剂PD-1和PD-L1与索拉非尼联合使用在控制肝癌进展方面取得了一定进展，但其治疗效果仍存在争议⁷。

原发性肝癌是一种早期肝癌：癌细胞尚未在肝组织周围扩散或发生器官间转移，肝功能未受到显著影响⁸。由于原发性肝癌通常不会出现明显的不适症状，部分患者可能仅有轻度肝区疼痛、乏力等症状⁹。在临床实践中，肝脏彩....

方案

选用吉林大学转化医学院动物实验中心饲养的SPF级雄性BALB/c-nu裸鼠，鼠龄5周，体重18–22 g；饲养条件为温度22 °C–24 °C、相对湿度40%–60%。实验动物使用许可证编号为SYXK(吉) 2018-0006，实验过程遵循吉林大学伦理委员会的相关规定，动物伦理审批编号为20221228-01。

1. 三棱加参方冻干粉的制备¹⁵

1. 取16 g三棱、16 g人参、8 g大黄和2 g川芎，置于智能煎药壶中（见材料表），加入294 mL去离子水，室温浸泡30 min。加热煮沸后，在100 °C条件下继续煎煮30 min，用双层医用纱布过滤药液（见材料表）。药渣中再加入252 mL去离子水，于100 °C煎煮30 min，用双层纱布过滤。
2. 将步骤1.1所得滤液收集于洁净的不锈钢容器中，在-80 °C条件下冷冻12 h（见材料表）。
3. 将步骤1.2所得三棱加参方样品置于真空冷冻干燥机中（见材料表）（冷阱温度：-55 °C），干燥48 h，得到三棱加参方的冻干粉。

2. 构建稳定表达荧光素酶的HCCLM3细胞系

结果

如图所示 图 2A，我们建立了 原位 建立BALB/c-nu小鼠肝癌模型，并评价三棱加参方的抗肿瘤作用。 图2B 表明三棱加参方能显著抑制肝肿瘤的生长。病理结果显示，与对照组相比，模型组肿瘤病灶与周围组织分界清晰，肿瘤病灶较大，呈结节状扩张性生长并伴有压迫性生长。同时，肿瘤组织内肿瘤细胞排列紊乱，无正常肝小叶结构；肿瘤细胞异型性较低，瘤体周围可见大量血管。与模型组相比，不同浓度三棱加参方组的肿瘤面积均有所减小，提示该方剂可缩小小鼠肿瘤体积 原位 药物干预后癌症受到抑制（图2C）。Ki67 的进一步免疫组织化学结果，该指标为肿瘤增殖标志物 图 2D，还证明了三棱加参方能显著抑制肿瘤增殖。为更直观、准确地探究三棱加参方对肝肿瘤生长的影响，采用小动物成像技术对原位肝癌的肿瘤体积进行可视化观察。如图所示 图3，三棱.......

讨论

大量证据已证实，三棱加参方中的三棱、人参、大黄和川芎在肝癌治疗方面具有药理作用。研究表明，三棱可显著抑制肿瘤细胞的增殖与生长，防止肿瘤细胞侵袭和转移，诱导细胞凋亡，并调节细胞周期及肿瘤微环境²⁰。研究证实，三棱中的活性成分山奈酚可通过抑制增殖、促进自噬及调节氧化应激，抑制胃癌²¹、前列腺癌²²和肝癌²³的发生与发展。杨梅素是人参中具有抗肿瘤活性的关键化合物。已知杨梅素可通过诱导凋亡抑制膀胱癌的生长²⁴，并通过诱导细胞周期阻滞阻断肺腺癌的增殖²⁴。更重要的是，杨梅素可通过抑制血管生成限制肝癌细胞的生长²⁵。目前，杨梅素已在欧洲作为保肝保健产品上市，其药物价值值得进一步探索。

目前，人参皂苷Rh2和Rg3常用于临床抗肿瘤药物，不仅能够抑制肿瘤生长、肿瘤血管.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶溶液	美国 HyClone	SH30042.01B
1 mL一次性注射器	中国明安康医疗设备有限公司	RWSB
1% 青霉素 & 链霉素溶液	美国Hyclone	SV30010
1.5 mL 离心管	康宁，美国	MCT-150-C-S
12 cm 针持	中国河南	HKQS-211
6-0 外科缝合线	中国上海金环医疗器械有限公司，中国上海	CR631
75% 酒精	中国四川优邦企业有限公司，中国四川	1.00009×10¹¹
96孔板	中国NEST	701001
丙酮	中国天津丁孚化工总厂，中国天津	GB686-89
BALB/c-nu 雄性裸鼠	中国北京维通利华实验动物技术有限公司，中国北京	SYXK(吉) 2018-0006
生物组织烘烤机	Leica，德国	Leica HI1220
细胞培养皿	中国NEST	NEST.706001
柠檬酸溶液	中国武汉，武汉卡诺斯科技有限公司	sj1074
D-荧光素	Gold Biotechnology®，有限公司，中国	LUCK-100
DMEM	美国Hyclone	SH30243.01
鸡蛋照蛋仪	中国山东威振孵化设备有限公司	WZSDT
伊红染色液	中国湖南，湖南百康妙生物科技有限公司	110703061
红霉素眼膏	中国上海，慈生制药有限公司	H37022025
胎牛血清	Clark, America	FB25015
全自动智能雏鸡孵化箱	中国山东，山东威振孵化设备有限公司	29538
GFP 慢病毒溶液	中国苏州吉玛基因股份有限公司，中国苏州	F22AZ
山羊血清	中国沈阳，沈阳万类生物科技有限公司	WLA067
手持式小鼠颅骨钻	STRONGWT，中国	190
HCCLM3 细胞系	WheLab，中国上海	C1010
加热垫	中国杭州中科生命科技有限公司	GEJRD-10W
苏木精	中国湖南，湖南百康妙生物科技有限公司	B-YH250-1
智能煎药壶	中国杭州九阳生活家电有限公司，中国杭州	3003BQ
倒置荧光显微镜	日本 Olympus	IX73
ki67 一抗	中国武汉，武汉赛维尔生物科技有限公司	GB121141-100
聚维酮碘消毒剂	中国湖南科福医疗科技有限公司	202110073
荧光素酶	中国苏州吉玛基因股份有限公司，中国苏州	E26JZ
基质胶	康宁，美国	356234
医用纱布	中国云南，云南晨业生物科技有限公司	71712049971
甲醇	中国广东广东华科科技有限公司，中国广东	1.17001.023
眼科剪	中国台湾	HKQS-209
眼科镊子	中国河南	HKCL-20
石蜡包埋机	德国徕卡	EG1150H
石蜡切片机	德国 Leica	Leica CM1950
多聚甲醛	中国，Biosharp	BL539A
PBS缓冲液	中国武汉，武汉赛维尔生物科技有限公司	G2156-1L
嘌呤霉素	北京索莱宝科技有限公司 &中国北京，有限公司	P8230
冰箱	赛默飞世尔科技，美国	TDE40086FV-ULTS
手术刀	中国台湾	HKCL-93
二抗	中国武汉，武汉赛维尔生物科技有限公司	GB23301
小型动物活体成像系统	美国Caliper生命科学公司	IVIS Lumina XR
索拉非尼	中国上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中国上海	284461-73-0
透明敷料	3M，美国	9534HP
Triton X-100	北京索莱宝科技有限公司 &中国北京，有限公司	T8200
真空冷冻干燥机	中国宁波，宁波新芝生物科技股份有限公司	sz-10N
白羽鸡鸡蛋	中国山东，山东昊泰实验动物 breeding 有限公司	SCXK(鲁) 20180004
二甲苯	Sigma-Aldrich，美国	534056