本文介绍了研究三棱加参方对原位移植性肝细胞癌BALB/c-nu小鼠治疗作用及血管抑制作用的逐步实验方案。
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摘要
摘要
肝癌的高致死率以及对化学药物的耐药性，促使人们不得不寻找治疗肝癌的有效传统草药处方。可重复、易于操作且能高度模拟肝癌病理生理过程的动物模型，是成功筛选有效候选药物的前提。同时，可靠的药物疗效评价指标和方法也是抗肝癌药物研发的重要保障。
三棱加参方，一种含中药的代表性处方 Sparganium stoloniferum，Buch.-Ham.（三棱） Panax ginseng C. A. Mey.（人参）， Rheum officinale 巴氏（大黄），以及 川芎 川芎（Hort. (Chuanxiong)）被用于滋补肝脏、清热解毒、活血化瘀，以治疗肝癌。本实验方案描述了三棱加参冻干粉的制备方法以及在 BALB/c-nu 小鼠中建立原位肝癌模型的过程。组织病理学染色、癌标志物的免疫组化检测， 体内 对小鼠进行成像，并采用鸡胚尿囊膜试验探索三棱加参方对肝癌组织恶性增殖的抑制作用及抗血管生成效应。数据显示，三棱加参方能够有效抑制肝癌组织的恶性增殖，表现为肿瘤体积减小、病理损伤改善以及癌性标志物ki67水平降低。
对血管生成的更强抑制作用还表明，三棱加参方可能具有治疗和预防肝癌进展与恶化的作用。整个实验方案展示了中药成分在小鼠肝癌治疗中的综合性过程，为肝癌模型的建立与优化，以及防治肝癌药物的研发提供了参考。
引言
肝癌是一种起源于肝脏的致命性癌症，是全球癌症相关死亡的第二大原因1。美国和一些发展中国家的肝病发病率处于较高水平，预计到2030年全球肝癌病例可能超过100万例2。由于吸烟、肥胖、饮酒等不健康的生活习惯，以及乙型肝炎、丙型肝炎和其他病毒的侵害，肝癌的发病率和死亡率逐年显著上升3。肝癌是一种具有不同组织学特征且预后较差的异质性恶性肿瘤，其发病类型广泛，包括肝细胞癌、肝内胆管癌和纤维板层型肝癌4。肝癌通常在晚期才被诊断，许多晚期患者不适合接受放射治疗5。多激酶抑制剂索拉非尼是晚期肝癌患者广泛接受的药物，但患者通常在短期内即产生明显耐药性6。目前，免疫检查点抑制剂PD-1和PD-L1与索拉非尼联合使用在控制肝癌进展方面取得了一定进展，但其治疗效果仍存在争议7。
原发性肝癌是一种早期肝癌：癌细胞尚未在肝组织周围扩散或发生器官间转移，肝功能未受到显著影响8。由于原发性肝癌通常不会出现明显的不适症状，部分患者可能仅有轻度肝区疼痛、乏力等症状9。在临床实践中，肝脏彩色多普勒超声和增强计算机断层扫描检查可诊断肝脏实质性占位性病变10。尽管尚未扩散和转移的局部肝癌可通过手术切除，但手术存在一定风险，并给患者带来不可避免的心理负担11。化疗和放疗可杀死全部或部分肝癌细胞，但长期用药可能导致患者免疫抑制，影响治疗效果并增加其他疾病的风险12。因此，寻找安全有效的药物治疗方案用于早期肝癌的预防与治疗，是遏制肝癌进展和恶化的关键。
中医治疗肝癌的原则基于体内平衡与和谐的理念。中医将肝癌视为体内能量（称为气）的失衡或失调，这种失衡影响肝脏功能13肝癌的中医治疗包括多种方法，如中药、针灸、饮食疗法和生活方式建议。其原则是恢复气的平衡，增强机体的防御机制，促进身体自我修复能力。14,15. 肝癌在传统中医中属于 "鼓肠" 和 "肝脏蓄积" 类别。早在 "黄帝内经" 症状记录详尽，肝癌由血瘀和正气亏虚所致，治疗以祛瘀血、消鼓胀、扶正固本为主13三棱丸源自于该书 "卫生保健" 由元代名医罗天一撰写。由三种药物组成： Sparganium stoloniferum，Buch.-Ham.（三棱）， 川芎 川芎（Hort.）以及 Rheum officinale 巴伊尔（大黄）。这三种药物均可入肝经，对肝癌的治疗具有药用价值。14三棱16 g，莪术16 g组成的三棱加参方 Panax ginseng C.A.Mey.（人参），8 g 大黄，2 g 川芎（图1），用于滋补肝脏、清热解毒、活血化瘀。这些草药被认为具有抗癌特性，有助于抑制肿瘤生长，缓解症状，并改善整体健康状况。在先前的 体外 实验表明，三棱加参方能够抑制肝癌细胞的增殖15然而，如何高效且合理地评价中药复方对肝癌的抑制作用？通过建立BALB/c-nu小鼠模型 原位 肝癌模型中，主要通过小动物活体成像和鸡胚尿囊膜试验研究三棱加参方对肝癌及血管生成的抑制作用。
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方案
选用吉林大学转化医学院动物实验中心饲养的SPF级雄性BALB/c-nu裸鼠，鼠龄5周，体重18–22 g；饲养条件为温度22 °C–24 °C、相对湿度40%–60%。实验动物使用许可证编号为SYXK(吉) 2018-0006，实验过程遵循吉林大学伦理委员会的相关规定，动物伦理审批编号为20221228-01。
1. 三棱加参方冻干粉的制备15
- 取16 g三棱、16 g人参、8 g大黄和2 g川芎，置于智能煎药壶中（见材料表），加入294 mL去离子水，室温浸泡30 min。加热煮沸后，在100 °C条件下继续煎煮30 min，用双层医用纱布过滤药液（见材料表）。药渣中再加入252 mL去离子水，于100 °C煎煮30 min，用双层纱布过滤。
- 将步骤1.1所得滤液收集于洁净的不锈钢容器中，在-80 °C条件下冷冻12 h（见材料表）。
- 将步骤1.2所得三棱加参方样品置于真空冷冻干燥机中（见材料表）（冷阱温度：-55 °C），干燥48 h，得到三棱加参方的冻干粉。
2. 构建稳定表达荧光素酶的HCCLM3细胞系16
- 在24孔板（参见材料表）中加入1.0 mL HCCLM3细胞悬液（每孔5 × 105个细胞），并在含3 µg/mL嘌呤霉素的完全培养基（10%胎牛血清 + 1%青霉素-链霉素溶液 + DMEM）（参见材料表）中，于细胞培养箱内（37 °C，5% CO2，参见材料表）培养72小时。
- 弃去步骤2.1中的细胞上清液，加入100 µL 0.25%胰蛋白酶溶液，在细胞培养箱中消化1分钟（参见材料表）。加入300 µL完全培养基，用移液器吹打使贴壁细胞脱落并终止消化。收集全部细胞悬液，于室温下以1,000 × g离心5分钟。弃去上清液后，加入1 mL完全培养基，通过移液吹打混匀。
- 将步骤2.2中制备的每孔含4 × 103个HCCLM3细胞的100 µL细胞悬液加入96孔板中，在细胞培养箱中培养24小时（37 °C，5% CO2，参见材料表）。
- 向步骤2.3中的96孔板加入0.27 µL GFP慢病毒，于细胞培养箱中继续培养15小时（37 °C，5% CO2，参见材料表）。弃去细胞上清液，加入100 µL完全培养基，使用荧光显微镜在激发波长488 nm、发射波长507 nm条件下获取图像（参见材料表）。
- 更换为2 mL GFP慢病毒继续培养24小时，随后更换为不含GFP慢病毒的2 mL完全培养基再培养24小时。
注：在倒置荧光显微镜下观察，GFP慢病毒转染HCCLM3细胞的效率为80%。 - 将步骤2.1中制备的5 mL含2 × 105个细胞的细胞悬液加入60 mm培养皿中，在细胞培养箱中培养24小时。加入64.5 µL荧光素酶，继续在细胞培养箱中培养15小时（37 °C，5% CO2，参见材料表）。
- 弃去上清液，加入5 mL完全培养基继续培养，直至细胞在培养皿中融合度达到90%。弃去细胞上清液，用2 × 1 mL PBS洗涤，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶溶液，在细胞培养箱中消化1分钟（37 °C，5% CO2，参见材料表）。加入3 mL完全培养基，反复吹打使贴壁细胞脱落并终止消化。收集全部细胞悬液用于后续小鼠接种。
注：为获得足够数量的细胞，需进行连续传代培养。
3. 建立BALB/c-nu裸鼠肝癌模型 原位 以及治疗15
- 取100 µL在步骤2.7中转染了荧光素酶的1 × 107 HCCLM3细胞，加入100 µL基质胶（见材料表），置于1.5 mL离心管（见材料表）中，用1 mL移液器（见材料表）轻轻混匀。
注意：溶液制备全过程必须在冰上操作，以防止基质胶凝固。 - 用碘伏（见材料表）对BALB/c-nu裸鼠左右腋窝进行消毒，并用酒精（见材料表）脱碘。
- 用1 mL一次性注射器将步骤3.1中制备的HCCLM3细胞与基质胶混合液缓慢注射100 µL至BALB/c-nu裸鼠左右腋窝。
注意：大约10天后，BALB/c-nu裸鼠双侧腋下注射部位可形成约0.5 cm3的肿瘤组织。 - 通过腹腔注射1%、50 mg/kg戊巴比妥钠对步骤3.3中的BALB/c-nu裸鼠进行麻醉。使用眼科剪刀和镊子（见材料表）剪开双侧腋窝皮肤，轻轻剥离皮下肿瘤组织，将其置于含有预冷PBS缓冲液（见材料表）的细胞培养皿（见材料表）中，并用手术刀（见材料表）切成1 mm3大小的组织块。
注意：BALB/c-nu裸鼠腋下肿瘤组织必须在0.5小时内于冰上完成采集，以维持肿瘤细胞活性并提高模型成功率。采样结束后，通过颈椎脱臼法处死小鼠。若肿瘤组织存在坏死部分，需予以剔除，仅保留鱼肉样新鲜肿瘤组织，以防止异位移植过程中发生感染。 - 通过腹腔注射1%、50 mg/kg戊巴比妥钠对BALB/c-nu裸鼠进行麻醉（见材料表），用碘液（见材料表）对腹部进行消毒，并用酒精（见材料表）脱碘。
- 使用眼科剪刀和镊子（见材料表）在剑突下方0.5 cm处做一长约1 cm、呈45°角的手术切口，暴露肝脏，轻压肝脏使其组织外露，并用称量纸固定肝脏。
注意：可在小鼠肋下放置棉签或棉棒，以有效暴露肝脏。 - 用10 mL一次性注射针头取步骤3.4中的一小块肿瘤组织，将肿瘤组织平行于肝脏方向植入肝实质约0.5 cm深处，固定于肝包膜下，然后缓慢拔出针头。
注意：使用1 mL一次性注射器滴加2滴融化的基质胶，观察确认肿瘤组织无移位且无出血后，再缝合手术切口。 - 使用12 cm持针器和6-0外科缝合线（见材料表）关闭手术切口。在手术部位涂抹红霉素眼膏（见材料表）以预防感染。将小鼠置于加热垫（见材料表）上，待其苏醒后单独饲养于笼中。
- 从建模后第一天开始，对步骤3.8中的小鼠进行灌胃给药，每日一次，连续14天，给予索拉非尼7.5 mg/kg及三棱加参方（7.8 g/kg、15.6 g/kg和31.2 g/kg）。模型组小鼠给予等体积的生理盐水。
4. 体内 成像评估
注意：第14天在给药结束后1小时进行活体成像。
- 打开计算机和 in vivo 成像仪器（参见材料表）。双击桌面上的Living Image 图标以启动程序。在控制面板中点击初始化 IVIS 系统以启动整个 IVIS 系统。
注意：仪器完成自检后，控制面板上的温度状态指示灯为红色。待温度下降、指示灯变为绿色后，再等待约 5-10 分钟，即可进行图像采集。 - 用酒精对小鼠腹部进行消毒，使用一次性注射器按每克体重 10 µL 的剂量腹腔注射 D-荧光素（参见材料表）。通过腹腔注射 1%、50 mg/kg 的戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉。
注意：D-荧光素用无菌 PBS 稀释至 15 mg/mL。 - 将步骤 4.3 中麻醉后的小鼠放入观察箱内并关闭箱门，在控制面板中设置曝光时间为 30 秒：模式选择：根据样本类型选择生物发光，默认选择自动程序，然后点击采集以获取图像。
- 点击保存 Living Image 数据，选择所有 Living Image 数据文件，并将其保存至计算机桌面。
- 在主界面的Living Image中点击退出。依次关闭相机电源、成像仪器电源和计算机电源。
- 成像完成后，通过颈椎脱臼法处死已麻醉的小鼠（腹腔注射 1%、50 mg/kg 戊巴比妥钠）。
5. 苏木精-伊红染色17
- 将4.7步骤中获取的小鼠新鲜肝组织置于4%多聚甲醛中固定48小时，然后用流水冲洗3次，每次5分钟，以彻底去除多聚甲醛（参见材料表）。
- 将5.1步骤中的肝组织依次在30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇
、95%乙醇
以及无水乙醇中各脱水1小时（参见材料表）。 - 将5.2步骤中脱水后的肝组织依次放入50%乙醇、50%二甲苯、二甲苯、二甲苯和二甲苯
中，每步1小时，使其透明化（参见材料表）。
注意：二甲苯具有挥发性和毒性，此步骤应在通风橱中进行。 - 熔化石蜡并保持温度约55 °C。将5.3步骤中的肝组织块放入装有石蜡溶液的石蜡包埋机（参见材料表）中进行包埋。
- 将5.4步骤中包埋好的小鼠肝组织蜡块固定于石蜡切片机（参见材料表）上，切成5 µm厚的切片，将切片完全展平于50 °C水中，用载玻片捞起，最后放入生物组织烘片机中，在70 °C下烘干20分钟（参见材料表）。
- 将5.5步骤中的5 µm切片依次浸入二甲苯、二甲苯、无水乙醇和无水乙醇中各10分钟，随后分别浸入95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇和70%乙醇中各5分钟，最后用蒸馏水洗涤以完成脱蜡处理（参见材料表）。
- 用苏木精对已脱水的5 µm厚石蜡包埋肝组织切片染色8分钟，然后用流水冲洗。
- 在1%盐酸溶液中分化10秒，再用流水冲洗30分钟（参见材料表）。
- 用0.5%伊红溶液染色1分钟（参见材料表）。
- 将切片依次浸入95%酒精、95%酒精、无水乙醇、无水乙醇、二甲苯和二甲苯中，每种试剂各5分钟，以完成脱水（参见材料表）。
- 用中性树胶封片，并在倒置光学显微镜下拍照（参见材料表）。
6. 免疫组织化学染色18
- 在步骤5.6中，将1.5% H2O2滴加至小鼠肝脏5 µm切片上，室温孵育10分钟，然后用PBS洗涤2次，每次5分钟（参见材料表）。
- 用柠檬酸溶液（参见材料表）处理组织5分钟，然后用PBS洗涤3次，每次5分钟。
- 在室温下用0.2% Triton X-100（参见材料表）孵育4分钟，随后在室温下用0.5% Triton X-100孵育4分钟，再用PBS洗涤。
- 加入山羊血清（参见材料表）封闭15分钟，然后加入用PBS稀释的ki67一抗（1:300）（参见材料表），4 °C孵育过夜。用PBS洗涤3次，每次5分钟。
- 在室温下用PBS稀释的二抗（1:200）孵育1小时，然后用PBS洗涤3次，每次5分钟（参见材料表）。
- 用显色液染色5分钟，然后用双蒸水冲洗（参见材料表）。
- 用苏木精复染2分钟，在1%盐酸溶液中分化10秒，再用流水冲洗30分钟（参见材料表）。
- 将切片依次放入95%酒精 、95%酒精 、无水乙醇 、无水乙醇 、二甲苯 和二甲苯 中各5分钟进行脱水（参见材料表）。
- 用中性树胶封片，并在倒置光学显微镜下拍照（参见材料表）。
7. 鸡胚尿囊绒毛膜试验19
- 将白羽鸡鸡蛋静置（参见 材料表）在室温下放置 2 小时，喷洒酒精消毒。使用颅骨钻在气室上钻孔（参见 材料表），将鸡蛋气室朝上放置，于37.8–38.2 °C、相对湿度65%条件下孵育7天。
注意：孵化最初3天内，需打开自动翻蛋按钮，以防止鸡胚绒毛尿囊膜黏附于蛋壳并形成假气室。 - 在卵子透照仪中丢弃弱小/未受精的卵（参见 材料表）。用眼科镊子小心剥去一个 1 × 1 cm 的窗口（见 材料表）在假空气腔上用颅骨钻钻孔后（参见 材料表).
注意：请勿使蛋壳落入鸡胚尿囊绒毛膜中。 - 在孵育第8天，加入100 µL肿瘤细胞悬液（1 × 106 向除对照组外的每个卵的假气室中加入细胞；在药物组中，加入100 µL索拉非尼溶液和三棱加参方；在对照组和模型组中，加入100 µL PBS。
注意：肿瘤细胞悬液由等体积的HCCLM3细胞和基质胶组成。药物浓度设置如下：7.5 mg/kg 索拉非尼，以及三棱加参方（7.8 g/kg、15.6 g/kg 和 31.2 g/kg）。 - 用透明敷料覆盖窗口（参见 材料表）并用酒精喷雾消毒（参见 材料表）。孵育7天后，移除透明敷料，加入1 mL固定液（甲醇:丙酮 = 1:1）（参见 材料表从假空气室中取出，进行30分钟固定。
- 用1 mL注射器弃去固定液。在假气室中用眼科剪剪取约5 cm × 5 cm的尿囊绒毛膜，置于60 mm培养皿中。
注意：对于带有血液的鸡胚绒毛尿囊膜，用PBS冲洗；对于附着在组织上的鸡胚绒毛尿囊膜，用眼科剪分离。 - 将步骤7.5中获取的绒毛尿囊膜置于光学显微镜下，拍摄血管图像（参见 材料表).
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结果
如图所示 图 2A，我们建立了 原位 建立BALB/c-nu小鼠肝癌模型，并评价三棱加参方的抗肿瘤作用。 图2B 表明三棱加参方能显著抑制肝肿瘤的生长。病理结果显示，与对照组相比，模型组肿瘤病灶与周围组织分界清晰，肿瘤病灶较大，呈结节状扩张性生长并伴有压迫性生长。同时，肿瘤组织内肿瘤细胞排列紊乱，无正常肝小叶结构；肿瘤细胞异型性较低，瘤体周围可见大量血管。与模型组相比，不同浓度三棱加参方组的肿瘤面积均有所减小，提示该方剂可缩小小鼠肿瘤体积 原位 药物干预后癌症受到抑制（图2C）。Ki67 的进一步免疫组织化学结果，该指标为肿瘤增殖标志物 图 2D，还证明了三棱加参方能显著抑制肿瘤增殖。为更直观、准确地探究三棱加参方对肝肿瘤生长的影响，采用小动物成像技术对原位肝癌的肿瘤体积进行可视化观察。如图所示 图3，三棱...
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讨论
大量证据已证实，三棱加参方中的三棱、人参、大黄和川芎在肝癌治疗方面具有药理作用。研究表明，三棱可显著抑制肿瘤细胞的增殖与生长，防止肿瘤细胞侵袭和转移，诱导细胞凋亡，并调节细胞周期及肿瘤微环境20。研究证实，三棱中的活性成分山奈酚可通过抑制增殖、促进自噬及调节氧化应激，抑制胃癌21、前列腺癌22和肝癌23的发生与发展。杨梅素是人参中具有抗肿瘤活性的关键化合物。已知杨梅素可通过诱导凋亡抑制膀胱癌的生长24，并通过诱导细胞周期阻滞阻断肺腺癌的增殖24。更重要的是，杨梅素可通过抑制血管生成限制肝癌细胞的生长25。目前，杨梅素已在欧洲作为保肝保健产品上市，其药物价值值得进一步探索。
目前，人参皂苷Rh2和Rg3常用于临床抗肿瘤药物，不仅能够抑制肿瘤生长、肿瘤血管...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到国家哲学社会科学基金（20VYJ070）、吉林省教育厅项目（JJKH20230963KJ）以及长春中医药大学第二批杏林学者工程计划项目（QNKXJ2-2021+ZR25）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶溶液 | 美国 HyClone | SH30042.01B | |
| 1 mL一次性注射器 | 中国明安康医疗设备有限公司 | RWSB | |
| 1% 青霉素 & 链霉素溶液 | 美国Hyclone | SV30010 | |
| 1.5 mL 离心管 | 康宁，美国 | MCT-150-C-S | |
| 12 cm 针持 | 中国河南 | HKQS-211 | |
| 6-0 外科缝合线 | 中国上海金环医疗器械有限公司，中国上海 | CR631 | |
| 75% 酒精 | 中国四川优邦企业有限公司，中国四川 | 1.00009×10¹¹ | |
| 96孔板 | 中国NEST | 701001 | |
| 丙酮 | 中国天津丁孚化工总厂，中国天津 | GB686-89 | |
| BALB/c-nu 雄性裸鼠 | 中国北京维通利华实验动物技术有限公司，中国北京 | SYXK(吉) 2018-0006 | |
| 生物组织烘烤机 | Leica，德国 | Leica HI1220 | |
| 细胞培养皿 | 中国NEST | NEST.706001 | |
| 柠檬酸溶液 | 中国武汉，武汉卡诺斯科技有限公司 | sj1074 | |
| D-荧光素 | Gold Biotechnology®，有限公司，中国 | LUCK-100 | |
| DMEM | 美国Hyclone | SH30243.01 | |
| 鸡蛋照蛋仪 | 中国山东威振孵化设备有限公司 | WZSDT | |
| 伊红染色液 | 中国湖南，湖南百康妙生物科技有限公司 | 110703061 | |
| 红霉素眼膏 | 中国上海，慈生制药有限公司 | H37022025 | |
| 胎牛血清 | Clark, America | FB25015 | |
| 全自动智能雏鸡孵化箱 | 中国山东，山东威振孵化设备有限公司 | 29538 | |
| GFP 慢病毒溶液 | 中国苏州吉玛基因股份有限公司，中国苏州 | F22AZ | |
| 山羊血清 | 中国沈阳，沈阳万类生物科技有限公司 | WLA067 | |
| 手持式小鼠颅骨钻 | STRONGWT，中国 | 190 | |
| HCCLM3 细胞系 | WheLab，中国上海 | C1010 | |
| 加热垫 | 中国杭州中科生命科技有限公司 | GEJRD-10W | |
| 苏木精 | 中国湖南，湖南百康妙生物科技有限公司 | B-YH250-1 | |
| 智能煎药壶 | 中国杭州九阳生活家电有限公司，中国杭州 | 3003BQ | |
| 倒置荧光显微镜 | 日本 Olympus | IX73 | |
| ki67 一抗 | 中国武汉，武汉赛维尔生物科技有限公司 | GB121141-100 | |
| 聚维酮碘消毒剂 | 中国湖南科福医疗科技有限公司 | 202110073 | |
| 荧光素酶 | 中国苏州吉玛基因股份有限公司，中国苏州 | E26JZ | |
| 基质胶 | 康宁，美国 | 356234 | |
| 医用纱布 | 中国云南，云南晨业生物科技有限公司 | 71712049971 | |
| 甲醇 | 中国广东广东华科科技有限公司，中国广东 | 1.17001.023 | |
| 眼科剪 | 中国台湾 | HKQS-209 | |
| 眼科镊子 | 中国河南 | HKCL-20 | |
| 石蜡包埋机 | 德国徕卡 | EG1150H | |
| 石蜡切片机 | 德国 Leica | Leica CM1950 | |
| 多聚甲醛 | 中国，Biosharp | BL539A | |
| PBS缓冲液 | 中国武汉，武汉赛维尔生物科技有限公司 | G2156-1L | |
| 嘌呤霉素 | 北京索莱宝科技有限公司 &中国北京，有限公司 | P8230 | |
| 冰箱 | 赛默飞世尔科技，美国 | TDE40086FV-ULTS | |
| 手术刀 | 中国台湾 | HKCL-93 | |
| 二抗 | 中国武汉，武汉赛维尔生物科技有限公司 | GB23301 | |
| 小型动物活体成像系统 | 美国Caliper生命科学公司 | IVIS Lumina XR | |
| 索拉非尼 | 中国上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中国上海 | 284461-73-0 | |
| 透明敷料 | 3M，美国 | 9534HP | |
| Triton X-100 | 北京索莱宝科技有限公司 &中国北京，有限公司 | T8200 | |
| 真空冷冻干燥机 | 中国宁波，宁波新芝生物科技股份有限公司 | sz-10N | |
| 白羽鸡鸡蛋 | 中国山东，山东昊泰实验动物 breeding 有限公司 | SCXK(鲁) 20180004 | |
| 二甲苯 | Sigma-Aldrich，美国 | 534056 |
参考文献
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