我们的详细方案概述了先进的肠芯片模型的构建与使用方法，该模型可模拟具有三维结构和多种细胞类型的肠黏膜，从而能够深入分析微生物定植引发的免疫反应和细胞功能。
本文内容
摘要
摘要
一种先进的肠芯片模型已被开发出来，可重建上皮细胞三维类器官样绒毛结构和隐窝样结构。该具有免疫活性的模型包含人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、Caco-2 肠道上皮细胞、组织驻留型巨噬细胞以及树突状细胞，这些细胞可在组织内自发形成有序结构，模拟人类肠道黏膜的特征。该平台的一个独特之处在于能够整合循环的人原代免疫细胞，从而增强其生理相关性。该模型旨在研究肠道免疫系统对细菌和真菌定植及感染的响应。由于其腔室尺寸增大，该模型可实现多种功能性检测，包括通透性测定、细胞因子释放和免疫细胞浸润，并兼容对上皮细胞层形成的三维结构进行免疫荧光检测。因此，该模型可全面揭示细胞分化与功能特征。该肠芯片平台已展现出在微生理灌注式生物芯片系统中解析活体微生物群替代物与人类宿主组织之间复杂相互作用的潜力。
引言
器官芯片（Organ-on-Chip, OoC）系统是一种新兴的三维细胞培养技术，能够弥合传统二维细胞培养与动物模型之间的差距。OoC 平台通常包含一个或多个腔室，其中在多种支架（如膜材料或水凝胶）上培养具有组织特异性的细胞1。这些模型能够模拟一种或多种明确的器官特异性功能。通过泵系统实现细胞培养基的持续微流控灌注，以清除细胞代谢废物，提供营养物质和生长因子，促进细胞分化，并重现关键的体内（in vivo）环境条件。当整合免疫细胞后，OoC 系统可在体外（in vitro）模拟人体免疫反应2。迄今为止，已有多种器官和功能单元的模型被成功构建1，包括血管3、肺4、肝2,5和肠6模型，这些系统可用于药物测试5,7和感染机制研究6,8。
本文介绍一种集成化的人体肠芯片模型，该模型结合了形成绒毛样和隐窝样类器官三维拓扑结构的人体上皮细胞，并整合了内皮细胞层以及组织驻留型巨噬细胞。该模型在一种显微镜载片规格的微流控灌注式生物芯片中进行培养。 每块生物芯片包含两个独立的微流控腔室。每个腔室由一层多孔聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜分隔为上室和下室。该膜本身亦作为细胞在两侧生长的支架。膜上的孔隙可实现细胞层之间的细胞互作及细胞迁移。每个腔室均可通过两个雌性鲁尔锁接头尺寸的端口进行操作。此外，可选配一个额外的微型鲁尔锁接头尺寸端口，用于通达上室或下室（图1）。
器官芯片（OoC）平台能够从单次实验中获取多种读数。肠芯片专门设计用于结合灌注式三维细胞培养、流出液分析和荧光显微镜技术，以评估细胞标志物表达、代谢速率、免疫反应、微生物定植与感染以及屏障功能3,6,8。该模型包含组织驻留的免疫细胞，并实现了活体微生物与宿主组织的直接接触，相较于其他已发表的模型具有优势9。此外，上皮细胞可自组织形成三维结构，为活体微生物群的定植提供生理相关的界面6。
方案
本方案需要从健康供者获取每块生物芯片约 20 mL 的新鲜血液，以分离原代人单核细胞。所有供者均签署书面知情同意书，同意参与本研究，该研究已获得耶拿大学医院伦理委员会批准（许可编号 2018-1052-BO）。有关材料的详细信息，请参见材料表。有关所有溶液和培养基成分的详细信息，请参见表 1。
1. 生物芯片操作的一般注意事项
- 使用加热的刀片小心分离出一排储液槽，并将盖子剥离，以获得单个的储液槽和盖子。扩大盖子上的孔径，使硅胶管能够紧密贴合。
- 硅胶管内径为0.5 mm，呈不对称结构，通过两个蠕动泵夹将管道分为较长段（20 cm）和较短段（12 cm）。每个生物芯片需装配两根该种不对称结构的管道：将管道一端连接至雄性鲁尔锁接头，另一端连接盖子。同时，每个生物芯片还需装配四个储液槽。
注意：请提前准备管道和储液槽，并在使用前通过高压灭菌进行消毒。由于硅胶管使用寿命有限，建议每进行3–5次实验后更换一次管道。对于某些特定研究目的（如药物测试），建议每次实验均使用新管道。本方案中多个步骤可并行操作；请参考概览图，其中高亮显示了如图2所示同一天内进行的不同操作步骤。
图 1：肠芯片模型的示意图。（A）以横截面视图展示生物芯片。（B）可见整个生物芯片以及扁平可拆卸的PET膜的尺寸。上腔室（包括雌性鲁尔锁式接口）的总体积为290 µL，下腔室为270 µL。（C）可观察到肠道生物芯片的示意图组成，包括呈现绒毛样和隐窝样结构的三维外生长上皮、分化后的免疫细胞以及黏液层。PET膜的另一侧由单层内皮细胞覆盖。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：模型构建时间线及实验装置示意图。 本图展示了本方案的总体示意图。重要的操作步骤，例如细胞接种以及上皮层与脂多糖（LPS）的刺激，均以箭头标示。缩写：HUVECs = human umbilical venous endothelial cells；LPS = lipopolysaccharide。请点击此处查看此图的放大版本。
2. 生物芯片灭菌
- 取一个直径为15 cm的无菌玻璃培养皿，加入70%未变性乙醇。将生物芯片放入其中，确保生物芯片的所有端口均完全浸没于乙醇溶液中。
- 每个端口重复两次，通过芯片的所有腔室各抽吸1 mL 70%乙醇。室温（RT）孵育45–60分钟。
注意：确保生物芯片内部无气泡残留。自此步骤起，不得有空气进入生物芯片系统，各腔室应始终保持充满液体状态。 - 倒掉培养皿中的乙醇，更换为无菌双蒸水（ddH2O），直至完全覆盖所有端口。再次对每个端口重复两次，通过生物芯片腔室各抽吸1 mL ddH2O。更换培养皿中的ddH2O，并重复该操作。
- 将培养皿中的所有液体移除。此后，当生物芯片处于非无菌环境时，应始终将其保存在密闭的培养皿内。在培养皿中加入少量ddH2O储备液（例如50 mL离心管的管盖），体积为2–5 mL，以减少生物芯片内部液体的蒸发。
注意：若在使用前将已灭菌的生物芯片保存于无菌环境中，可提前最多3天进行灭菌处理，便于单日工作量的灵活安排。
3. 人脐静脉内皮细胞的收获与接种
注意：人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的分离自脐带，方法如先前文献所述10。
- 接种 HUVECs 之前，用人 IV 型胶原蛋白包被膜。为此，将胶原蛋白储备液（表 1）用含镁和钙的杜氏磷酸盐缓冲液（PBS +/+）按 1:100 稀释。向相应的腔室中加入 350 µL 稀释后的储备液，在室温下孵育 5 分钟。
注意：若在无菌操作台中处理生物芯片，建议在其下方放置无菌纸巾以吸收多余的液体。 - 用 350 µL PBS +/+ 冲洗所有腔室两次，以洗去残留的胶原蛋白和乙酸。然后，向每个腔室中加入 350 µL 内皮细胞生长（EC）培养基。
注意：此后，生物芯片即可用于细胞接种，并可在 37 °C 下保存至使用。 - 使用第 1–3 代、细胞融合度为 80–90% 的 HUVECs。将 HUVECs 培养在含有制造商提供的特定补充剂混合物的 EC 培养基中。图 3A 展示了 HUVEC 细胞培养的代表性明场图像。
注意：根据供体不同，高代次的 HUVECs 可能开始去分化，无法在生物芯片内稳定形成致密且融合的单层细胞。可选择性地在 EC 培养基中添加抗生素（即 100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素），但建议添加以防止微生物污染。 - 从 T25 细胞培养瓶中移除细胞培养基，并用 3–5 mL 不含镁和钙的杜氏磷酸盐缓冲液（PBS -/-）轻轻洗涤细胞。移除 PBS -/- 后，加入 1 mL 胰蛋白酶解离试剂（Table 1），在 37 °C 下孵育 5 分钟，直至细胞从培养瓶表面脱落。
- 用 9 mL 含 5% 胎牛血清（FBS）的 PBS -/- 将脱落的细胞转移至离心管中，在室温下以 350 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，用 1 mL EC 培养基重悬细胞，并计数。将细胞浓度调整为每 150 µL（接种至下腔室）或每 250 µL（接种至上腔室）含 0.4 × 106 个细胞。
- 向腔室中加入相应体积的细胞悬液。若接种至下腔室，需封闭所有端口，并立即将生物芯片倒置，使细胞沉降到 PET 膜上。将生物芯片置于 37 °C、5% CO2 的加湿培养箱中孵育。
- 24 小时后，用 350 µL EC 培养基更换含 HUVECs 的腔室中的培养基。相对腔室中的培养基无需更换。
4. 人血清采集及外周血单个核细胞（PBMC）来源的单核细胞分离
注意：外周血单个核细胞（PBMC）的分离方法如 Mosig 等人11所述。
- 从健康供者处采集人静脉血。每个生物芯片至少采集10 mL全血，使用含硅酸盐的采血管用于血清收集。完全凝固后，以2,500 × g离心采血管 × g 室温下静置10分钟。收集血清，分装后于-80℃保存。20 °C 直至进一步使用。
- 从同一供体采集至少10 mL全血，使用含EDTA的采血管收集，用于PBMC分离。将未凝固的血液与等体积的等渗缓冲液（iso-buffer）轻柔混匀表1通过倒置缓慢地将35 mL该混合物加至50 mL离心管中15 mL密度为1.077 g/mL的密度梯度介质上方。
- 800 离心 × g 室温下无制动离心20分钟。小心吸取位于密度梯度介质上方的免疫细胞层，转移至新的50 mL离心管中。用预冷的等渗缓冲液定容至50 mL，通过轻柔颠倒混匀洗涤细胞。
- 200离心 × g 8分钟，不刹车 4 °C弃去上清液，每份密度梯度中加入10 mL等渗缓冲液重悬。可选：若同时进行多份梯度分离，可合并同一供体的外周血单个核细胞（PBMCs）。
- 150离心 × g 8 分钟 4 °C弃去上清液，每份密度梯度中用10 mL等渗缓冲液重悬沉淀。重复步骤4.4的离心操作。最后，弃去上清液，将细胞重悬于2 mL单核细胞分化培养基中（表1).
注意：添加M-CSF和GM-CSF可促进分离得到的单核细胞向单核细胞来源的巨噬细胞和单核细胞来源的树突状细胞分化（后者需联合使用脂多糖[LPS]，LPS将在本实验方案的后续步骤中加入）。使用抗生素，即100 U/mL青霉素和 100 µg/mL 链霉素，可选择性添加但建议作为培养基的补充成分，以防止微生物污染。 - 确定细胞数量并接种约10 × 106 每孔2 mL单核细胞分化培养基中接种细胞至6孔板表1）。在湿润的培养箱中孵育 37 °C 孵育1小时，使单核细胞贴附于6孔板的塑料表面。
- 小心弃去上清液，用预热的2 mL造血细胞培养基重悬细胞，洗涤2次，以去除未结合的细胞。孵育于 37 °C 在单核细胞分化培养基中继续培养24小时。
- 为了收获单核细胞，小心弃去上清液，并用 2 mL 预热的 PBS -/- 轻柔洗涤一次。参见 图3B 此时单核细胞培养物的明场图像示例参见图示。随后，将细胞在1 mL预热的单核细胞解离试剂中孵育7分钟。表1在 37 °C 以促进单核细胞从6孔板的塑料表面脱离。
- 将脱离的单核细胞转移至低吸附性离心管中。可选步骤：为获得更高的细胞得率，可使用无钙镁磷酸盐缓冲液（PBS -/-）小心冲洗6孔板数次。
- 300 × g 离心 × g 室温孵育8分钟。弃去上清液，重悬于EC条件培养基中（表1）。确定细胞数量，并将细胞浓度调整至 0.1 × 106 每细胞 150 µL （在下腔接种）或 250 µL （在上腔接种）
注意：免疫细胞分离的每一步操作均需轻柔，尽量减少剪切力，以防止免疫细胞活化。在建立该分离方法时，应检测外周血单个核细胞来源的单核细胞纯度（例如通过流式细胞术）。超过95%的细胞应表达典型的单核细胞标志物（如CD14）。
5. 单核细胞接种
- 在含有 HUVEC 的腔室中加入 350 µL 预热的内皮细胞条件培养基，进行换液。
- 向同一腔室中加入 150 µL（下腔室）或 250 µL（上腔室）已制备的单核细胞悬液（见步骤 4.10）。若接种至下腔室，关闭所有端口，并立即将生物芯片倒置，使细胞沉降到 HUVEC 层上。将生物芯片置于 37 °C、5% CO2 的加湿培养箱中孵育。
- 每 24 小时在含有 HUVEC 和单核细胞的腔室中更换 350 µL 内皮细胞条件培养基。
6. C2BBe1 细胞的收获与接种
注意：Caco-2 刷状缘表达细胞 1（C2BBe1）12 使用代数不超过第 35 代，取自融合度为 80–90% 的培养瓶。图 3C 展示了 C2BBe1 培养物的代表性明场图像。
- 在 C2 培养基（表 1）中培养 C2BBe1 细胞。
注意：可选择性添加抗生素（例如 20 µg/mL 庆大霉素）作为 C2 培养基的补充成分，以预防微生物污染，建议使用。 - 移除 T25 细胞培养瓶中的细胞培养基，并用 3–5 mL 的无钙镁 PBS（PBS -/-）轻柔洗涤细胞。吸除 PBS -/-，加入 1 mL 胰蛋白酶消化液（表 1），于 37 °C 孵育 5 分钟，直至细胞从培养瓶表面脱落。
- 用含 5% 胎牛血清（FBS）的 PBS -/- 溶液共 9 mL 将脱落的细胞转移至离心管中。在室温下以 350 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，用 1 mL C2 培养基重悬细胞沉淀，并计数细胞数量。将细胞浓度调整为每 150 µL（下室接种）或每 250 µL（上室接种）含 0.5 × 106 个细胞。
- 接种 C2BBe1 细胞前，先用 350 µL C2 培养基轻柔洗涤相应培养室。
- 向相应培养室中加入 150 µL（下室）或 250 µL（上室）已制备好的 C2BBe1 细胞悬液（见步骤 6.3）。若接种至下室，需封闭所有端口，并立即将生物芯片倒置，使细胞沉降到 PET 膜上。将生物芯片置于 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中孵育。
图3：在接种到生物芯片之前，HUVECs、单核细胞和C2BBe1的细胞形态。 本图展示了在整个实验方案中所使用的不同细胞来源的代表性明场图像。图像使用倒置明场显微镜在10倍放大倍数下拍摄。所有细胞类型，（A）HUVECs、（B）单核细胞和（C）C2BBe1均按照各自特定的实验方案部分所述，在二维单层细胞培养体系中进行培养。比例尺 = 200 µm。缩写：HUVECs = 人脐静脉内皮细胞；PBMCs = 外周血单个核细胞。 请点击此处查看该图的高清版本。
7. 连接至蠕动泵与循环灌注
- 准备一个空的培养箱，并加入蠕动泵。使用消毒剂彻底清洁培养箱和泵的所有区域，以提供准无菌环境。
注意：蠕动泵在工作时可能产生大量热量。在保温良好的培养箱或空调效果不佳的实验室中，每个培养箱可使用的泵数量可能受限，因为培养箱容易过热。每个培养箱配备两台蠕动泵应足够。 - 在将灭菌后的管路连接至生物芯片之前，先用700 µL PBS +/+冲洗每根管路，随后用500 µL C2培养基或EC条件培养基冲洗。每种对称结构的管路每种培养基各准备一根（见步骤1.2）。将鲁尔锁与蠕动泵压块之间距离较短的管路用于左侧腔室，另一种对称结构的管路用于右侧腔室。
- 从培养箱中取出生物芯片，对每个腔室进行350 µL的换液操作。移除所有塞子，并将所有端口填充至最顶端。
- 从左侧腔室开始，通过将鲁尔锁接头插入生物芯片的端口，将第一根管路连接到上腔室的右侧端口。然后将第二根管路连接到下腔室的左侧端口。对右侧微流控腔室重复此操作。
- 取一个储液槽，在其底部加入少量细胞培养基。然后将储液槽安装到第一根管路的另一端，并对另一个腔室重复此操作。当所有端口均连接至管路或储液槽后，向每个储液槽中加入3.5 mL细胞培养基。
- 将带有盖子的管路松端放置在储液槽顶部，以封闭每个腔室的微流控系统。在此状态下，将生物芯片转移至蠕动泵。
注意：根据与培养箱的距离及实验室环境，可使用预先清洁并高压灭菌的盒子将芯片转移至培养箱。 - 使用蠕动泵压块将管路连接至泵。以使培养基从储液槽流入腔室，再经管路通过泵返回储液槽的方式连接每根管路（图4）。储液槽在循环灌注中起到气泡捕获作用，防止空气滞留在系统中。以50 µL/min的流速对每个腔室进行灌注，使上腔室产生0.013 dyn/cm2的剪切应力，下腔室产生0.006 dyn/cm2的剪切应力8。
注意：若上下腔室的培养基以相反方向流动，可促进肠道组织更显著的三维生长13。因此，上下腔室的储液槽应置于相对两侧（图4）。循环灌注可减少所需细胞培养基的用量，但可能导致细胞因子和代谢产物的富集。如有需要，也可采用线性灌注方式对生物芯片进行灌注。 - 在37 °C和5% CO2条件下对生物芯片进行72小时的灌注。
图4：连接至蠕动泵的生物芯片。图中展示了一个连接至蠕动泵的生物芯片示例。上皮细胞C2BBe1在下层腔室中培养（前方储液池中为红色的C2培养基），而HUVECs细胞则在上层腔室中培养（后方储液池中为淡黄色的EC条件培养基）。由于所形成的组织具有屏障功能，不同细胞培养基之间不会混合。生物芯片以特定方式连接至蠕动泵，使培养基从储液池流入腔室，再通过泵驱动经管道流回储液池。请点击此处查看该图的放大版本。
8. 上皮屏障的LPS预处理
- 预灌注72小时后，停止蠕动泵，并取下连接至各储液槽管路的盖子。将其放置在泵旁边的无菌组织上。
- 移除所有培养基，并向储液槽中加入2 mL新鲜配制的培养基。对于含有C2BBe1细胞的上皮侧，向培养基中添加100 ng/mL的LPS。
注意：LPS可增强组织的屏障功能，刺激单核细胞来源的巨噬细胞迁移至上皮组织，并促进单核细胞来源的树突状细胞分化。 - 重新连接管路和盖子至储液槽，并以50 µL/min的流速继续循环灌注24小时。
注意：自此之后，该芯片模型可用于实验，如化合物测试或感染研究。我们建议每24小时对每个储液槽更换2 mL培养基。
9. 采用不同检测方法获取组织样本
- 在灌注的各个时间点，从储液器中收集细胞培养基上清液。打开储液器，收集所需体积的液体（参见步骤 8.1–8.3）。使用这些上清液检测代谢物、细胞因子或其他分子。
- 如需获取组织，使用手术刀沿上层腔室外侧精确切割，移除密封膜以打开微流控腔室。此时肠芯片模型中的组织已可接触。小心地沿微流控腔室外侧切割，将膜从芯片上分离。使用镊子收集含有组织的膜。
注意：操作时请注意手指位置，小心操作以防止意外发生。建议佩戴防切割手套。 - 或者，可使用酶溶液（如胰蛋白酶）消化芯片内不同层的细胞，或使用含 Triton X-100 的缓冲液裂解细胞以收集细胞样本。
10. 通过FITC-葡聚糖扩散评估通透性
注意：在断开蠕动泵后，可通过异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（FITC-dextran）通透性实验分析组织的屏障功能。FITC-dextran通透性评估方法参考自Deinhardt-Emmer等人的研究4。
- 配制异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖储备液（分子量为3-5 kDa，表1）。
- 排空储液池，并将芯片从灌注系统中断开。
- 用不含酚红的培养基更换上室和下室中的培养液。
注意：如果实验过程中已使用不含酚红的培养基，则此步骤可省略。 - 向含有C2BBe1细胞的室中加入350 µL浓度为1 mg/mL的FITC-葡聚糖溶液。
- 封闭进样口，将芯片置于37 °C孵育60分钟，确保上皮侧朝上。
- 孵育结束后，分别收集芯片两个腔室中的培养基，避光保存于4 °C，直至进行检测。
- 检测时，在C2培养基和不含酚红的EC条件培养基中配制标准曲线，FITC-葡聚糖浓度范围为1,000 µg/mL至0 µg/mL，进行11次连续的1:2倍比稀释。
- 将每种样品各200 µL转移至底部透明的黑色96孔板中。使用酶标仪在激发波长495 nm、发射波长517 nm条件下测定荧光强度。
- 利用标准曲线计算各样品中FITC-葡聚糖的浓度，进而计算通透系数。
11. 免疫荧光染色
注意：可对活体组织进行显微镜观察。为便于操作，建议将生物芯片从蠕动泵上取下，并在倒置显微镜上使用长工作距离物镜。作为终点分析，可在生物芯片内对组织进行固定，用于免疫荧光染色等实验操作。
- 停止蠕动泵，打开所有腔室的储液池。排空储液池，并断开管路以及储液池与生物芯片的连接。
- 每个腔室用 500 µL 冷的 PBS +/+ 溶液清洗两次。向所有腔室中加入 500 µL 冰甲醇，在 -20 °C 下孵育 15 分钟。然后，每个腔室用 500 µL PBS +/+ 溶液清洗两次。
注意：其他固定方法，如使用 4% 多聚甲醛或 Carnoy 固定液，也同样适用。固定后，芯片可在 4 °C 下保存，或直接进行免疫荧光染色。警告：甲醇或多聚甲醛等固定试剂具有毒性，相关操作应在通风橱中进行，并妥善收集废液。 - 按照步骤 9.2 所述方法打开芯片以获取组织。将含有组织的 PET 膜切成最多三块，以便使用不同的免疫染色组合平行染色。
- 使用精密镊子将每一片膜转移至含有封闭和通透溶液的独立 24 孔板中（表 1）。确保在整个染色过程中，目标细胞层始终朝上。在室温下孵育 30 分钟。
注意：为获得最佳染色效果，建议封闭血清与二抗来源相匹配。例如，若二抗来源于山羊，则推荐使用正常山羊血清。 - 将膜片转移至湿盒内的洁净载玻片上。在染色溶液（表 1）中配制一抗组合，每片膜上加 50 µL。在 4 °C 下孵育过夜。
注意：不同厂家和克隆的一抗，其最佳浓度和染色效果可能存在差异。建议在二维细胞培养体系中预先测试染色组合。 - 孵育结束后，将样品转移至 24 孔板中，用洗涤液（表 1）轻轻清洗膜片，每次 5 分钟，共洗 3 次。
- 再次将膜片转移至湿盒内的洁净载玻片上。在染色溶液（表 1）中配制二抗组合，每片膜上加 50 µL。如需，可加入核复染试剂，如 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）或 Hoechst。在室温下孵育 30 分钟。
注意：操作荧光染料时，应避免光照以防止荧光淬灭，从而提高成像质量。 - 孵育结束后，将样品转移至 24 孔板中，用洗涤液（表 1）轻轻清洗 2 次，每次 5 分钟。然后用 PBS +/+ 溶液清洗一次，持续 5 分钟。
- 使用荧光封片剂和盖玻片将膜片封固在洁净载玻片上。4 °C 避光保存，直至进行显微成像。
结果
这些代表性结果展示了器官芯片模型中肠组织的不同层次结构。组织经免疫荧光染色处理，具体步骤见方案第11部分。图像采用落射荧光显微镜或共聚焦荧光显微镜进行z轴层扫采集，并处理为正交投影图。显微镜设备及软件的详细信息请参见材料表。图5显示了血管层，即由HUVECs和巨噬细胞构成的具有屏障功能的内皮单层。代表性细胞标志物包括内皮细胞的VE-钙黏蛋白（VE-Cadherin）和血管性血友病因子（von Willebrand factor），以及巨噬细胞的CD68，均已进行染色标记。图6和图7展示了由C2BBe1细胞构成的三维上皮层。通过E-钙黏蛋白（E-Cadherin）和ZO-1染色证实了组织完整性。所有预期组织标志物及组织极性的详细分析可参见Maurer等人的研究6。图8展示了一张缺乏肠绒毛样三维结构外凸生长的典型图像。与典型的三维细胞层（图6）相比，其染色细胞核数量显著减少，细胞仅以单层形式存在。该特定表型是通过在细胞培养基中添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂以抑制细胞增殖而形成的。屏障通透性通过FITC-葡聚糖渗透实验进行评估。如图9A所示，在机会性致病菌C. albicans感染后，通透性增加。感染导致细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10在血管腔培养基上清液中的释放量增加（图9B）8。
图5：器官芯片中肠组织血管侧固定后的图像。 灌注五天后血管屏障的代表性免疫荧光图像。组织经甲醇固定，使用落射荧光显微镜采集1 µm切片的z轴层扫图像，并展示该z轴层扫图像的正交最大投影图。(A) 细胞核内的DNA用DAPI染色。(B) 完全分化的单核细胞来源的巨噬细胞表达CD68，并广泛分布于血管组织中。(C) 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）形成连续的单层结构，通过形成如VE-钙黏蛋白等黏附连接结构显示组织完整性。此外，(D) HUVECs高表达血管性血友病因子。最后，(E) 所有标志物的信号在叠加图像中显示。比例尺 = 100 µm。缩写：DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；HUVECs = human umbilical venous endothelial cells。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6：器官芯片中固定后的肠上皮侧。 在灌注培养5天后，极化上皮细胞层的代表性免疫荧光图像，显示连接蛋白E-Cadherin和ZO-1的表达。组织使用甲醇固定，通过落射荧光显微镜获取1 µm切片的z轴层扫图像，并展示其正交最大投影图。(A) 细胞核中的DNA用DAPI染色。紧密的上皮屏障由以下结构形成：(B) 用E-Cadherin标记的黏附连接，以及(C) 用ZO-1标记的顶端紧密连接。如(D) 叠加图像所示，紧密连接与黏附连接在细胞顶端膜处共定位。比例尺 = 100 µm。缩写：DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：肠芯片上固定后的上皮侧，呈现绒毛样外凸结构。 灌注六天后三维上皮细胞层的代表性免疫荧光图像。组织使用Carnoy固定液进行固定。使用共聚焦激光扫描显微镜获取1 µm切片的z轴层扫图像，并显示（A）该z轴层扫图像的正交最大投影。细胞核中的DNA用Hoechst染色。此外，组织还用麦芽凝集素（wheat germ agglutinin, WGA）染色，该凝集素可标记人黏蛋白。（B）在z轴层扫图像的x轴和y轴切片中可观察到上皮细胞形成的绒毛样和隐窝样结构的三维生长形态。比例尺 = 50 µm。缩写：WGA = wheat germ agglutinin。 请点击此处查看该图的放大版本。
图8：芯片肠道上皮侧固定后无绒毛样突起。 经组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA）处理的上皮细胞层的代表性免疫荧光图像，该处理可抑制细胞增殖。组织经甲醇固定。使用落射荧光显微镜获取1 µm切片的z轴层扫图像，并展示该z轴层扫图像的正交最大投影图。(A) 细胞核中的DNA用DAPI染色。(B) 中，黏附连接用E-钙黏蛋白染色；(C) 中，紧密连接用ZO-1染色。如叠加图像(D) 所示，紧密连接与黏附连接共定位。比例尺 = 100 µm。缩写：DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击此处查看该图的放大版本。
图9：整合的先天免疫细胞对病原体依赖性免疫反应： 本图修改自 Kaden 等人8。对未感染（-）或感染（+）C. albicans SC5314 的肠芯片模型分析了（A）FITC-葡聚糖（3-5 kDa）的通透性以及（B）细胞因子的分泌情况。请点击此处查看此图的放大版本。
| 溶液/培养基 | 成分 | |
| 胶原蛋白储备液 | 0.5 mg/mL IV型胶原溶于0.5 mM乙酸 | |
| Iso缓冲液 | PBS -/-, 1 mg/mL 牛血清白蛋白V组分, 2 mM EDTA | |
| 单核细胞分化培养基 | 造血细胞培养基 + 10% 人自体血清 + 10 ng/mL 重组巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF) + 10 ng/mL 重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) | |
| 胰蛋白酶消化试剂 | 0.25% 胰蛋白酶 + 1 mM EDTA 溶于 PBS -/- | |
| 单核细胞脱落试剂 | 4 mg/mL 利多卡因 + 5 mM EDTA 溶于 PBS -/- | |
| 内皮细胞条件培养基 | 内皮细胞培养基 +10% 人自体血清 +10 ng/mL M-CSF + 10 ng/mL GM-CSF | |
| C2培养基 | DMEM高糖（4.5 g/L）+ 10% FBS + 1% GlutaMax + 1% MEM非必需氨基酸溶液 + 1 mM 丙酮酸钠 + 10 µg/mL 人全转铁蛋白 | |
| 异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖储备液 | 1 mg/mL 溶于预热的无酚红C2培养基 | |
| 封闭与通透溶液 | 3% 正常驴血清（NDS）+ 0.1% 皂苷溶于 PBS +/+ | |
| 染色溶液 | 0.3% 正常驴血清（NDS）+ 0.1% 皂苷溶于 PBS +/+ | |
| 洗涤溶液 | 0.1% 皂苷溶于 PBS +/+ | |
| 卡诺伊固定液 | 60% 乙醇，30% 氯仿，10% 冰乙酸 | |
表1：本实验方案中所用溶液的列表及成分。 缩写：PBS -/- = 不含镁和钙的杜氏磷酸盐缓冲液。
讨论
本方案详细介绍了构建具有免疫活性的肠芯片模型所需的各个步骤。我们描述了具体的技术方法以及可能的检测手段，包括免疫荧光显微镜、细胞因子和代谢物分析、流式细胞术、蛋白质和基因分析，以及通透性测定。
该模型由原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）、单核细胞来源的巨噬细胞和单核细胞来源的树突状细胞组成，并与一层三维培养的肠上皮细胞共培养，后者包含分泌黏液型、吸收型、肠内分泌型以及类似潘氏细胞的细胞群体，如先前研究所述6,14。在执行本实验方案的各个步骤时，需注意若干关键要点。在整个操作过程中，应避免微流控系统中产生气泡。因此，在操作生物芯片或管路时，始终采用反向移液法（从第二停点吸取液体，并仅释放至第一停点）。为防止对生物芯片内的细胞造成过高压力或剪切力，移液时务必轻柔操作，并在向生物芯片内加样时保持相对腔室处于封闭状态（例如，在更换上腔培养基时，应使用相应塞子封闭下腔）。该生物芯片允许在聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜的两侧接种细胞。因此，该模型可构建为在PET膜下方形成类似肠绒毛结构，或在膜表面向上生长。根据具体研究需求，细胞的某种取向可能在物理相互作用方面具有特定优势，例如借助重力促进悬浮于流动培养基中的循环细胞在膜上的黏附。
由于微流控介质流动，极化的肠细胞形成类似隐窝样和绒毛样的三维组织结构，通过紧密连接和黏附连接构成的致密网络形成强大的顶端组织屏障6此外，整合的先天免疫细胞可增强肠道屏障功能，并能够详细研究细胞因子和免疫细胞对各种刺激的反应，包括供体特异性的免疫反应3,6该模型提供了一个生理学上相关的平台，用于研究微生物共生体（例如， 鼠李糖乳杆菌6）和病原体（例如， 白色念珠菌6,8 人类肠道的模型被用于研究肠道微生物组成变化的机制以及黏膜免疫反应的调控。6在本研究中，我们展示了如何重建肠腔的生理性免疫耐受，并支持活体微生物的稳态定植。此外，通过在模型腔面预先定植益生菌 鼠李糖乳杆菌 组织侵袭能力降低 白色念珠菌 并限制其向血管区室的转位，类似于 体内 该研究证实了该模型在生理相关条件下研究肠道微生物相互作用、免疫反应及致病机制方面的潜力。 体外.
然而，该芯片平台仍存在局限性，即使用了源自癌症的肠道细胞，这些细胞无法完全代表人体肠道，以及使用了原代内皮细胞和免疫细胞。可通过在灌注条件下将模型置于低氧培养箱中培养，以建立低氧环境，从而更真实地模拟生理情况。 体内 人体肠道状况
与其他器官芯片（OoC）平台相比，例如 Kim 等人发表的"肠芯片"模型14,15，本研究所构建的组织模型起始细胞数量约高出10倍。例如，这使得在单次实验中可同时分析多达三个免疫荧光染色面板。较高的细胞数量还有助于简化终点分析，包括流式细胞术、蛋白质印迹分析以及其他现成的标准检测方法，如需要细胞培养上清液的细胞因子谱分析和乳酸脱氢酶（LDH）测定。单次实验获得多种读数可降低总体成本并缩短实验时间。由于该生物芯片平台采用标准化设计，具备行业通用的接口和尺寸（芯片为显微镜载玻片规格，接口为鲁尔锁（luer lock）格式，并按96孔板矩阵排列），因此可兼容来自众多制造商的现成硬件解决方案。这还包括多种不同材料和孔径大小的膜。孔径大小可影响细胞生长和组织完整性16，以及细胞迁移能力。
总之，本方案介绍了一种详细且可调节的肠芯片模型，可模拟人体肠道环境的关键要素。该模型提供了一个可扩展且高效的平台，用于深入开展肠道微生物群与肠道宿主组织的相关研究，尤其聚焦于宿主免疫反应及肠道病理生理学。因此，该模型能够弥合传统 体外 模型与人类生物学，使其成为肠道生物学深入研究的重要工具。
披露
M.R. 是 Dynamic42 GmbH 的首席执行官，并持有该公司股权。A.S.M. 是 Dynamic42 GmbH 的科学顾问，并持有该公司股权。
致谢
本工作由合作研究中心PolyTarget 1278（项目编号316213987）为V.D.W.和A.S.M.提供资金支持。A.F.和A.S.M.还感谢德国卓越战略计划下的卓越集群“"微生物组平衡"”提供的额外资金支持——卓越集群EXC 2051，项目编号690 390713860。我们感谢Astrid Tannert以及耶拿生物光子学与成像实验室（JBIL）为我们提供使用其蔡司共聚焦激光扫描显微镜ZEISS LSM980的机会。图1C 和图2使用Biorender.com制作。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔板，黑色，透明底 | 赛默飞世尔科技 | 10000631 | 耗材 |
| 乙酸 | Roth | 3738.4 | 化学品 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure 山羊抗小鼠 IgG（H+L） | 杰克逊免疫研究公司 | 715-545-150 | 次级抗体血管染色与上皮染色 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure，驴抗兔IgG（H+L） | 杰克逊免疫研究公司 | 711-605-152 | 二抗上皮染色 |
| Alexa Fluor 647，驴抗兔IgG（H+L） | 赛默飞世尔科技，英坦科技 | A31573 | 二抗血管染色 |
| Axiocam ERc5s 相机 | 蔡司 | 426540-9901-000 | 技术设备 |
| 无酚红基础培养基 MV | Promocell | C-22225 | 细胞培养耗材 |
| 生物芯片 | 动态 42 | BC002 | 微流控耗材 |
| BSA 第 V 组分 | Gibco | 15260-037 | 细胞培养耗材 |
| C2BBe1（Caco-2 克隆） | ATCC | CRL-2102 | 上皮细胞来源 |
| 氯仿 | Sigma | C2432 | 化学品 |
| CO2 培养箱 | Heracell | 150i | 技术设备 |
| 人胎盘IV型胶原蛋白 | Sigma-Aldrich | C5533 | 细胞培养耗材 |
| 盖玻片（24 × 40 mm；#1.5） | Menzel-Glä血清 | 15747592 | 耗材 |
| Cy3 AffiniPure，驴抗山羊IgG（H+L） | 杰克逊免疫研究公司 | 705-165-147 | 二抗血管染色 |
| Cy3 AffiniPure，驴抗大鼠IgG（H+L） | 杰克逊免疫研究公司 | 712-165-150 | 二抗上皮染色 |
| 德科赛普特 PUR | Dr. Schuhmacher | 00-323-100 | 细胞培养耗材 |
| DMEM高糖 | Gibco | 41965-062 | 细胞培养耗材 |
| DMEM高糖无酚红培养基 | Gibco | 31053028 | 细胞培养耗材 |
| DPBS (-/-) | Gibco | 14190-169 | 细胞培养耗材 |
| DPBS (+/+) | Gibco | 14040-133 | 细胞培养耗材 |
| EDTA 溶液 | Invitrogen | 15575-038 | 细胞培养耗材 |
| 内皮细胞生长培养基 | Promocell | C-22020 | 细胞培养耗材 |
| 内皮细胞生长培养基添加剂混合物 | Promocell | C-39225 | 细胞培养耗材 |
| 乙醇 96%，未变性 | Nordbrand-Nordhausen | 410 | 化学品 |
| 胎牛血清 | invitrogen | 10270106 | 细胞培养耗材 |
| 异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖（3-5 kDa） | Sigma Aldrich | FD4-100MG | 化学品 |
| 荧光封片剂 | Dako | S3023 | 化学品 |
| 庆大霉素（10 mg/mL） | Sigma Aldrich | G1272 | 细胞培养耗材 |
| GlutaMAX 补充剂（100 倍浓缩） | Gibco | 35050061 | 细胞培养耗材 |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | 细胞培养耗材 |
| Hoechst（双苯并咪唑）H33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | 上皮染色 |
| 全转铁蛋白（5 mg/mL），转铁蛋白，全型，人血浆 | 默克密理博 | 616397 | 细胞培养耗材 |
| 人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | 300-30 | 细胞培养耗材 |
| 人重组 M-CSF | Peprotech | 300-25 | 细胞培养耗材 |
| 照明装置 | Zeiss | HXP 120 C | 荧光显微镜设置 |
| 激光扫描显微镜 | Zeiss | CLSM980 | 荧光显微镜设置 |
| 盐酸利多卡因 | Sigma-Aldrich | L5647 | 细胞培养耗材 |
| 脂多糖（LPS） | Sigma | L2630 | 细胞培养耗材 |
| Loftex 湿巾 | Loftex | 1250115 | 耗材 |
| 低吸附管（聚苯乙烯，5 mL） | Falcon | 352052 | 耗材 |
| 顶部盖帽用鲁尔接头（M） | Mo Bi Tec | M3003 | 微流控耗材 |
| 雄性迷你鲁尔接头塞，四联排，聚丙烯材质，不透明 | 微流控芯片实验室 | 09-0556-0336-09 | 微流控耗材 |
| MEM非必需氨基酸溶液 | Gibco | 11140 | 细胞培养耗材 |
| 甲醇 | Roth | 8388.2 | 化学品 |
| 显微镜 | Zeiss | Axio Observer 5 | 荧光显微镜设置 |
| 显微镜载玻片 | Menzel | MZ-0002 | 耗材 |
| 单克隆小鼠抗人CD68抗体（KP1） | 赛默飞世尔科技，英坦科技 | 14-0688-82 | 初级抗体血管染色 |
| 单克隆大鼠抗人E-钙黏蛋白抗体（DECMA-1） | Sigma-Aldrich，Millipore | MABT26 | 一抗上皮染色 |
| Multiskan Go 酶标仪 | 赛默飞世尔科技 | 51119300 | 技术设备 |
| 正常驴血清 | Biozol | LIN-END9010-10 | 化学品 |
| 光学切片 | Zeiss | ApoTome | 荧光显微镜设置 |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Gibco | 15140-122 | 细胞培养耗材 |
| 凝胶塞 | Cole Parmer | GZ-45555-56 | 微流控耗材 |
| 多克隆山羊抗人血管内皮钙黏蛋白抗体 | R&D Systems | AF938 | 初级抗体血管染色 |
| 多克隆兔抗人血管性血友病因子抗体 | Dako | A0082 | 初级抗体血管染色 |
| 多克隆兔抗人 ZO-1 抗体 | 赛默飞世尔科技，英坦科技 | 61-7300 | 一抗上皮染色 |
| 电源显微镜 | Zeiss | Eplax Vp232 | 荧光显微镜设置 |
| Primovert 显微镜 | Zeiss | 415510-1101-000 | 技术设备 |
| Reglo ICC 蠕动泵 | Ismatec | ISM4412 | 技术设备 |
| SAHA（伏立诺他） | Sigma Aldrich | SML0061-25MG | 化学品 |
| 皂苷 | Fluka | 47036 | 化学品 |
| S-Monovette，7.5 mL Z-凝胶管 | Sarstedt | 01.1602 | 耗材 |
| S-Monovette，9.0 mL K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | 耗材 |
| 丙酮酸钠 | Gibco | 11360-088 | 细胞培养耗材 |
| 4.5 mL 储液罐 | ChipShop | 10000079 | 微流控耗材 |
| 0.4% 台盼蓝染色液 | Invitrogen | T10282 | 细胞培养耗材 |
| 胰蛋白酶 | Gibco | 11538876 | 细胞培养耗材 |
| 导管 | 动态 42 | ST001 | 微流控耗材 |
| 镊子（PräDUMONT 弯头镊子 Inox08，5/45，0.06 mm | Roth | K343.1 | 耗材 |
| 麦胚凝集素（WGA） | 赛默飞世尔科技，英坦科技 | W32464 | 上皮染色 |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | 细胞培养耗材，造血细胞培养基 |
| 细胞培养多孔板，24 孔，无菌 | Greiner Bio-One | 662 160 | 耗材 |
| 细胞培养多孔板，6 孔，无菌 | Greiner Bio-One | 657 160 | 耗材 |
| Zen Blue 软件 | Zeiss | 版本 3.7 | 显微镜软件 |
参考文献
- Alonso-Roman, R., et al. Organ-on-chip models for infectious disease research. Nat Microbiol. 9 (4), 891-904 (2024).
- Fahrner, R., Groger, M., Settmacher, U., Mosig, A. S. Functional integration of natural killer cells in a microfluidically perfused liver on-a-chip model. BMC Res Notes. 16 (1), 285(2023).
- Raasch, M., et al. Microfluidically supported biochip design for culture of endothelial cell layers with improved perfusion conditions. Biofabrication. 7 (1), 015013(2015).
- Deinhardt-Emmer, S., et al. Co-infection with Staphylococcus aureus after primary influenza virus infection leads to damage of the endothelium in a human alveolus-on-a-chip model. Biofabrication. 12 (2), 025012(2020).
- Kaden, T., et al. Generation & characterization of expandable human liver sinusoidal endothelial cells and their application to assess hepatotoxicity in an advanced in vitro liver model. Toxicology. 483, 153374(2023).
- Maurer, M., et al. A three-dimensional immunocompetent intestine-on-chip model as in vitro platform for functional and microbial interaction studies. Biomaterials. 220, 119396(2019).
- Hoang, T. N. M., et al. Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection. Biomaterials. 283, 121420(2022).
- Kaden, T., et al. Modeling of intravenous caspofungin administration using an intestine-on-chip reveals altered Candida albicans microcolonies and pathogenicity. Biomaterials. 307, 122525(2024).
- Shah, P., et al. A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface. Nat Commun. 7, 11535(2016).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
- Mosig, S., et al. Different functions of monocyte subsets in familial hypercholesterolemia: Potential function of cd14+ cd16+ monocytes in detoxification of oxidized ldl. FASEB J. 23 (3), 866-874 (2009).
- Peterson, M., Mooseker, M. Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeieton of the c2bbe clones of the human intestinal cell line, caco-2. J Cell Sci. 102, Pt 3 581-600 (1992).
- Shin, W., Hinojosa, C. D., Ingber, D. E., Kim, H. J. Human intestinal morphogenesis controlled by transepithelial morphogen gradient and flow-dependent physical cues in a microengineered gut-on-a-chip. iScience. 15, 391-406 (2019).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol (Camb). 5 (9), 1130-1140 (2013).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
- Karra, N., Fernandes, J., James, J., Swindle, E. J., Morgan, H. The effect of membrane properties on cell growth in an 'airway barrier on a chip'. Organs-on-a-Chip. 5, 10025(2023).
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