本文介绍了一种针对经活性羰基物种修饰的氨基酸残基进行优化与参数化的实验方案，该方案可适用于蛋白质体系。本方案的步骤包括结构设计与优化、电荷分配、参数构建以及蛋白质体系的准备。
本文内容
摘要
摘要
由脂质过氧化产生的活性醛引起的蛋白质羰基化会导致蛋白质交联、寡聚化和聚集，从而造成细胞内损伤、细胞功能受损，最终导致细胞死亡。这一现象已在衰老及多种与年龄相关的慢性疾病中被报道。然而，蛋白质靶标功能丧失相关的结构变化基础仍不明确。因此，本文描述了一种通过计算机模拟（in silico）构建脂肪酸氧化衍生的活性羰基物质修饰氨基酸新参数的方法。构建了半胱氨酸（Cys）、组氨酸（His）和赖氨酸（Lys）与4-羟基-2-壬烯醛（HNE）、4-羟基-2-己烯醛（HHE）以及4-氧代-2-壬烯醛（ONE）形成的呋喃环形式的迈克尔加合物，而丙二醛（MDA）则直接连接至各氨基酸残基上。该方案详细描述了每种修饰残基结构的构建、几何优化、电荷分配、缺失的键、键角、二面角参数的确定及其验证过程。结果表明，通过分子动力学模拟，结合均方根偏差（RMSD）、均方根涨落（RMSF）、二级结构预测（DSSP）和溶剂可及表面积分析（SASA）等多种方法，测量了这些脂质衍生物羰基化修饰对不同蛋白质体系（如硫氧还蛋白酶、牛血清白蛋白以及膜Zu-5-锚蛋白结构域）所诱导的结构效应。
引言
在持续探索蛋白质氧化修饰分子行为的过程中，计算化学已成为科学研究广阔领域中的一个基本支柱。该方法依赖于能够解释电子体系中物理现象的理论模型，利用数学方程描述分子的原子行为。在此背景下，蛋白质的计算模拟作为分析分子体系原子行为的关键工具脱颖而出。基于对结构行为、能量计算和构象状态1的评估，这些方法成为预测生物分子体系行为的重要战略工具。
这些模拟专门用于研究蛋白质体系的结构变化，并评估其生物功能的丧失或获得。然而，当计算方法应用于含有共价翻译后修饰所形成修饰残基的蛋白质体系时，已显示出显著的局限性。这是因为许多现有方法缺乏可适配于力场的参数资源，而这些力场需与最常用的蛋白质分子动力学模拟程序包兼容2,3,4,5,6。因此，建立标准化的、与计算软件兼容的力场自适应参数对于精确实现拓扑结构和原子坐标与系统势能方程之间的耦合至关重要7。
针对这些挑战，已采用从头计算法（ab initio）开发出一种可适用于由脂质过氧化衍生的醛类修饰氨基酸残基的新方案。该方法通过优化新残基的结构几何构型，能够为新键、键角和二面角参数分配适应性电荷，并可在AMBER等通用力场中运行。随后对这些参数进行验证，以确定该方法在分子动力学模拟应用中的一致性与稳健性。
该方法的一个显著优势在于其能够适应多种翻译后修饰，包括羰基化、磷酸化、乙酰化和甲基化等。这种灵活性不仅限于蛋白质体系，还可扩展至大分子结构，允许与原子拓扑结构和坐标信息相耦合。相比之下，以往的研究表明，标准的翻译后修饰参数化方法仅适用于特定类型的修饰，且只能从已发表的数据库中获取，无法构建新的结构8。
目前，当对具有翻译后修饰的蛋白质结构进行建模时，蛋白质结构预测与设计所面临的挑战日益凸显。描述特定氨基酸位点上修饰的参数匮乏，凸显了亟需开发并应用可适配标准参数体系的计算方法。本实验方案旨在提供一条途径，用于 计算机模拟 构建脂肪酸氧化衍生的活性羰基物种共价修饰氨基酸的新参数。这些修饰氨基酸可被通用琥珀力场（GAFF）识别，因此可用于评估 计算机模拟 这种羰基化作用对靶蛋白的结构和功能产生的影响。
方案
1. 新型修饰氨基酸的设计与优化
注意：此阶段涉及绘制修饰残基的结构并优化其能量。
- 设计修饰后的结构并优化其结构。
- 使用计算化学软件包绘制与脂质过氧化衍生的活性醛（如 HNE、HHE、MDA 和 ONE）结合的氨基酸分子。修饰完成后，在氨基酸的羧基末端绘制甲胺基团的结构；在氨基末端绘制乙酰基团，以模拟该修饰氨基酸的肽键结构，如图1所示。
- 点击结构清理图标进行结构清理。为进行结构优化，点击计算 > Gaussian 计算设置…或按Ctrl+G，然后点击General并取消勾选Write connectivity。点击Job Type > Optimization，如图2所示。在附加关键词中输入以下内容：
SCF=tight test Pop=MK iop(6/33=2) iop(6/42=6) opt
注意：此处 GaussView 会自动将 Hartree-Fock (HF) 设为泛函，基组设为 3-21G。HF 泛函在多种应用中广泛使用，尽管根据具体体系和研究者目标，也可选用其他泛函（如 M062X）。请注意，由于该分子为中性，电荷和多重度必须分别设为 0 和 1。 - 如需更改基组，请点击Method > 6-31G以选择基组。
- 若要在同一台计算机上执行优化，点击Submit。若需通过 Gaussian 终端进行优化，请输入以下命令：
g16 name_of_the_file.com & - 点击File > Save。将文件保存为适用于 Linux 的 .com 格式或适用于 Windows 的 .gjf 格式。优化完成后，打开输出文件（Windows 下为 .out，Linux 下为 .log），检查是否正常完成。文件末尾不应出现任何错误信息。
注意：若输出文件末尾无错误提示，则表明优化已正确完成。
图 1：半胱氨酸与活性羰基化合物的修饰产物。 半胱氨酸（黑色线条）分别与 HNE、HHE、MDA 和 ONE（绿色线条）发生修饰反应，并连接乙酰胺（蓝色线条）和甲基胺（红色线条）取代基团的化学结构示意图。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：用于优化合成修饰残基的菜单。 本参考图像展示了实验方案中步骤 1.1 的内容，即在 Gaussian 程序中对修饰结构进行优化的步骤。请点击此处查看该图的放大版本。
2. 修饰氨基酸残基的参数化
- 使用 AmberTools 16 软件包或可用版本中的 antechamber 程序创建 prepin 文件。参见 图 3 以了解 prepin 文件应有的外观。
antechamber -i init-gau.log -fi gout -o u00.prepin -fo prepi -c resp -s 2 -rn U00 -at gaff2 -nc 0
注意：此后，斜体文本对应于文件名，可根据研究人员的标准进行更改。本例中，init-gau.log 是优化后获得的文件。 - 构建参数文件时，输入以下命令：
parmchk -i u00.prepin -f prepi -o u00.frcmod
此时请确认已成功生成 .frcmod 文件。参见 图 3 以了解 .frcmod 文件可能的示例。 - 构建库文件
- 使用 xleap 命令打开 XLEaP（宇宙编辑器），将弹出一个类似 图 4 所示的窗口。然后按照以下步骤生成包含相关数据的库文件。输入以下命令：
source leaprc.gaff2
loadamberparams u00.frcmod
loadamberprep u00.prepin
list
注意：使用 list 命令验证是否已成功创建 U00 文件。 - 通过输入以下命令编辑修饰结构的末端，并调整所得电荷：
edit U00
此时将显示一个图形界面（参见 图 4）。 - 选择 擦除 选项。点击第 1.1 步中添加的乙酰基和甲胺基末端的原子以将其删除（参见 图 4 以了解修饰残基的羧基和氨基末端应呈现的形态）。
- 电荷中和
- 此时，由于第 2.3.3 步中原子的移除，分子电荷不再中性，该电荷来源于羧基末端和氨基末端。为中和氨基末端和羧基末端的电荷，请按以下步骤操作。
- 为获得总电荷值（参见图 5），输入：
charge U00
将所得电荷值除以 2，取其绝对值作为总电荷值。 - 在图形界面中选择 整个分子。点击 显示 > 名称。点击 编辑 > 编辑所选原子。此时应弹出一个表格窗口。
- 验证 N 端和 C 端原子的名称。在表格中，填入上一步计算所得的电荷值（绝对值；参见 图 5）。然后点击 表格 > 保存并退出以保存并退出。
- 确保电荷为零（参见 图 5）：
charge U00 - 退出程序并保存库文件，请输入：
desc U00
saveoff U00 u00.lib
quit - 验证库文件（.lib）是否已正确创建（参见 图 6 作为参考）。
- 使用 xleap 命令打开 XLEaP（宇宙编辑器），将弹出一个类似 图 4 所示的窗口。然后按照以下步骤生成包含相关数据的库文件。输入以下命令：
- 按照以下说明，使用新参数构建修饰残基的 pdb 文件。
tleap
source leaprc.gaff2
loadamberparams u00.frcmod
loadoff u00.lib
x = U00
savepdb U00 from-lib.pdb
quit - 蛋白质的准备
- 下载待修饰蛋白质的 PDB 文件。本例中选择硫氧还蛋白作为模型蛋白系统（PDB ID：2IFQ）。使用合适的蛋白可视化软件删除水分子、二聚体（如需要）、配体等。
注意：此步骤可在 UCSF Chimera 或 Discovery 等可视化软件中完成。 - 添加 from-lib.pdb 文件（第 2.4 步所得），并将其叠加到待修饰的氨基酸残基上（如 图 7 所示）。确保 from-lib.pdb 的氨基和羰基末端与待修饰氨基酸匹配。
- 删除蛋白质，仅保留 from-lib.pdb 文件在待修饰残基所占的三维空间中。从 N 端和 C 端原子上移除 H 原子。
- 将 from-lib.pdb 以新坐标另存为 u00-moved.pdb。
- 在保存修饰残基的坐标后，使用文本编辑器打开 u00-moved.pdb 和之前清理过的蛋白质 PDB 文件。本例中使用 Notepad++ v8.4.8 文本编辑器。
- 如 图 8 所示，从 u00-moved.pdb 中复制坐标，并粘贴到蛋白质 pdb 文件中，替换待修饰的残基。此操作旨在适配修饰残基与蛋白质系统之间的键合。
- 调整拓扑以兼容蛋白质 PDB 格式，将 HEATATM 更改为 ATOM，并将编号 1 更改为对应待修饰残基的编号。将新文件保存为 complex.pdb。
- 下载待修饰蛋白质的 PDB 文件。本例中选择硫氧还蛋白作为模型蛋白系统（PDB ID：2IFQ）。使用合适的蛋白可视化软件删除水分子、二聚体（如需要）、配体等。
- 生成修饰蛋白-残基结合连接
- 在蛋白可视化程序中打开 from-lib.pdb 文件。选择整个结构。点击 结构 > 标签 > 添加... > 确定。
- 验证分配给 N 端和 C 端原子的命名法。在另一窗口中，使用文本编辑器打开 u00.lib 文件。
- 在出现的列表中，根据分配的命名法，确认 N 端和 C 端的位置。
- 在 u00.lib 文件中，找到以下行：!entry.U00.unit.connect array int。在其下方将出现两个数字。将第一个数字更改为 N 端的位置，第二个数字更改为 C 端的位置，然后保存。
- 通过输入以下命令创建参数列表：
tleap
source leaprc.gaff2
source leaprc.protein.ff14SB
loadoff u00.lib
loadamberparams u00.frcmod
x = loadpdb complex.pdb
check x
注意：此时 tleap 将提供一份需要参数化的键、角度和二面角列表。 - 拓扑识别
- 在蛋白可视化软件中打开 complex.pdb 文件。选择修饰残基及其两侧相邻的残基。
注意：在蛋白质的三级结构中，修饰残基位置常出现空隙。 - 对所选残基显示球棍模型。仅对修饰残基显示命名法，如第 2.6.1 步所示。在所选文本编辑器中打开库文件（.lib）。
- 根据观察到的命名法，在库文件（.lib）中识别对应的拓扑（位于命名法旁的引号内），该拓扑应与第 2.7 步生成的键、角度和二面角参数化列表中使用的拓扑一致。
注意：在 tleap 提供的键、角度和二面角列表中，大写字母代表与修饰残基相邻的氨基酸原子。
- 在蛋白可视化软件中打开 complex.pdb 文件。选择修饰残基及其两侧相邻的残基。
- 使用 parmcal（Amber 中的一个程序）对键、角度和二面角进行参数化
注意：此步骤需使用 Amber 软件包中的 parmcal 程序。同时必须在文本编辑器中打开 frcmod 文件（u00.frcmod）和库文件。应使用蛋白可视化软件查看角度和键长。在可视化软件中选择与修饰残基相连的氨基酸残基，以生成键长、角度和二面角（参见第 2.7 步列表）。这些数据将用于在 parmcal 中计算常数，并添加至 frcmod 文件以创建参数。- 在可视化软件中生成键长和角度
- 在可视化软件中选择参与键或角度的原子。点击 结构 > 监测 > 距离或角度。
- 对每个需添加的新参数执行以下操作。需输入 parmcal 的数据以粗体标出。以下为创建修饰氨基酸 N 端与相邻氨基酸 C 原子之间键参数的示例。
Parmcal
请选择：
0. 设置参数集（gaff）
1. 计算键长参数：a-b
2. 计算键角参数：a-b-c
3. 退出
0
请选择要使用的参数集：1-gaff（默认）或 2-gaff2
2
力场参数集已设置为 gaff2
请选择：
0. 设置参数集（gaff）
1. 计算键长参数：a-b
2. 计算键角参数：a-b-c
3. 退出
1
请输入 A-B 中原子 A 的元素名称
C
请输入 A-B 中原子 B 的元素名称
ns
请输入非正数形式的键长
表示将根据经验规则计算
1.455
BOND C-ns 270.256 1.455
注意：双下划线内容需复制并添加至 frcmod 文件中。本例中，将其添加至 BOND 部分最后一行下方。二面角参数根据 Alviz-Amador 等人9 报道的数值添加。 - 在创建所有键、角度和二面角参数并添加至 frcmod 文件后，保存 frcmod 文件，确保新参数已包含在内。
- 在可视化软件中生成键长和角度
- 为生成拓扑和坐标文件，输入以下命令：
tleap
source leaprc.gaff2
source leaprc.protein.ff14SB
loadoff u00.lib
loadamberparams u00.frcmod
x = loadpdb complejo.pdb
source leaprc.water.tip3p
charge x- 通过输入以下命令添加适量的 Na 或 Cl 离子以中和电荷：
addions x Na+ 5
solvateoct x TIP3PBOX 10.0
saveamberparm x prot.topo prot.coords
注意：若需添加 Cl 离子而非 Na，则将 Na+ 替换为 Cl-。5 表示需添加的离子数量，应根据电荷中和需求进行调整。
- 通过输入以下命令添加适量的 Na 或 Cl 离子以中和电荷：
- 为计算摩尔浓度，请输入：
tail -f prot.coords- 复制生成的最终行，并将其替换为以下指令中粗体部分的内容。0.15 对应目标摩尔浓度。
usr/bin/perl molarity.perl 0.15 101.3356150 101.3356150 101.3356150 109.4712190 109.4712190 109.4712190 Kconts
这将生成需添加的 Cl- 和 Na+ 离子数量，如第 2.10 步所述。此时，带有新参数的修饰氨基酸残基的拓扑和坐标文件生成完成。
- 复制生成的最终行，并将其替换为以下指令中粗体部分的内容。0.15 对应目标摩尔浓度。
图3：参数文件准备。（A）参考图像，展示在步骤2.1中生成的prepin文件的预期外观。该文件的可视化使用GNU nano文本编辑器v2.3.1完成。（B）参考图像，展示在步骤2.1中生成的frcmod文件的预期外观。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：XLEaP 窗口的参考图像。（A）显示输入所述命令后应有的响应。（B）显示需要删除的原子（黄色）以及为执行此操作需选择的选项（红色）。（C）显示删除乙酰基和甲胺基团后，修饰残基的氨基和羰基末端应有的参考图像。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：电荷中和操作流程。（A）去除乙酰基和甲胺基后总电荷的计算。（B）确定残基中原子的命名规则。注意氨基末端氮原子（N）和羧基末端碳原子（C）的命名。（C）在表格中查找这两个原子（N1 和 C3）所对应的电荷值。取这些原子的电荷值（除以 2），然后加上所得电荷的绝对值。（D）将 N1 和 C3 的电荷值替换为计算所得的新值。（E）验证最终总电荷是否为零。（所有提供的数据仅供参考，实际数值可能因修饰残基的不同而有所变化）。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：文库文件（.lib）期望结构的参考图像。 需要注意的是，所提供的图像仅展示了完整文件的简化表示。请点击此处查看该图的放大版本。
图 7：参考图像，展示 from-lib.pdb 文件的正确放置位置。 需注意，图中显示的结构包含了 N 端和 C 端的氢原子，这些应在保存文件前予以去除。该图像由 Visualizer 软件生成。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 8：PDB 文件更新。 替换残基坐标（本例中为 Cys32）操作流程的参考图示。修饰后残基的 PDB 文件指 u00-moved.pdb 文件。 请点击此处查看该图的放大版本。
结果
为了说明本方案的实施过程并评估结果，将进行以下分析。通过优化电子结构（支持部分 RESP 电荷分布）并为修饰的氨基酸残基分配新参数，构建了生成的数据集。图9展示了其中一个经参数分配优化后的氨基酸残基的结构构象。
图9：合成的 Cys-HHE 残基 in silico. HHE修饰的半胱氨酸氨基酸及其拓扑结构与坐标参数的表示 请点击此处以查看此图的放大版本。
通过 AMBER 中的分子动力学模拟，将 M062X/6-31G 理论 DFT 水平获得的结构与经典力学结构进行了比较。模拟所得各项参数均与量子力学理论数据表现出良好的相关性。平均键长误差约为 0.001 - 0.002 Å，键角误差约为 8.2°。键和角的拓扑类型、距离及力常数列于表 1中。这些数据与 Alviz-Amador 等人报道的数据文章中的结果相似9。参数文件可在 http://research.bmh.manchester.ac.uk/bryce/amber/ 获取。
| Cys-HHE | ||||||
| 方法 | 键长 | 键角 | ||||
| (Å, ± 标准差) | (°, ± 标准差) | |||||
| 量子力学计算 (QM) | S1–C4 | C6–C8 | C8–C9 | S1–C4–C5 | O2–C6–C8 | C6–C8–C9 |
| (m062x/631g(d) | 1.82 | 1.52 | 1.53 | 115.9 | 109.25 | 112.21 |
| 分子力学 (MM, AMBER) 单独氨基酸 | 1.85± | 1.55± | 1.54± | 111.66± | 109.77± | 113.16± |
| 0.002 | 0.002 | 0.002 | 0.152 | 0.14 | 0.148 | |
表1：键长和键角参数比较。 通过量子（QM）和经典方法获得的键长和键角数值无显著差异。
在生成并验证了每种修饰氨基酸残基的参数后，通过分子动力学模拟（轨迹长度为1 µs）考察其动态行为，以评估每种残基相对于其天然对应物的稳定性影响（图10）。所获得的每种修饰氨基酸的RMSD值与其天然对应物相比未显示出显著差异，并在整个轨迹过程中保持了构象稳定性。
图10: 合成残基的RMSD图 计算机模拟 未修饰及经HHE、HNE、MDA和ONE修饰的半胱氨酸残基的典型RMSD 请点击此处以查看此图的放大版本。
由修饰氨基酸残基参数化生成的文件已被用于替换在实验中证实发生羰基化的蛋白质中的天然结构氨基酸。这一替换旨在评估这些修饰可能对蛋白质结构和功能造成的影响。此前已有研究通过计算机模拟（in silico）报道了活性羰基物质对锚蛋白（Ankyrin）和硫氧还蛋白（Thioredoxin）等蛋白质系统的羰基化作用10,11。
讨论
在开发AMBER力场参数化流程中，一个关键步骤是对经脂质过氧化衍生物修饰的新氨基酸残基进行量子优化，这是由于在AMBER Antechamber中进行能量最小化以及RESP电荷分配方式会带来能量上的变异性。为此，建立了基于从头计算（ab initio）的优化方法，包括哈特里-福克方法（HF/6-31G）以及半经验密度泛函理论（DFT；B3LYP/6-31G 和 M062X/6-31G），用于评估电荷分配的响应情况。结果表明，HF泛函在计算性能与成本之间具有更优的平衡，因此被采纳为该流程的前期步骤。这一点也在Zhou等人的研究中得到了证实12。
在实施该方案的过程中可能会出现多种误差来源。修饰基团所引入的额外结构常常会产生空间位阻，进而导致误差，这类误差通常可通过分子体系的最小化步骤予以解决。另一方面，二面角参数通常在参数化过程的最后阶段进行调整，因此有时会表现为潜在的误差。针对此特定情况，建议参照Alviz-Amador9报道的方法，通过同源性调整参数，并以新格式添加，以消除此类误差。
该方法的一个局限性在于参数化的逐步开发需要耗费大量精力。从新的电子结构生成新参数，再将这些参数适配到蛋白质体系，需要投入大量精力才能良好完成。因此，在实施本方案时，一个有效的策略是遵循逐步说明，并仔细阅读指南。
在分子动力学模拟领域，AMBER 协议的重要性显而易见。其自适应性和多功能性使其成为研究人员探索广泛研究领域的有力工具。除了在蛋白质系统中的应用外，该协议还可拓展至大分子结构，为新研究方向开辟了可能。这种灵活性不仅弥补了现有标准参数化方法中的不足，还为新型结构的构建提供了途径，从而拓展了分子动力学研究的边界。相比之下，其他研究表明，传统的翻译后修饰参数化方法仅限于特定类型的修饰，且完全依赖于公开数据库中的数据8，无法生成新颖的结构。
活性羰基物质的存在所导致的修饰常与多种病理过程相关，包括癌症、代谢紊乱以及通过不同机制引发的退行性疾病13,14。本实验方案提供的支持有助于评估多种关键性质，如构象稳定性、原子柔性、二级结构的丧失、溶剂可及性以及蛋白质-蛋白质相互作用能等。因此，在羰基化蛋白质可能诱导生物系统发生不可逆改变的情况下，测量这些性质具有重要意义，这些改变可导致构象不稳定、原子柔性增加或降低以及二级结构的丧失10,11。
综上所述，AMBER 参数化流程凭借其关键步骤、适应性和多功能性，已成为分子动力学模拟领域的一项开创性方法。尽管存在局限性，但该方法能够弥补现有方法的不足，为研究人员提供了一种强大工具，可用于探究各类生物和化学体系中分子结构与行为的复杂特性，其重要性由此得以凸显。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作由科学、技术和创新部（Minciencias）和卡塔赫纳大学（哥伦比亚）提供的研究资助项目（项目编号：1107-844-67943）支持，该资助用于支持2021年度研究团队项目及第017-2022号决议。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AmberTools16 或更高版本 | The Amber Project | Amber 是一套生物分子模拟程序 | |
| Gaussian 09 或更高版本 | Gaussian Inc | 用于绘制和优化结构 | |
| Linux Ubuntu | GNU/Linux | AmberTools 的运行平台 | |
| NVIDIA GPU GTX 1080 或更高版本 | Nvidia | 与 PMEMD 兼容 |
参考文献
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