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以分枝杆菌生物膜的培养作为研究抗菌耐药性的模型

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DOI：

10.3791/66607

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2024年7月12日

 , 
1Department of Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research

本文内容

摘要

本方案描述了一种用于形成浮膜型生物被膜的可靠方法。该方法可适用于不同的培养体积，便于针对多种实验目的进行应用。本方法的设计可实现对多种分枝杆菌物种形成生物被膜能力的定性或定量评估。

摘要

许多细菌在复杂的自然群落中繁衍生息，表现出多细胞生物的关键特征，如细胞间通讯、协作与竞争。细菌多细胞行为最常见的表现形式是生物膜的形成，这一过程常与致病性相关。生物膜为细菌提供了抵御抗菌剂的庇护所，从而促进了耐药性的产生。传统的摇瓶液体培养方法无法真实反映细菌在自然环境中的生理生长状态，因而限制了我们对其复杂生命活动的理解。值得注意的是，生物膜中细菌的代谢和转录谱与自然生长状态下的细胞高度相似。这种相似性凸显了生物膜作为基础研究和转化研究理想模型的重要意义。本文以Mycobacterium smegmatis为模式生物，重点介绍一种用于培养浮膜型生物膜的技术。该方法可适用于不同体积的培养体系，便于针对多种实验目标（如抗菌研究）进行灵活应用。此外，通过微小调整，该方法还可用于定性或定量评估不同分枝杆菌物种的生物膜形成能力。

引言

细菌可以单细胞形式存活；然而，在大多数具有生理相关性的条件下，它们会组织形成群落模拟结构。生物膜是一种广为人知的细菌群落组织形式，由聚集的细胞及其自身产生的胞外基质包裹而成1。这种结构具有早期多细胞性的特征，并赋予细菌系统更强的抗逆能力。生物膜通常对微生物抑制剂具有耐受性，据估计，约80%的微生物感染与生物膜相关2,3。

传统上，摇瓶培养和平板培养一直是细菌培养的常用方法。这些方法之所以被广泛接受并取得巨大成功，主要归因于其操作简便、可重复性强以及易于放大。然而，由于缺乏生理学背景，利用这些系统所获得的知识在转化应用方面受到一定限制4。因此，生物膜正逐渐成为研究细菌病理生理学的有吸引力的模型系统。生物膜提供了一种动态的模型系统，能够高度模拟自然环境，使研究人员得以重现诸如营养梯度和空间异质性等生理特征5,6。

生物膜生活方式在分枝杆菌研究中尤为重要，因为包括臭名昭著的Mycobacterium tuberculosis在内的分枝杆菌均具有很强的生物膜形成能力7。它们在生物膜内旺盛生长的能力有助于在感染期间持续存在于宿主组织中，这给分枝杆菌病的治疗带来了巨大挑战，因为生物膜生活方式本身具有固有的抗生素耐药性8。此外，生物膜也为研究分枝杆菌的代谢提供了理想的模型系统，使其能够在复杂的微生物群落中探究分枝杆菌所采用的独特代谢适应机制和营养利用策略9。

尽管生物膜正逐渐被接受为研究分枝杆菌的更佳模型系统10，但仍需要建立一致且可重复的标准操作程序，特别是在不同实验室开展的研究之间进行比较时尤为必要。本文所述方法描述了一种分枝杆菌物种——M. smegmatis的生物膜形成操作流程。M. smegmatis由于无致病性且生物膜形成动力学较快，是研究分枝杆菌生物膜的更易操作的模型。该方法可根据需要进行调整，适用于抗分枝杆菌药物筛选、代谢物提取以及组学研究等应用。

方案

本研究中使用的所有试剂和设备的详细信息均列在材料表中。

1. 索森培养基的制备

  1. 通过精确称取1.25 g磷酸二氢钾，溶于50 mL去离子水中，配制50 mL的2.5%磷酸二氢钾溶液。
  2. 称取2.56 g硫酸镁，溶于50 mL去离子水中，配制50 mL的2.5%硫酸镁溶液。
  3. 称取0.5 g柠檬酸铁铵，溶于10 mL去离子水中，配制10 mL的5%柠檬酸铁铵溶液。将其储存于棕色试管中。
  4. 称取20 g葡萄糖，溶于100 mL去离子水中，配制100 mL的20%葡萄糖溶液。使用50 mL无菌注射器和0.2 µM PVDF针头滤器在试管中进行过滤除菌。
  5. 精确称取0.1 g硫酸锌，溶于10 mL去离子水中，配制10 mL无菌的1%硫酸锌溶液。在超净台中使用10 mL无菌注射器和0.2 µM PVDF针头滤器进行过滤除菌。
  6. 按照表1所述，将上述配制好的组分加入750 mL去离子水中。测定溶液pH值，并调节至7。再用去离子水定容至900 mL。
  7. 将培养基在15 PSI、121 °C条件下高压灭菌15–20分钟。待其冷却后，加入100 µL过滤除菌的1%硫酸锌溶液，再加入100 mL过滤除菌的20%葡萄糖溶液，并充分溶解。

2. 过滤除菌的5%吐温-80溶液的制备

  1. 将 0.5 mL 吐温-80 溶解于 9.5 mL 去离子水中。
  2. 在超净工作台中，使用 10 mL 无菌注射器和 0.2 µM 聚偏二氟乙烯（PVDF）针头滤器对溶液进行过滤除菌。

3. 原代培养的制备

  1. 在超净工作台中，使用刻度移液管将 2 mL 经高压灭菌的 LB 培养基加入两个无菌的 14 mL 试管中。
  2. 使用微量移液器向试管中加入 20 µL 经滤膜灭菌的 5% 吐温-80。
  3. 用接种环取 M. smegmatis 冻存菌液，接种至其中一支试管中；另一支试管作为空白培养基对照。
  4. 将试管置于摇床培养箱中，在 300 rpm、37 °C 条件下培养 48 小时。
    注意：空白培养基对照管不应出现任何菌体生长。

4. 准备二次培养

  1. 在超净工作台中，使用刻度移液管将 2 mL 经高压灭菌的 LB 培养基加入两个无菌的 14 mL 试管中。
  2. 使用微量移液器向试管中加入 20 µL 经滤膜除菌的 5% Tween-80。
  3. 使用微量移液器将 20 µL 初始培养物加入其中一支试管中，另一支试管作为空白培养基对照。
  4. 将培养物置于摇床 培养箱中，在 300 rpm、37 °C 条件下振荡培养，直至其 OD600 达到 0.6 至 0.8。
    注意：通常需要 12 至 14 小时达到 OD600 0.6 至 0.8。也可使用其他细胞密度，但设定明确的 OD600 值有助于进行比较研究。

5. 建立生物膜

  1. 在超净工作台中，使用血清移液管将6 mL添加了2%葡萄糖的Sauton培养基加入6孔板的每个孔中。
  2. 使用微量移液器向各孔接种120 µL（即2%）的继代接种物。保留一个未接种的孔作为培养基对照。
  3. 用1 mL微量移液器反复吹打，混匀培养基和菌液。盖上盖子，并用封口膜小心密封6孔板。
  4. 将6孔板置于37 °C的静止培养箱中，静置培养7天。

6. 为特定阶段观察建立生物膜

注意：总体生物膜实验设置与步骤5中所述相同。若需在不同时间点收集或成像生物膜，建议在多个独立的培养板上分别设置相同的生物膜实验组。

  1. 为观察第3天至第6天的生物膜，需准备四块条件相同的培养板，每天使用其中一块进行成像。
    注意：自培养板制备的第三天起，空气-培养基界面处开始出现生物膜层。

7. 生物膜发育的评估

  1. 目测法
    1. 使用凝胶成像系统在透射白光照明下对平板进行成像（图1）。
      注：成像可对形成的生物膜进行粗略的定性与定量评估。也可使用任何高质量的相机作为替代。
  2. 干重法
    1. 通过干重测定实现更精确的定量分析。
    2. 测量干重时，首先称量一张吸水纸的重量。
      注：也可使用滤纸代替吸水纸。
    3. 用刮铲从6孔板中取出生物膜，并将其转移至纸上。
    4. 小心收集培养物中的大部分生物膜，注意避免将过多培养基转移到纸上。
    5. 将生物膜置于吸水纸上。
    6. 将样品置于50 °C培养箱中0.5–1小时，直至生物膜完全干燥。
    7. 测量纸张与生物膜的总重量。
      注：生物膜干重 =（生物膜 + 纸张重量）－（纸张重量）

8. 生物膜中抗生素耐受性检测

  1. 根据 Irith Wiegand 等人描述的方案，使用 Sauton 培养基测定利福平对浮游培养的 M. smegmatis 的 MIC9011。当培养物的 OD600 达到 0.2 时加入抗生素。
  2. 按照方案第 5 步所述设置用于生物膜生长的培养板。
  3. 在培养的第四天，使用移液器在超净台中从孔的侧边向培养物中加入 MIC90 浓度（64 µg/mL）的利福平。
    注意：操作时需小心，避免过度扰动生物膜。保留一个含有生物膜的孔不作处理作为对照。
  4. 缓慢摇动培养板以混匀抗生素。
  5. 用石蜡膜封住培养板边缘，并将其放回培养箱中继续培养。
  6. 24 小时后，从超净台中取出培养板，并向所有含生物膜的孔中加入 Tween-80，使其终浓度为 0.2%。
  7. 再次用石蜡膜封住培养板，置于 4 °C、100 rpm 条件下孵育 12 小时。
  8. 在超净台中取出培养板，使用 1 mL 移液器充分混匀各组分。
  9. 按照 Anand 等人所述方案，使用 Sauton 培养基洗涤各组分12。
  10. 最后，将细胞重悬于 6 mL Sauton 培养基中，并稀释至终浓度分别为 10-4、10-5、10-6 和 10-7。
  11. 使用经高压灭菌的玻璃珠，将每种稀释液各 100 µL 涂布于 LB-琼脂平板上。
  12. 用石蜡膜密封所有平板，并置于 37 °C 培养箱中培养。
  13. 培养 3 天后，计数每个平板上的菌落。仅统计菌落数在 30 至 300 之间的平板。
  14. 使用提供的公式计算每毫升菌落形成单位（CFU/mL）以及 CFU/mL 的相对减少率13。
    注意：CFU/mL =（菌落数 × 稀释倍数）/（涂布体积（mL））
    CFU/mL 相对减少率 =（（未处理组 CFU/mL - 处理组 CFU/mL）/（未处理组 CFU/mL））× 100

结果

从第三天开始，生物膜菌膜可肉眼可见。尽管在不含2%葡萄糖的Sauton培养基上生物膜仍能生长，但添加葡萄糖后其网状结构明显改善。在24孔板中，每孔加入1.5 mL添加2%葡萄糖的Sauton培养基，培养四天后，我们获得每孔生物膜干重为10.48 mg ± 3.13 mg（n = 4）。在图2中，可观察到生物膜从第3天至第6天的发育过程：第3天开始形成具有轻微网状结构的薄膜，到第5天完全成熟；从第6天起，生物膜开始解体。利福平的MIC90（64 µg/mL）仅使生物膜的菌落形成单位（CFU）减少了25% ± 12%（n = 3）。

多孔板上的细胞培养分析，显微镜图像显示细胞生长模式。
图1：M. smegmatis 在 Sauton 培养基中培养 4 天后的生物膜形成情况。 （1）不含葡萄糖，接种量为 2%；（2）不含葡萄糖，接种量为 4%；（3）含 2% 葡萄糖，接种量为 2%；（4）含 2% 葡萄糖，接种量为 4%；（5）和（6）为培养基对照。本实验使用标准的 6 孔板。照片未进行任何放大拍摄。请点击此处查看该图的高清版本。

细胞培养4天的生长情况，显微镜图像，实验时间序列，生物学分析。
图2: M. smegmatis 3型生物膜形态rd 接种后第6天th 天。 此处，样品置于标准的24孔板中。照片拍摄时未进行任何放大。 请点击此处以查看此图的放大版本。

序号组分工作浓度 (w/v)储备液浓度储备液体积/重量
1磷酸二氢钾0.05%2.50%20 mL
2硫酸镁0.05%2.50%20 mL
3柠檬酸铁铵0.01%5%1 mL
4甘油6%100%60 mL
5L-天冬酰胺0.40%NA4 g
6柠檬酸0.20%NA2 g

表1：Sauton培养基制备所需组分。

讨论

微生物的多细胞生活方式几乎在一个世纪前就已被描述；然而，相关的临床研究仍然较少，主要原因是缺乏可靠的方法14。有关生物膜生物学的研究中所描述的方法往往难以适应实际应用。本文提供的详细方法结合关键步骤的演示，有望提高实验方案的可重复性。

本文所述的生物膜制备方法具有可扩展性，需要按比例增加培养基体积和接种量。对于代谢物提取等应用，需要较大的培养体积，而抗菌药物敏感性试验则需要较少的生物量12。此外，可通过调整接种量大小来调控生物膜形成的速率。这种灵活性使研究人员能够适当地控制实验持续时间。

生长条件和微环境在生物膜生理学中起着至关重要的作用15。值得注意的是，葡萄糖的存在并非形成生物膜的必要条件；然而，添加2%葡萄糖已被观察到可增强生物膜的网状结构及其稳定性。另一个有趣的发现是，在培养孔底部放置玻璃盖玻片具有促进生物膜形成的作用。在初代和继代培养中加入Tween-80对于减轻细胞聚集至关重要。

生物膜的发育包含不同的生长阶段，如附着、成熟和扩散。尽管此处描述的生物膜培养通常孵育7天，但菌膜在第3天起即可肉眼观察到。rd 从第1天开始。该设置可用于研究生物膜发育的时间动态。本文虽以干重估测法来评估生物膜生物量，但该实验体系同样适用于传统的结晶紫染色法或基于显微镜的定量分析。12,16.

分枝杆菌形成生物膜的能力在其致病性中起着重要作用，并赋予其更强的药物抗性8,17。我们观察到，与摇瓶培养相比，生物膜培养物的抗生素耐受性高出七到八倍。多个研究团队已将生物膜作为研究细菌生理学的模型系统；若分枝杆菌研究领域更广泛地采用这种生长模式，将有助于深入理解该属内多种致病菌的病理生理机制。

披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本工作由授予 Amitesh Anand 的 DBT-Ramalingaswami 研究员项目资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 µM PVDF 注射器滤器AxivaSFNY04 R
1 mL 吸头GenetixGXM-611000 C
10 µL 吸头GenetixGXM-6110 C
200 µL 吸头GenetixGXM-61200C
6 孔聚丙烯板Tarsons980010
棕色管Tarsons546051
高压灭菌器Hospharma
生物安全柜 A II 级MSET
吸水纸任何合适的供应商
离心机Eppendorf
柠檬酸Sigma251275
比色皿Bio-Rad2239955
柠檬酸铁铵SigmaF5879
凝胶成像系统Bio-Rad
玻璃珠SigmaG8772
葡萄糖Sigma49139
甘油SigmaG5516
接种环GenaxyHS81121C
L-天冬酰胺SigmaA0884
LB-琼脂HimediaM1151
LB 培养基HimediaM575
M. smegmatis mc2155 冻存菌种ATCC700084
硫酸镁SigmaM2643
微量移液器Gilson
封口膜Tarsons
培养皿Tarsons460020
pH 计Labman Scientific Instruments
酶标仪Tecan
聚丙烯试管GenaxyGEN-14100-PS
磷酸二氢钾SigmaP5379
利福平MedchemExpressHY-B0272
血清移液管SPL Life Sciences95210
摇床培养箱Eppendorf
药匙
分光光度计Thermo Scientific
恒温培养箱CARON
无菌 10 mL 注射器Becton Dickinson309642
无菌 50 mL 注射器Becton Dickinson309653
吐温-80SigmaP1754
电子天平Sartorius
硫酸锌SigmaZ0251

参考文献

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