通过差示扫描荧光法检测CD40蛋白与伞形酮的相互作用

摘要

本方案描述了一种检测化合物与蛋白质分子结合的独特方法，具有蛋白质样品损耗极小和数据准确性高的优势。

摘要

研究不同分子间的相互作用是理解疾病发病机制和筛选药物靶点的关键环节。伞形酮是藏药Vicatia thibetica中的活性成分，具有免疫调节作用，但其作用机制尚不明确。CD40蛋白是免疫反应中的关键靶点。因此，本研究采用差示扫描荧光技术原理，利用荧光酶标物分析CD40蛋白与伞形酮之间的相互作用。首先通过实验验证了蛋白荧光橙染料的稳定性，并确定最佳稀释比例为1:500。随后观察到，随着浓度增加，CD40蛋白的熔解温度（Tm值）呈下降趋势。有趣的是，CD40蛋白与伞形酮之间的相互作用可增强CD40蛋白的热稳定性。本研究首次尝试利用荧光微孔板和荧光染料检测小分子化合物与蛋白质的结合潜力。该技术具有高灵敏度和高准确性，有望推动蛋白质稳定性、蛋白质结构及蛋白质-配体相互作用领域的研究进展，从而促进后续的深入探索。

引言

Vicatia thibetica H. Boissieu 是伞形科植物，常用于藏药，是五味子基本成分之一（Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute、Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr、Vicatia thibetica H. Boissieu、Oxybaphus himalaicus Edgew. 和 Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.）¹。该植物主要分布于中国西南地区，如云南西北部、四川西部、中国台湾等地，其干燥根部在当地可作为当归的替代品¹。其根部具有芳香气味，常被用作炖菜调料；其叶片被称为藏芹，可用于制作美味菜肴。因此，Vicatia thibetica 不仅是一种重要的药用植物，也是西藏地区重要的食物来源。

国内外研究均表明 Vicatia thibetica 具有补血和 qi 具有补气（或补能）功效，有益于调经。用于治疗因心悸和血虚引起的月经不调及痛经症状，具有抗氧化、调节机体免疫等药理作用². 酒精提取物 Vicatia thibetica 已证明可恢复环磷酰胺所致免疫缺陷小鼠的体重及器官指数。此外，它可提高血清中超氧化物歧化酶的活性，并降低丙二醛含量，提示其具有增强抗氧化能力及平衡脂质过氧化的作用。^2,3同时，它能增加血细胞数量和血红蛋白含量，这不仅客观反映了机体的造血功能，还在免疫系统中发挥着重要作用。^2,3.

伞形花内酯呈针状结晶，味苦，分子量小，具有挥发性，可随水蒸气蒸馏。该物质易升华，水中溶解度低，而有机溶剂中溶解度较高。作为藏当归（Vicatia thibetica）的主要化学成分之一，伞形花内酯在氢化可的松诱导的免疫抑制小鼠模型中，对细胞免疫、体液免疫及非特异性免疫均表现出免疫调节作用^4,5。

细胞表面分子CD40属于肿瘤坏死因子受体超家族，在免疫细胞中广泛表达⁶。其同源配体CD154，也称为CD40L，是由活化的T淋巴细胞表达的一种II型跨膜蛋白。CD40的活化能够上调树突状细胞（DC）和单核细胞表面共刺激分子的表达。该过程可促进主要组织相容性复合体（MHC）分子的抗原提呈功能，进而激活CD8+ T细胞⁷。

巨噬细胞在肿瘤微环境的形成与调控中发挥关键作用，而CD40激活可增强巨噬细胞对肿瘤微环境的重塑作用⁸。CD40信号激活显著影响B细胞的增殖与活化。B细胞在CD40激活后可作为有效的抗原呈递细胞，通过呈递抗原、诱导效应T细胞活性，从而发挥抗肿瘤作用⁹。此外，肿瘤细胞中的CD40激活可诱导细胞凋亡并抑制肿瘤生长¹⁰。CD40主要通过调控非受体酪氨酸蛋白激酶（包括Lyn、Fyn、Syk等）的活性来转导信号。此外，它还能够刺激Bcl-xL、Cdk4和Cdk6蛋白的表达，激活Rel/NF-kB转录因子，并使CG-2和PI3K发生磷酸化¹⁰。

差示扫描荧光法（DSF）被广泛用于评估各种环境条件（如缓冲液组成、温度和小分子配体）对蛋白质结构热稳定性的影响。DSF 常用的染料是一种橙色的、对环境敏感的疏水性染料。在正常条件下，蛋白质结构处于折叠状态，其疏水区域被包裹在内部。随着温度升高，蛋白质的疏水区域逐渐暴露，导致天然蛋白质结构逐步解折叠。该染料可选择性地结合暴露的蛋白质区域，从而增强其荧光信号。通过监测荧光信号的变化，可计算出 Tm 值¹¹。在一定程度上，Tm 值的变化可用于衡量因突变、缓冲液改变或配体结合所引起的蛋白质稳定性变化。此外，该方法还可反映蛋白质折叠过程中的结构变化¹²。该技术具有数据精确、温度范围宽、灵敏度高以及蛋白质样品损耗少等优点¹³。

本研究采用荧光微孔板读数仪而非荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪进行荧光测定。该改进使得在缺乏荧光定量PCR仪器的实验室中也能开展DSF检测，降低了方法的复杂性，并减少了仪器设置步骤，从而简化了实验流程。然而，该方法也存在某些不足之处。尽管复杂性降低，但操作过程变得更加繁琐，需手动在不同温度下进行荧光检测，无法实现对系统荧光信号的自动连续采集。因此，本研究利用DSF技术探究了CD40蛋白与伞形酮之间的相互作用，为藏药分子机制的研究提供了新的见解。

方案

将化合物溶液、蛋白质溶液和染料加入PBS溶液中。随后，使用数字加热振荡干浴仪对样品进行逐步加热，并通过测量复合体系中荧光强度的变化来评估蛋白质的热稳定性。详细步骤如下所述，图1展示了该实验方案的总体流程。

1. 溶液配制

1. 通过将 0.1 mg 芸香素加入 616.75 µL DMSO 溶液中，配制 1 mM 芸香素溶液（参见材料表）。
2. 通过将 0.1 mg CD40 蛋白加入 500 µL 去离子水（ddH₂O）溶液中，配制 200 µg/mL CD40 蛋白溶液（参见材料表）。
3. 通过将 1 µL 5000 倍橙色染料加入 9 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制 500 倍橙色染料溶液（参见材料表）。
   注意：上述操作需在冰上进行；由于移液器最小量程为 0.1 µL，为便于后续使用，应先将 5000 倍橙色染料蛋白溶液稀释 10 倍。

2. 染料性能测试

1. 将500倍浓度的橙色染料加入PBS溶液中，稀释至染料与PBS的比例分别为1:500、1:1000、1:2000和1:4000。
   注意：确保DMSO的最终浓度不超过2%（v/v）。
2. 打开荧光酶标仪，并预热10分钟。
3. 依次打开计算机和数据采集软件（参见材料表）。
4. 在数据采集软件中点击仪器，选择对应的荧光酶标仪型号，然后点击确定。
   注意：在打开数据采集软件前，请等待荧光酶标仪完成预热并在面板上显示温度，以确保仪器与软件成功连接。
5. 在数据采集软件中点击采集设置，选择荧光模式。
6. 在波长界面中编辑程序：Lm1 = 470 nm、570 nm，然后点击确定。
   注意：该橙色染料可被300 nm的紫外光或470 nm的可见光激发，在570 nm处检测发射荧光。
7. 将不同浓度的橙色染料（1:500、1:1000、1:2000和1:4000）以及PBS分别以100 µL/孔的体积加入96孔板中。
   注意：在加入PBS前，需先将染料溶于DMSO中；由于染料易沉淀，在配制过程中应于2000 × g条件下充分涡旋振荡，确保完全溶解。
8. 将96孔板放入仪器检测位，在数据采集软件中点击读取按钮，在室温下对每种染料浓度连续测量13次荧光值，每次间隔2分钟。
9. 每次测定后点击导出按钮，选择导出为XML XLS TXT，选择所有板，在输出格式中选择板，最后点击确定，将数据以"XLS"格式保存至指定文件夹，用于后续分析。
   注意：这些步骤有助于评估连续测量对橙色染料在室温下自发荧光的影响，并确定最佳染色浓度。
10. 打开数字加热振荡干浴器，设置加热温度为35 °C，加热时间为2分钟。
11. 在1.5 mL微量离心管中配制最佳稀释比例的染料溶液，并将其放入数字加热振荡干浴器中加热2分钟。
12. 将PBS溶液和经35 °C预热的染色液分别以每孔100 µL的体积加入96孔板中。
13. 将96孔板放入仪器检测位，在数据采集软件中点击读取按钮。
14. 将加热温度设置为40 °C，加热时间为2分钟。
15. 用移液器将96孔板中的染料溶液吸回1.5 mL微量离心管中，并在仪器中加热2分钟。
16. 重复步骤2.12–2.15及步骤2.9的操作，分别测定染料溶液在35 °C、40 °C、45 °C、50 °C、55 °C、60 °C、65 °C、70 °C、75 °C、80 °C、85 °C、90 °C和95 °C条件下的吸光度。
    注意：这些步骤用于评估橙色染料在35 °C至95 °C梯度连续加热条件下自发荧光的稳定性。操作时必须迅速，避免温度快速下降或加错液体，以免造成实验误差。

3. 蛋白质熔解温度（Tm）的检测

1. 将CD40蛋白和橙色染料加入PBS溶液中，使终浓度分别为5 µg/mL、10 µg/mL、15 µg/mL、20 µg/mL和1:500。
2. 重复步骤2.2–2.6和步骤2.10–2.16的操作，分别测定CD40蛋白溶液在35 °C、40 °C、45 °C、50 °C、55 °C、60 °C、65 °C、70 °C、75 °C、80 °C、85 °C、90 °C和95 °C时的吸光度。
3. 重复步骤2.9，保存并分析数据，随后使用数据分析软件（见材料表）计算Tm值。
4. 将CD40蛋白、伞形酮和橙色染料加入PBS溶液中，使终浓度分别为5 µg/mL、10 µg/mL、15 µg/mL、20 µg/mL、10 µM和1:500。
   注意：在溶液配制过程中需剧烈涡旋振荡，以确保染料、CD40蛋白和伞形酮在PBS中均匀分布。
5. 重复步骤3.2–3.3 的操作，分别测定CD40-伞形酮复合物溶液在35 °C、40 °C、45 °C、50 °C、55 °C、60 °C、65 °C、70 °C、75 °C、80 °C、85 °C、90 °C和95 °C时的吸光度。
   注意：这些步骤旨在测定CD40蛋白及其与伞形酮复合物的Tm值，以确定CD40蛋白与伞形酮结合的最佳浓度。

结果

该橙色染料在室温及高温条件下均表现出稳定的荧光激发，激发波长 E_x = 470 nm，发射波长 E_m = 570 nm。确定最佳稀释比例为 1:500（图 2A、B）。当 CD40 蛋白浓度低于 15 µg/mL 时，Tm 值的检测较为困难（图 3A、B）。然而，在 CD40 蛋白浓度为 15 µg/mL 时，可检测到稳定的 Tm 值为 51.82 °C，随着 CD40 蛋白浓度的增加，Tm 值下降至 45.79 °C（图 3C、D）。

如图3所示，CD40蛋白与伞形酮结合会影响CD40蛋白的Tm值。具体而言，在CD40蛋白浓度分别为15 µg/mL和20 µg/mL，且含有10 µM伞形酮的条件下，其Tm值分别升高至62.08 °C和65.27 °C。

图1：实验方案概览。基于DSF原理，利用荧光酶标仪记录CD40蛋白与伞形酮结合能力的流程图。请点击此处查看此图的放大版本。

图2：橙色染料稀释比例及稳定性测试的筛选结果。（A）不同稀释比例的染料在室温下的荧光稳定性。（B）稀释比例为1:500的染料在35–95 °C下的荧光稳定性。误差线表示均值±标准误（SEM），n = 4。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：采用荧光微孔板读数仪基于DSF原理记录CD40蛋白与伞形酮结合能力的结果图。 (A-D5 µg/mL、10 µg/mL、15 µg/mL、20 µg/mL CD40蛋白以及CD40 + 10 µM伞形酮的Tm曲线。误差条表示均值 ± 标准误（SEM），n = 4。 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

差示扫描荧光法（DSF），也称为热 shift 测定法或热荧光测定法，是一种通过监测样品在缓慢、程序化升温过程中测试样品或染料荧光信号的变化，来检测蛋白质热变性过程的技术。该方法最初由 Pantoliano¹⁴ 建立，是一种高通量检测方法。其主要步骤包括：在计算机控制的加热板上逐步升高温度，使用长波长紫外灯发射激发光，并通过电荷耦合器件成像相机捕获荧光染料与蛋白质结合后荧光信号强度的变化。

Tm值是表征蛋白质高级结构的一个关键指标，代表在升温过程中蛋白质药物发生一半变性时所对应的温度。较高的Tm值表明蛋白质变性需要更高的温度，提示其结构更为稳定。目前公认的Tm值检测方法是差示扫描量热法（DSC），该方法始于20世纪60年代¹⁵。DSC通过在程序控温条件下测量供给待测样品与参比样品的功率差，从而获得样品吸热和放热的量。该方法被公认为热稳定性分析的金标准^16,17。

与DSC相比，DSF具有三个优势，因此得到了广泛应用：（1）样品消耗量更少：DSC通常需要400 µL的样品体积，而DSF仅需20–25 µL。（2）浓度范围更宽：DSC一般需要0.2–2 mg/mL的蛋白浓度才能获得明显的变性峰，而DSF可分析浓度范围在0.005–200 mg/mL之间的样品。（3）更高的通量：DSC一次只能分析一个样品，而DSF可同时检测多达96个或更多的样品¹⁸。由于这些优势，DSF被广泛应用于蛋白质稳定性、蛋白质结构与构象、蛋白质-配体相互作用以及蛋白质稳定剂、抑制剂、辅因子等效应的研究中。

除了DSF和DSC之外，还存在多种其他分子相互作用检测技术。表面等离子共振（SPR）是一种发生在两种介质界面的光学现象，可由光子或电子激发产生。当光从光学密度较高的介质射入光学密度较低的介质时，会发生全反射。表面等离子共振发生的特定角度称为SPR角。SPR生物传感器通过监测SPR角的变化，实现实时检测分子间相互作用^19,20。微尺度热泳（MST）是一种通过检测生物分子在结合过程中其尺寸、电荷及水合层的变化来分析生物分子相互作用的技术。该技术记录样品中红外激光照射区域在激光开启前、开启期间及关闭后的荧光变化，从而实现相对较快的测定²¹。生物层干涉技术（BLI）通过追踪干涉光谱中的位移变化来测量传感器表面的反应。在BLI实验中，将一种分子固定在可浸入式传感器表面，用于检测能与其结合的另一种分子。结合相互作用会引起干涉位移，通过实时监测该位移变化可获得结合曲线²²。等温滴定 calorimetry（ITC）通过直接测量生物分子结合过程中释放或吸收的热量来定量分析生物分子相互作用，可提供关于分子相互作用的完整热力学信息²³。与这些分子相互作用技术相比，DSF对仪器、耗材和操作技术的要求较低，可在大多数实验室中高效检测化合物与蛋白质之间的相互作用。

DSF 技术的操作流程相对简单。首先，将白质样品、反应缓冲液、荧光染料和候选配体加入反应体系中。随后将该体系转移至荧光 PCR 仪器，并设置用于荧光检测的加热与检测条件^24,25。目前 DSF 中最常用的蛋白染料为橙色染料，检测仪器通常为荧光定量 PCR 仪²⁶。然而，由于橙色染料的激发波长为 470 nm，发射波长为 570 nm，并非市面上所有荧光定量 PCR 仪器均能完全匹配该参数。因此，本研究采用荧光微孔板读板仪作为新型检测仪器，以探究蛋白质-配体相互作用。

与使用荧光定量PCR仪进行DSF相比，该方法具有两个主要优势。首先，荧光酶标剂的波长范围可定制，使其与染料的波长范围更匹配，从而确保更准确的荧光检测。其次，荧光定量PCR仪一旦启动程序便无法停止，导致在加热过程中难以排查问题。相比之下，荧光微孔板读板仪可在检测过程中通过反复调整体系比例和检测条件来消除干扰。然而，使用荧光微孔板读板仪进行DSF也存在某些缺点，尤其是所需样品量相对较大，通常为50–200 µL，而传统DSF通常仅需20–25 µL样品。

本文采用基于荧光酶标仪的差示扫描荧光法（DSF），在5-20 µg/mL浓度范围内，利用CD40蛋白和伞形酮（umbelliferone）进行Tm值检测验证。结果表明，该方法具有高特异性和准确性，适用于Tm值的检测。进一步比较不同样品浓度下的Tm检测结果发现，随着CD40蛋白浓度的增加，其Tm值呈下降趋势，提示浓度可能对Tm检测存在影响（图3）。此外，研究发现，在体系中加入伞形酮后，CD40蛋白的Tm值较加入前有所升高，表明伞形酮能够与CD40蛋白结合，二者结合后可增强CD40蛋白的热稳定性（图3）。

该实验方案中的关键步骤被确定为步骤 2.7 至 2.16，这些步骤的成功完成直接影响后续蛋白质荧光的检测。综上所述，本研究基于差示扫描荧光法（DSF）技术原理，以 CD40 蛋白和伞形酮为示例，建立了一种新型 DSF 检测方法。该方法利用荧光酶标仪有效分析了蛋白质与配体之间的结合力。此外，该技术还可拓展用于蛋白质稳定性分析及蛋白质结构研究，进一步深化 DSF 技术在细胞信号通路研究和疾病发病机制探索中的应用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CD40蛋白	MedChemExpress	HY-P75408
DMSO	博奥森生物科技有限公司	PYG0040
FlexStation 3多功能微孔板读板仪	上海美谷分子仪器有限公司	FlexStation 3
OriginPro 8软件	OriginLab公司	v8.0724(B724)
磷酸盐缓冲液（1x）	Gibco	8120485
SoftMax Pro 7.1	上海美谷分子仪器有限公司	SoftMax Pro 7.1
SSYPRO orange染料	Sigma	S5942
伞形酮	上海源叶生物科技有限公司	B21854