新生小鼠骨髓分离及骨髓来源巨噬细胞的制备

摘要

本方案描述了一种非酶解且简便的方法，用于分离7至9日龄新生小鼠的骨髓细胞，并利用L929细胞的上清液作为粒细胞集落刺激因子（M-CSF）来源，诱导生成分化的巨噬细胞。进一步对骨髓来源的巨噬细胞进行了表面抗原F4/80、CD206、CD11b以及功能活性的分析。

摘要

从成年小鼠中分离骨髓的多种技术已较为成熟。然而，从新生小鼠中分离骨髓仍具有挑战性且耗时较长，但对于某些研究模型而言，这一过程具有转化意义且必不可少。本实验方案描述了一种高效且简便的方法，用于制备7至9日龄幼鼠的骨髓细胞。这些细胞可进一步分离或分化为特定的目标细胞类型。巨噬细胞是关键的免疫细胞，在炎症与感染过程中发挥重要作用。在发育过程中，新生期巨噬细胞对组织重塑具有显著贡献。此外，新生期巨噬细胞的表型和功能与其成年对应细胞存在差异。本方案还详细阐述了在L929条件培养基存在下，由分离所得骨髓细胞分化为新生期巨噬细胞的过程。采用流式细胞术分析鉴定分化后新生期巨噬细胞的表面标志物。为验证其功能，使用pH敏感性染料标记的大肠杆菌（Escherichia coli）检测了其吞噬效率。

引言

骨髓包含可自我更新并能分化为多种细胞谱系的造血干细胞和间充质干细胞群体。 骨髓中的造血干细胞可分化为髓系和淋巴系细胞¹。间充质干细胞可生成成骨细胞（骨）、脂肪细胞（脂肪）或软骨细胞（软骨）²。这些细胞在细胞生物学和组织工程领域具有多种应用，包括基因治疗^3,4。骨髓中存在的祖细胞在谱系特异性生长因子的作用下可分化为特定细胞类型。例如，促红细胞生成素可促进红系祖细胞的增殖，粒细胞集落刺激因子（G-CSF）可刺激中性粒细胞集落的生长，而血小板生成素则可调控血小板的生成⁵。利用细胞表面抗原标记的流式细胞术（FACS）和磁珠激活细胞分选（MACS）是分离和纯化特定骨髓来源细胞类型的成熟方法⁶。

尽管新生儿研究正在不断推进，以探寻新生儿死亡的原因并解决早产期间出现的并发症，但直接的治疗手段开发仍是尚未满足的医疗需求。Smith和Davis指出， "儿科患者仍然是治疗上的孤儿"⁷样本量小、结局的终身影响以及在新生儿临床研究中获取知情同意的伦理问题等诸多挑战

方案

所有实验程序均经西弗吉尼亚州机构动物护理和使用委员会批准，并遵循美国国家研究委员会《实验动物护理和使用指南》的建议进行。本研究使用了C57BL/6J小鼠幼崽。所用全部试剂和设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 培养基制备

1. 在5 mL离心管中配制3 mL MEM培养基，添加10%胎牛血清（FBS）、2 mM谷氨酰胺、25 mM HEPES以及青霉素（100 U/mL）/链霉素（100 µg/mL），并置于冰上保存。
2. 若需将骨髓前体细胞储存在液氮中，请配制含10% DMEM、80% FBS和10% DMSO的冻存液。
3. 配制完全DMEM培养基：在DMEM中添加10% FBS、2 mM谷氨酰胺、25 mM HEPES以及青霉素（100 U/mL）/链霉素（100 µg/mL）。
4. 用于巨噬细胞分化时，配制含10% FBS、2 mM谷氨酰胺、青霉素（100 U/mL）/链霉素（100 µg/mL）以及10% L929细胞上清液^9,10,11的DMEM培养基。

2. L92....

结果

采用本研究所述方法，可从五只C57BL/6小鼠仔鼠组成的同窝仔鼠中成功分离出2500万至3700万个骨髓细胞。该方法已在5至7只仔鼠的同窝规模中得到验证。本实验中分离的最小小鼠年龄为7日龄。根据同窝仔鼠数量及实验所需细胞数（若少于一百万个），研究人员可尝试将本方案用于小于7日龄的小鼠。在以L929细胞上清作为M-CSF来源的条件下，骨髓细胞在5天内分化为巨噬细胞（图2）。分化第二天可观察到纺锤形细胞的形成（图2B），第三天约一半细胞呈现纺锤形（图2C），第五天大多数细胞已贴壁并形成细长的纺锤形状（图2D）。采用该方法，从5只7日龄仔鼠获得的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）产量为250万至500万个细胞。

为了在表型上表征分化后的BMDM，对培养5天的细胞进行了CD11b、CD206和F4/80的免疫标记。前向/侧向散射及单标记设门方案见

讨论

涉及新生小鼠模型的研究可能面临诸多挑战。新生小鼠的免疫系统正处于发育阶段，其特性与成年个体显著不同⁸。因此，不应假设来自动物成年模型的数据可直接适用于新生儿，已有若干研究明确阐述了这一观点^18,19。因此，必须使用针对新生期的特异性模型和细胞来源，以深入研究生命早期免疫应答的复杂机制。然而，由于新生小鼠体型微小、对外界刺激敏感且身体结构脆弱，可获取的生物样本量通常有限，且采样过程可能耗时较长。本实验方案建立了一种简单且高效的方法，用于从小鼠新生个体中提取骨髓组织。

成年小鼠的骨骼足够大，可插入针头并轻松冲洗出骨髓。相反，由于新生小鼠骨骼体积小且脆弱，用针头获取其骨髓具有挑战性。一些研究采用II型胶原酶和分散酶进行酶消化处理²⁰。在此，由于新生骨骼柔软且细小，我们采用了碾碎法来释放骨髓。经过纯化后，根据具体研究需求，这些细胞可被诱导分化为特定的细胞类型。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
40 µm 细胞筛	Greiner	542040	细胞培养
96 孔圆底（U 型）板	Thermo Scientific	12-565-65	细胞培养
抗小鼠 CD11b-BV786	BD Biosciences	740861	FACS 分析
抗小鼠 CD206-Alexa Fluor488	BD Biosciences	141709	FACS 分析
抗小鼠 F4/80-PE	BD Biosciences	565410	FACS 分析
Countess3	Thermo Scientific	TSI-C3ACC	自动细胞计数仪
DMEM	Hyclone	SH30022.01	细胞培养
DMSO	VWR	WN182	细胞培养
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV	细胞培养
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775	感染
EVOS FL	Invitrogen	12-563-649	细胞成像系统
FBS	Avantor	76419-584	细胞培养
FluoroBright BMDM	Thermo fisher Scientific	A1896701	无染料培养基
谷氨酰胺	Cytiva	SH30034.01	细胞培养
HEPES	Cytiva	SH30237.01	细胞培养
L-929	ATCC		分化
LSRFortessa	Becton Dickinson		流式细胞仪
溶酶体示踪红 DND 99	Invitrogen	L7528	荧光染料
MEM	Corning	15-010-CV	细胞培养
青霉素/链霉素	Hyclone	SV30010	细胞培养
pHrodo 绿色 STP 酯	Invitrogen	P35369	荧光染料
T75 培养瓶	Cell star	658170	细胞培养
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300120	细胞培养
Zeiss 710	Zeiss	P20GM103434	共聚焦显微镜