新生小鼠骨髓分离和骨髓来源巨噬细胞的制备

摘要

该方案描述了一种非酶和直接的方法，用于分离 7-9 日龄的新生小鼠骨髓细胞，并使用 L929 细胞的上清液作为粒细胞集落刺激因子 （M-CSF） 的来源来产生分化的巨噬细胞。进一步分析骨髓来源的巨噬细胞表面抗原 F4/80 、 CD206 、 CD11b 和功能能力。

摘要

从成年小鼠中分离骨髓的各种技术已经得到广泛确立。然而，从新生小鼠中分离骨髓具有挑战性且耗时，但对于某些模型来说，它在翻译上是相关和必要的。该方案描述了一种从 7-9 日龄幼崽制备骨髓细胞的有效且直接的方法。然后，这些细胞可以进一步分离或分化为感兴趣的特定细胞类型。巨噬细胞是重要的免疫细胞，在炎症和感染中起主要作用。在发育过程中，新生儿巨噬细胞对组织重塑有显著贡献。此外，新生儿巨噬细胞的表型和功能与成年巨噬细胞不同。该方案还概述了在 L929 条件培养基存在下新生儿巨噬细胞与分离骨髓细胞的分化。使用流式细胞术分析评估分化新生儿巨噬细胞的表面标志物。为了证明功能，还使用 pH 敏感染料偶联的大 肠杆菌测试了吞噬效率。

引言

骨髓包含造血干细胞群和间充质干细胞群，这些细胞群是自我更新的，可以分化成各种细胞谱系。骨髓中的造血干细胞产生骨髓和淋巴谱系¹。间充质干细胞产生成骨细胞（骨骼）、脂肪细胞（脂肪）或软骨细胞（软骨）²。这些细胞在细胞生物学和组织工程领域有多种应用，包括基因治疗 ^3,4。存在于骨髓中的祖细胞在谱系特异性生长因子存在的情况下分化成特定的细胞类型。促红细胞生成素促进红细胞祖细胞的增殖，粒细胞集落刺激因子 （G-CSF） 刺激中性粒细胞集落的生长，血小板生成素调节血小板的产生，这是谱系特异性生长因子的几个例子⁵。细胞表面抗原标记的 FACS 和磁激活细胞分选 （MACS） 是分离和纯化特定骨髓来源细胞类型的成熟方法⁶。

尽管新生儿研究正在朝着寻找新生儿死亡原因和解决早产并发症的方向发展，但直接治疗开发仍然是一个未得到满足的医疗需求。Smith 和 Davis 表示，"儿科患者仍然是治疗性孤儿"⁷。在新生儿临床研究中，获得同意存在一些挑战，例如样本小、结果的终生影响以及获得同意的伦理问题⁸.因此，对特定于新生儿的 体内 和 体外 研究模型以实现转化相关性的需求很高。由于解剖水平和组织水平之间的相似性、较短的妊娠期和窝产仔数，啮齿动物是研究最多的哺乳动物模型系统。

在这里，我们描述了一种详细的、高度可行的和可重复的程序，用于从 7-9 日龄的小鼠幼崽中分离骨髓及其分化为巨噬细胞的能力。然而，通过使用不同的分化信号，可以实现多种细胞谱系。我们还证明了细胞表面标志物的存在以及骨髓来源的巨噬细胞 （BMDM） 预期的 体外 吞噬活性的存在。

方案

所有程序均由西弗吉尼亚州机构动物护理和使用委员会批准，并按照国家研究委员会的《实验动物护理和使用指南》的建议进行。本研究使用 C57BL/6J 小鼠幼崽。材料 表中列出了所有使用的试剂和设备的详细信息。

1. 培养基制备

1. 在 5 mL 离心管中制备 3 mL 补充有 10% FBS、2 mM 谷氨酰胺、25 mM HEPES 和青霉素 （100 U/mL）/链霉素 （100 μg/mL） 的 MEM 培养基，并保持在冰上。
2. 如果需要将骨髓祖细胞储存在液氮中，请准备含有 10% DMEM、80% FBS 和 10% DMSO 的冷冻培养基。
3. 对于完整的 DMEM，制备补充有 10% FBS、2 mM 谷氨酰胺、25 mM HEPES 和青霉素 （100 U/mL）/链霉素 （100 μg/mL） 的 DMEM。
4. 对于巨噬细胞分化，制备补充有 10% FBS、2 mM 谷氨酰胺、青霉素 （100 U/mL）/链霉素 （100 μg/mL） 和 10% L929 细胞上清液的 DMEM9,10,11。

2. L929 细胞上清液制备

1. 解冻储存在液氮中的 L929 细胞，并转移至含有 5 mL 完整 DMEM 的 15 mL 离心管中。在室温下以 350 x g 离心 5 分钟。
2. 将细胞重悬于 5 mL 完全 DMEM 培养基中，并以 2×10⁵ 个细胞的密度将它们接种到 T25 组织培养瓶中。使用 0.4% 台盼蓝的自动细胞计数器对细胞进行计数。在 37 °C 下用 5% CO₂ 孵育，直到它们达到 70% 汇合。
3. 要分离细胞，首先用 5 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤它们。吸出 PBS 并用 2.5 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 替换。
4. 在 37 °C 下用 5% CO₂ 孵育 5 分钟，然后加入 5 mL 完整的 DMEM。
5. 收集细胞并在室温下以 350 x g 离心 5 分钟。
6. 将细胞沉淀重悬于 15 mL 完整 DMEM 培养基中，并将其转移到 T75 培养瓶中。
7. 在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育，直到细胞达到 90% 汇合，然后收集培养基并在 4 °C 下以 500 x g 离心 5 分钟。 通过 0.45 μm 过滤器过滤含有 M-CSF 的培养基，并在 -80 °C 下以 5 mL 等分试样冷冻。

3. 动物准备

1. 在生物安全柜下，小心地将 7-9 天大的 C57BL/6J 小鼠幼崽（一窝 6 只幼崽）与母鼠分开，并将它们放在单独的笼子中。
2. 将棉球浸泡在钟罩或其他密封室中的 2 mL 兽用级异氟醚中。
3. 将一只小狗放入腔室并盖上盖子。监测新生儿约 90 秒，以确保其变得一动不动和失去知觉。
4. 在幼犬恢复意识之前，迅速取出幼犬并用锋利的剪刀（遵循机构批准的协议）将其斩首。
   注意:新生儿仅通过吸入异氟醚呼吸不足以进行安乐死。
5. 确保在取出每只幼崽后盖上容器的盖子。同一个棉球可用于 5-7 只幼崽。

4. 新生儿骨髓的分离

1. 用 70% 乙醇对新生儿的身体进行消毒。
2. "使用镊子和细尖手术剪刀，在
   腹部和后腿。向后肢的脚部拉动，去除皮肤。
3. 使用锋利的镊子刮擦附着在骨骼上的结缔组织和肌肉。
4. 剪断胫骨和股骨，如图 1 所示，用剪刀分离和移除。使用镊子将这些骨头放入冰上的培养基管中。对每只小狗重复该过程。
5. 在镊子的帮助下将骨骼转移到带有收集管的 40 μm 过滤器中。用 3 mL 注射器柱塞压迫过滤器，压碎骨头并释放骨髓。
6. 将细胞悬液在 4 °C 下以 350 x g 离心 5 分钟。
7. 吸出上清液，并通过在 0.2% NaCl 中轻轻移液重悬细胞，NaCl 是一种用于裂解红细胞的低渗溶液。立即加入等体积的 1.6% NaCl，使溶液达到等渗。
8. 在 4 °C 下以 350 x g 离心 5 分钟，然后去除裂解液。
9. 重悬于完整的 DMEM 中以立即使用或冷冻培养基以储存，并使用血球计数器或自动细胞计数仪对细胞进行计数。
   注意:对于本研究，该方法产生了 6.55 （± 1.44） × 10⁶ 个骨髓细胞/幼崽（图 1E）。
10. 将细胞储存在 -80 °C 的冷冻培养基中或立即使用，如下所述。
    注意:由于年代久远，骨骼足够透明，可以通过它们看到骨髓。拉动骨头时要小心，因为对它们施加轻微的压力可能足以释放骨髓。新生儿骨骼中的骨髓是液体形式，而不是成人骨骼中的完整线。如果骨髓在收集骨骼过程中逸出，则很难收集骨髓。

5. 新生儿骨髓来源的巨噬细胞的分化

1. 将每个 T75 培养瓶× 2 7^{个骨髓细胞} 接种在 10 mL 含有 10% L929 细胞上清液 （2.5 mL） 作为 M-CSF 来源的完整 DMEM 中。将培养皿在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 5 天。在分化第 3 天加入 2 mL L929 条件培养基。
2. 每天使用倒置显微镜和放大倍数为 20 倍的成像系统在显微镜下观察细胞。分化后，巨噬细胞应显得粘附、细长和异质性（图 2）。
3. 要收获巨噬细胞用于下游分析，请吸出分化培养基。
4. 用 5 mL PBS 洗涤细胞，以去除会干扰脱离的非贴壁细胞和血清蛋白。吸出 PBS。
5. 向培养瓶中加入 5 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 来收获细胞。将培养瓶置于 37 °C 和 5% CO₂ 培养箱中 5 分钟，并加入 5 mL DMEM。
6. 移液细胞以分离并在室温下以 350 x g 离心 5 分钟。
7. 在 1 mL 完整的 DMEM 中解离细胞沉淀，并使用台盼蓝计数并检查细胞活力。使用这种方法分离的 BMDM 为 7.05 （± 2.52） ×10⁵ 个细胞/幼崽（图 1E）。
   注意:观察在分化第二天开始出现的纺锤形细胞的存在（图 1B，红色箭头）。如果培养基的颜色变为黄色，表明它已用完，请在分化的第 4 天添加更多 L929 条件培养基;建议不要完全更换介质。

6. 免疫标记和流式细胞术分析

1. 根据制造商的建议，用 10 μL/10⁷ 个细胞的 FcR 封闭试剂在 100 μL/标签的流式细胞术缓冲液（PBS 补充有 2 mM EDTA 和 0.5% 牛血清白蛋白）中处理，阻断 BMDM 的非特异性抗体标记（2x10⁵/标签）。在冰上保持 10 分钟。
   注:细胞可以散装封闭，也可以单独封闭在单独的孔或试管中。所有后续步骤均指示最终体积为 100 μL 时每个细胞标记物的量和体积。
2. 加入 200 μL 流式细胞术缓冲液洗涤细胞，并在室温下以 525 x g 离心 7 分钟。
3. 去除上清液，将细胞以每孔 5 × 10⁵ 个细胞的密度接种在 U 形底 96 孔板中。通过在 100 μL 流式细胞术缓冲液中单独或组合加入稀释至 3,000 倍的 FVS780-活/死细胞计数染料和 0.625 μL BV786-CD11b、PE-F4/80 和 AlexaFluor488-CD206 对细胞进行染色 12,13,14,15。将细胞在覆盖有箔纸的冰上孵育 45 分钟。
4. 加入 100 μL 流式细胞术缓冲液，并在室温下以 525 x g 离心 7 分钟洗涤细胞。
5. 吸出上清液并轻轻涡旋细胞沉淀。向每个孔中加入 100 μL 0.4% 多聚甲醛，并在 4 °C 下孵育过夜。
6. 加入 100 μL 流式细胞术缓冲液洗涤细胞，并在室温下以 525 x g 离心 7 分钟沉淀。
7. 将细胞重悬于 400 μL 流式细胞术缓冲液中，并使用流式细胞仪进行分析。

7 . 体外 试验评价新生儿骨髓来源的巨噬细胞的吞噬功效

1. 将 BMDM 重悬于不含酚红或抗生素的完整 DMEM 中，并以 2 ×^{10 5}/象限的密度将它们接种在 35 mm 四联培养皿中，体积为 500 μL。
2. 为了制备感染复数 （MOI） 为 25 或其他所需 MOI 的细菌接种物，请取出储存在 -80 °C 下的预先计算的大 肠杆菌 O1:K1:H7 原液。
3. 将所需体积的细菌分装到 1.7 mL 微量离心管中。通过添加 PBS 至总体积为 1 mL 来洗涤细菌。通过在室温下以 2,000 x g 离心 5 分钟来沉淀细菌。重复洗涤步骤。
4. 将细菌沉淀重悬于 50 μL PBS 中，并添加绿色荧光 pH 敏感染料至终浓度为 500 μM。这是一种对 pH 值敏感的染料，在中性 pH 值下没有荧光信号，在吞噬过程中，在酸性环境（如酸化吞噬体）中会发出明亮的荧光。
5. 将细菌细胞在黑暗中孵育 20 分钟以进行染料缀合。
6. 用 1 mL PBS 洗涤细菌四次，在室温下以 1000 × g 离心 5 分钟。
7. 将细菌重悬于 500 μL 不含酚红的完整 DMEM 中，并添加到 BMDM 培养物中。
8. 将 BMDM 在 37 °C 下在 5% CO₂ 培养箱中孵育 4 小时，然后加入 200 ng 细胞渗透性红色荧光染料，对溶酶体进行染色。
   注意:吞噬细菌可以通过荧光显微镜观察。

结果

使用本研究中概述的方法，可以从 5 只 C57BL/6 小鼠幼崽的窝产仔数中成功分离 25 至 3700 万个骨髓细胞。这种方法已在 5 到 7 只幼崽的窝产仔数中得到验证。在我们的实验中，隔离的最低年龄为 7 天。根据窝产仔数和实验所需的细胞数量少于 100 万，研究人员可以对 7 天以下的小鼠尝试此方案。在作为 M-CSF 来源的 L929 细胞上清液存在下，骨髓细胞在 5 天内分化成巨噬细胞（图 2）。在分化的第二天观察到纺锤形细胞的形成（图 2B），近一半的细胞在第 3 天表现出纺锤形（图 2C），大多数细胞在分化的第 5 天粘附并形成细长的纺锤形（图 2D）。使用这种方法的骨髓来源的巨噬细胞 （BMDM） 的产量为 2.5-500 万个细胞，来自 5 只 7 日龄的幼崽。

为了从表型上表征分化的 BMDM，对来自 5 天培养物的细胞进行 CD11b 、 CD206 和 F4/80 的免疫标记。前向/侧向散射和单标记门控方案可以在补充图 1 中看到。流式细胞术分析结果表明，76.4% 的 BMDM 对 CD11b 和 F4/80 均呈阳性（图 3A）。F480-CD11b ⁺ 群体与 CD206 阳性的细胞的近似数量一致（图 3B）。后者通常被认为是与 M2 样巨噬细胞一致的标志物，虽然 CD206 标记的丰度可以高出两倍，但较高比例的 F4/80 标记与 M-CSF 促进分化为 M1 样表型的能力一致^16,17（图 3）。

我们进一步评估了分化的新生 BMDM 吞噬细菌并将其运输到酸化隔室作为功能措施的能力。用 pH 敏感染料标记的细菌只有在吞噬并运输到酸化隔室时才应发出绿色荧光。感染后检测到在 BMDM 内吞噬的大量绿色荧光细菌（图 4A）。绿色荧光进一步定位红色荧光，指示酸化溶酶体（图 4B，C）。在整个 4 h 感染过程中还观察到绿色 pH 敏感染料阳性新生儿 BMDM 的吞噬作用和外观（图 4D 和补充视频）。此处显示的功能活性与 M1 样炎性巨噬细胞活性一致。

图 1:分离 7 日龄 C57BL/6J 小鼠幼崽骨髓。 （A） 100 毫米培养皿中 7 日龄幼崽的后肢骨。（B） 去除皮肤和皮下组织后的 7 日龄幼犬的后肢;黑色虚线表示骨髓提取的切割位置。（C） 新生儿后肢在压碎前用骨髓处理骨骼。（D） 新生儿后肢在过滤器中使用注射器柱塞压碎后处理骨骼。（E） 从三个独立实验中获得的骨髓 （BM） 和骨髓来源的巨噬细胞的平均数±标准误差。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:BMDM 与 7 日龄新生儿骨髓细胞的分化。 分化第 1 天 （A） 、第 2 天 （B） 、第 3 天 （C） 和第 5 天 （D） 的骨髓细胞。图 B 上的红色箭头表示分化第 2 天的纺锤形粘附细胞。比例尺:200 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

图 3:使用流式细胞术分析检测小鼠巨噬细胞标志物。 分化的新生儿骨髓来源的巨噬细胞显示 F4/80 和 CD11b （A） 或 CD206 和 CD11b （B） 表面抗原的表达。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:新生儿 BMDM 对 pH 敏感染料标记的大 肠杆菌 的吞噬作用。 （A） 骨髓来源的巨噬细胞在感染 4 小时后显示吞噬 pH 敏感染料标记（绿色） 大肠 杆菌。（B） 用酸化溶酶体染色标记的 BMDM（红色）。（C） 面板 （A） 和 （B） 的合并图像。比例尺:20 μm。（D） 绿色荧光细菌在巨噬细胞上的叠加，以相差显示。（D） 中的放大倍率与 （A） 中的放大倍率相同。 请单击此处查看此图的较大版本。

补充视频。新生儿 BMDM 对绿色荧光菌进行活细胞成像的 4 小时视频，如图 4 图 A 所示。请点击此处下载此视频。

补充图 1:BMDM 的流式细胞术分析。 （A） BMDM 首先在 FSC 和 SSC 上设门，以去除碎片和双峰。显示 F4/80 （B）、CD11b （C） 和 CD206 （D） 的单次染色。 请点击此处下载此文件。

讨论

涉及新生小鼠模型的研究可能会带来许多挑战。与成人相比，新生儿的免疫系统发育中是独一无二的⁸。因此，不应假设从成年动物模型生成的数据适用于新生儿，几篇已发表的著作已经很好地阐明了这一想法^18,19。因此，新生儿特异性模型和细胞来源对于研究早期免疫反应的复杂性是必要的。然而，由于新生小鼠的大小、敏感性和脆弱性，生物样本的数量可能受到限制，并且采集过程可能很耗时。该方案建立了一种简单且省时的方法，用于从新生小鼠中提取骨髓。

成年小鼠的骨头足够大，可以插入针头并轻松冲洗骨髓。相反，由于其大小和脆弱性，用针头进入新生儿骨髓具有挑战性。一些研究采用了 II 型胶原酶和分散酶²⁰ 的酶消化。在这里，由于新生儿骨骼柔软而微小，我们采用了粉碎方法释放骨髓。纯化后，根据感兴趣的研究应用，这些细胞可以分化成特定的细胞类型。

新生儿表现出不同的表型巨噬细胞群²¹。本研究阐明了 BMDMs 在不使用酶的情况下从 7-9 天老年幼犬骨髓细胞中的分化。该方法涉及的关键步骤包括新生小鼠幼崽的整体脆弱性质，以允许骨髓释放的方式收集小骨头，以及在胫骨和股骨中找到合适的位置进行剪刀式切割。我们观察到新生儿 BMDMs 在培养中比成人 BMDMs 更敏感，并且从新生儿中分离骨髓的时间较长阻碍了它们的分化能力。因此，不建议一次从超过 7 只幼崽中提取。此外，在分化的第二天添加 BMDM 分化培养基也会导致不良结果，例如分化差和活力降低。

该方案使用 L929 细胞上清液作为 M-CSF 的来源，用于将骨髓细胞分化为巨噬细胞。L929 细胞是已知可产生大量 M-CSF¹⁰ 的小鼠成纤维细胞。预计巨噬细胞会暴露于 L929 上清液中分泌的其他物质以及 M-CSF。商业纯化的 M-CSF 也可用于巨噬细胞分化;然而，我们尚未直接将其与使用 L929 培养上清液进行比较。同样重要的是要注意，L de Brito Monteiro 等人观察到使用 L929 和市售 M-CSF²² 产生的巨噬细胞之间存在不同的代谢特征。

这种方法建立了一种省时、经济的方法，无需使用任何消化酶。该技术产生了新生儿骨髓的可靠分离，导致新生儿 BMDM 的明确分化。分离的新生儿 BMDM 可以进一步用于研究各种感染期间新生儿巨噬细胞的动力学以及这些细胞对炎症的调节。该方法的局限性包括初始建立和适应小骨拉动过程的学习曲线，最终随着经验的积累而改善，并通过增加细胞的活力来最大限度地减少该过程的持续时间。幼崽的窝产仔数是巨噬细胞数量的额外考虑因素，可以根据实验需要进行区分。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
40 µm 过滤器	Greiner	542040	细胞培养
96 孔圆形 （U） 底板	Thermo Scientific	12-565-65	细胞培养
抗小鼠 CD11b-BV786	BD Biosciences	740861	FACS 分析
抗小鼠 CD206-Alexa Fluor488	BD Biosciences	141709	FACS 分析
抗小鼠 F4/80-PE	BD Biosciences	565410	FACS 分析
Countess3	Thermo Scientific	TSI-C3ACC	自动细胞计数器
DMEM	Hyclone	SH30022.01	细胞培养
DMSO	VWR	WN182	细胞培养
DPBS，1x	康宁	21-031-CV	细胞培养
大肠杆菌 O1：K1：H7	ATCC	11775	感染
EVOS FL	Invitrogen	12-563-649	细胞成像系统
FBS	Avantor	76419-584	细胞培养
FluoroBright BMDM	Thermo Fisher Scientific	A1896701	无染料培养基
Glutamine	Cytiva	SH30034.01	细胞培养
HEPES	Cytiva	SH30237.01	细胞培养
L-929	ATCC		分化
LSRortessa	Becton Dickinson		流式细胞仪
Lysotracker red DND 99	Invitrogen	L7528	荧光染料
MEM	Corning	15-010-CV	细胞培养
青霉素 /链霉素	Hyclone	SV30010	细胞培养
pHrodo green STP 酯	Invitrogen	P35369	荧光染料
T75 培养瓶	细胞星	形 658170	细胞培养
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300120	细胞培养
蔡司 710	蔡司	P20GM103434	共聚焦