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通过去除单颗粒冷冻电子显微镜最终堆叠中的大部分颗粒以增强密度图

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DOI：

10.3791/66617

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2024年5月10日

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1Institute of Bio-Architecture and Bio-Interactions (IBABI), Shenzhen Medical Academy of Research and Translation, 2Yau Mathematical Sciences Center, 3Key Laboratory of Protein Science (Tsinghua University), Ministry of Education, 4School of Life Science, Tsinghua University, 5Beijing Advanced Innovation Center for Structural Biology, 6Beijing Frontier Research Center for Biological Structure, 7Department of Mathematical Sciences, Tsinghua University, 8Yanqi Lake Beijing Institute of Mathematical Sciences and Applications, 9State Key Laboratory of Membrane Biology, School of Life Science

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

一种用于冷冻电镜的先进颗粒筛选方法，即CryoSieve，通过在真实世界数据集上的应用表明，该方法可在最终堆叠中去除大部分颗粒，从而提高密度图的分辨率。

摘要

在过去十年中，冷冻电子显微镜（cryo-EM）单颗粒分析（SPA）领域的技术和方法不断进步，显著提升了我们对生物大分子进行高分辨率结构研究的能力。这一进展开启了分子认知的新时代，使冷冻电镜取代X射线晶体学成为主导方法，并解答了生物学中长期存在的诸多问题。由于冷冻电镜不依赖于结晶过程——而结晶正是X射线晶体学的重要限制因素——因此其捕获的颗粒质量存在差异。因此，颗粒筛选至关重要，因为所选颗粒的质量直接影响重构密度图的分辨率。一种名为CryoSieve的创新性迭代颗粒筛选方法，通过有效减少最终堆栈中的颗粒数量，显著提高了重构密度图的质量。实验证据表明，该方法能够剔除最终堆栈中的大部分颗粒，从而显著提升密度图的质量。本文详细阐述了该方法的工作流程，并展示了其在真实世界数据集上的应用。

引言

冷冻电子显微镜（cryo-EM）单颗粒分析（SPA）已成为解析生物大分子高分辨率三维密度图的主要方法。由于一系列技术革新1,2,3,4,5,6，被称为“分辨率革命”7，cryo-EM 能够以前所未有的速度解析生物大分子结构，达到近原子乃至原子级分辨率。这一突破标志着分子认知新纪元的开启，使 cryo-EM 取代 X 射线晶体学成为主导技术，并解答了长期存在的生物学问题。

冷冻电镜单颗粒分析（Cryo-EM SPA）不同于X射线晶体学，无需对生物大分子进行结晶。相反，含有目标生物大分子的溶液被迅速冷冻形成玻璃态冰，随后用电子束成像，获得一系列显微照片，从而避免了结晶步骤8。接着，利用颗粒挑选算法从这些显微照片中提取单个原始颗粒4,9,10,11,12。由于冷冻电镜不依赖结晶，所提取的颗粒中普遍存在损伤或处于非理想构象状态，因此需要经过多轮颗粒筛选才能获得高分辨率的密度图。在冷冻电镜单颗粒分析的图像处理中，颗粒筛选对于获得高分辨率密度图至关重要13。

在冷冻电镜单颗粒分析（cryo-EM SPA）中，标准的颗粒筛选方法包括二维（2D）和三维（3D）分类14。2D分类将颗粒归类为预定义数量的组别，为每一类生成一幅平均图像及相应的2D分辨率估计值。研究人员可随后对这些类别进行目视检查，剔除来自低分辨率组别的颗粒，并将剩余颗粒用于旨在获得更高分辨率的重构。一旦通过精修算法确定了颗粒的取向，研究人员将进行3D分类，将颗粒聚类为多个类别。这使得研究人员能够对每个类别的重构密度图进行目视评估，从而排除不理想的颗粒，例如来自非目标构象的颗粒。经过多轮分类后，可获得一个由相对高质量颗粒组成的最终颗粒集。这些最终的颗粒集对于生成原子或近原子分辨率的密度图至关重要。

Zhu 及其同事已证明，可对这些最终的堆叠图像进一步进行颗粒筛选15。CryoSieve15 是一种创新的迭代式颗粒筛选方法，可通过显著减少颗粒数量来提升最终密度图的质量。尽管目前领域内仍在使用其他颗粒分类标准和软件，例如归一化互相关（NCC）方法16、角度图一致性（AGC）方法17以及非对齐分类5，但该方法在有效性方面已显示出优于这些算法的表现。

本研究中，我们提供了整个流程的详细指南。作为案例研究，我们将这一新方法应用于流感血凝素三聚体的数据集（EMPIAR 条目：10097）18，该数据集最终堆叠中包含 130,000 个颗粒。我们的流程成功剔除了该数据集最终堆叠中约 73.8% 的颗粒，使重构密度图的分辨率从 4.11 Å 提高到 3.62 Å。除了流感血凝素三聚体外，先前的出版物中还展示了多个数据集的结果15，涵盖了多种生物分子的不同分辨率和分子量。

方案

1. 安装

  1. 检查并配置GPU加速环境
    1. 打开终端并输入命令：nvidia-smi。确保该命令成功显示所有关于GPU卡的信息，并且CUDA版本高于10.2。执行命令：conda -V，以检查是否已安装Conda（补充图1）。
  2. 配置虚拟环境
    1. 输入以下命令以创建虚拟环境，将CRYOSIEVE_ENV替换为您希望使用的环境名称：conda create -n CRYOSIEVE_ENV python=3.8 cudatoolkit=10.2 cupy=10.0 pytorch=1.10 -c pytorch -c conda-forge。等待几分钟，直到环境成功配置（补充图2）。
      注意：用户可根据需要灵活修改环境名称。所提供的命令适用于CUDA 10.2。如果需要使用其他CUDA版本，请相应调整cudatoolkit的版本号。
  3. 安装CryoSieve
    1. 通过执行命令：conda activate CRYOSIEVE_ENV，激活该环境。运行以下命令之一安装软件：pip install cryosieve 或 conda install -c mxhulab cryosieve（补充图3）。输入cryosieve -h，确认帮助信息正确显示（补充图4）。

2. 颗粒筛分

  1. 获取数据
    1. 从 EMPIAR 下载 EMPIAR-10097 最终堆栈数据集（参见材料表）。从 Github（参见材料表）下载 star 文件、掩膜文件（mask.mrc）和初始模型（用于重新估计步骤；initial.mrc）。将所有这些文件放在同一个文件夹中（补充图 5）。
      注意：https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos 仓库使用了 Git 大文件存储（Git LFS）。安装 Git LFS 对于完整克隆该仓库至关重要。或者，可通过 GitHub 链接访问文件，并点击 下载原始文件按钮来单独下载文件。
  2. 进行颗粒筛分处理
    1. 打开终端，使用命令：cd FILEPATH 导航至数据集所在文件夹。通过执行 conda activate CRYOSIEVE_ENV 激活 Conda 环境。
    2. 输入以下命令以启动颗粒筛分实验：cryosieve --reconstruct_software relion_reconstruct --postprocess_software relion_postprocess --i T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.star --o output/ --mask mask.mrc --angpix 1.3099979 --num_iters 10 --frequency_start 40 --frequency_end 3 --retention_ratio 0.8 --sym C3 --num_gpus 1 --balance（补充图 5）。运行过程中，终端将显示每次迭代的输出日志。
      注意：各选项的详细说明见补充文件 1。执行所需处理时间及最低配置要求详见补充文件 2。T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.star 是由 CryoSPARC 对从 EMPIAR 下载的 T40_HA_130K-Equalized_run-data.star 进行再优化所得，以减轻因取向估计技术进步带来的影响。

3. 寻找最佳迭代次数

  1. 检查分辨率
    1. 使用命令：grep "+ 最终分辨率：" output/_postprocess*.txt 以输出10次筛分迭代的分辨率结果图1）。由于在7中过滤的粒子堆栈th 迭代次数最多且粒子数最少时，很可能提供最佳结果。
      注意：为避免被丢弃的颗粒向保留的颗粒发生无意的信息传递15 为确保粒子堆栈在第7次迭代后的结果确实为最优，用户需对邻近的迭代执行重新估计步骤。在本方案中，需处理第4、5、6、7和8次迭代 接受验证。
  2. 导入过筛颗粒
    1. 打开 CryoSPARC 网络界面并按以下步骤操作：进入一个工作区并点击 构建者 面板右上角的按钮。在面板中，选择并点击 导入粒子堆栈 选项。在“粒子堆栈导入”面板的“参数”部分，将粒子元数据路径指定为输出文件夹中已完成结果的 _iter{n}.star 文件，将粒子数据路径指定为存储 mrcs 文件的文件夹。单击 队列任务 按钮，然后单击 队列 按钮以启动该过程。采用相同方法导入其余需要重新估算的迭代。补充图 6A).
  3. 导入初始模型
    1. 点击 构建者 面板右上角的按钮。在面板中，选择并点击 导入三维体积数据 选项
    2. 将体积数据路径指定为 initial.mrc 文件。点击 队列任务 按钮，然后单击 队列 按钮以启动该过程（补充图6B).
      注意：初始模型也可以通过以下方式生成 从头算 重建补充文件 3).
  4. 均一化优化（构建任务）
    1. 点击 构建者 面板右上角的按钮。在面板中，选择并点击 均一化 refinement 选项
      注意：非均匀精修同样适用。
  5. 均一化精修（导入颗粒）
    1. 在左侧主面板中，打开用于导入5的颗粒堆栈的作业th 迭代（或所需的迭代次数）。从主面板右侧拖动导入的粒子模块，将其放入右侧构建器中的粒子堆栈部分。通过点击红色 X 位于主面板右上角。
    2. 打开用于导入3D体积数据的任务。从主面板右侧拖动“导入的体积数据”模块，将其放入右侧构建器中的“初始体积”部分。
  6. 均一化 refinement（修改参数）
    1. 在“参数”折叠菜单中，找到“对称性”选项并将其设置为 C3。找到“重新计算力 GS 分裂”选项并禁用它。点击 队列任务 按钮，然后单击 队列 点击按钮以启动同质化 refinement。使用相同方法对剩余迭代执行同质化 refinement。补充图 6C-D).
      注意：Force re-do GS split 选项至关重要。禁用此选项可确保 CryoSPARC 保留 star 文件提供的黄金标准划分，从而避免过拟合。有关禁用 Force Re-do GS Split 的详细依据，可参见 补充文件 4.
  7. 等待所有任务运行完成以获取结果。根据结果确认，已对6中的粒子堆栈进行了过滤th 迭代是 实际最佳结果。
    注意：实验结果与本方案中提供的结果存在轻微的随机偏差是正常现象，此类偏差不会影响总体结论。

结果

在本实验方案中，我们采用流感病毒血凝素三聚体数据集（EMPIAR 条目：10097）来展示该流程的有效性。由于样品存在取向偏好，数据采集需倾斜40°进行。该蛋白质具有C3对称性，分子量为150 kDa。

我们已采用前述方案处理最终的颗粒堆栈。该方案在每次迭代中逐步去除20%的颗粒， resulting in 保留比例分别为80.0%、64.0%、51.2%，依此类推。如图所示 图1 和 图2，被保留颗粒的分辨率最初有所提高，但最终下降。在各次迭代中，第6次th 迭代被确定为最优子集，其包含的颗粒数最少，却达到了最高分辨率。我们的算法成功筛选出仅占原始堆栈26.2%的颗粒子集，使分辨率从4.19 Å提升至3.62 Å（由CryoSPARC重新估算）, 如图所示 图2此外，还比较了使用CryoSieve前后的密度图 图3模型与电子密度图的傅里叶壳层相关系数（FSC）曲线，以及重构密度图在应用该方法前后的半图FSC曲线也一并展示 (图3A-乙）将获得的原始密度图与锐化密度图进行了比较，并应用了相同的等高线水平 (图3C)尖锐密度图的侧链进行了比较，显示出重建密度图的增强效果。同时采用估计的Rosenthal-Henderson B因子作为颗粒质量的评价标准。19在去除最终堆叠中的大部分颗粒后，Rosenthal-Henderson B因子从226.9 Å升高2 至 146.2 Å2 (图3D)局部分辨率，局部B因子20，以及 ResLog21 也用于比较，表明CryoSieve确实提高了密度图的质量和颗粒质量 (图4).

显示最终分辨率值的终端命令结果，数据分析截图。
图 1：每次迭代的分辨率。已报告的分辨率用红色框标出。请点击此处查看该图的放大版本。

冷冻电镜数据处理流程；作业状态表；颗粒精细优化；结构分析。
图 2：各次迭代的分辨率。由均一精细优化作业确定的分辨率以红色框标出。请点击此处查看该图的放大版本。

FSC 曲线、GSFSC 分辨率图、3D 图谱比较、Rosenthal Henderson B 因子分析。
图 3：密度图谱。（A） 使用 CryoSieve 前后重建密度图谱的模型与图谱间 FSC 曲线比较。y 轴表示 FSC，x 轴表示分辨率。红色虚线标记 FSC 的 0.5 阈值。垂直虚线表示在 0.5 阈值下获得的密度图谱分辨率。（B） 通过 CryoSPARC 获取使用 CryoSieve 前后重建密度图谱的半图谱 FSC 曲线。y 轴表示 FSC，x 轴表示分辨率。（C） 显示了最终堆叠中 CryoSieve 保留粒子和全部粒子的原始密度图谱与锐化密度图谱。原始密度图谱采用 0.65 的等值轮廓水平。锐化密度图谱采用 0.84 的等值轮廓水平。锐化密度图谱由 CryoSPARC 直接生成。锐化密度图谱经过自动后处理，首先进行 FSC 加权（基于 CryoSPARC 提供的 FSC 值），然后使用自动确定的 B 因子对 B 因子进行锐化（最终堆叠中所有粒子为 232.0 Å2，CryoSieve 为 160.8 Å2）。通过引入原子模型作为参考，比较了锐化密度图谱中的侧链结构。红色箭头标示出改进的区域。（D） 显示了最终堆叠中 CryoSieve 保留粒子和全部粒子的估计 Rosenthal-Henderson B 因子。y 轴表示所用粒子数量，x 轴表示分辨率平方的倒数。从上到下，每个点代表前一个点所用粒子数的一半。分辨率由精修确定。B 因子通过测量点的最小二乘法拟合曲线确定，如拟合曲线所示。图例中标明了估计的 Rosenthal 和 Henderson B 因子：橙色代表 CryoSieve 保留的粒子，蓝色代表最终堆叠中的全部粒子。请点击此处查看该图的放大版本。

CryoSieve 蛋白质结构评估；分辨率数据分析的对比图表和模型。
图 4：密度图多种指标的比较。 (A) 使用 CryoSieve 前后由 CryoSPARC 获得的局部分辨率图的比较。局部分辨率范围为 7 Å（红色）至 3.5 Å（蓝色）。 (B) 使用 CryoSieve 前后密度图的比较，颜色根据 LocBFactor 使用 [20–3.5] Å 分辨率范围获得的局部 B 因子图着色。 (C) 使用 CryoSieve 前后由 CryoSPARC 获得的 ResLog 图的比较。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：使用命令 nvidia-smi 和 conda -V 验证先决条件。 如果满足先决条件，输入命令 nvidia-smi 将显示 GPU 驱动版本、CUDA 版本以及 GPU 显卡的状态。同样，输入命令 conda -V 应正确显示已安装的 Conda 版本。 请点击此处下载该文件。

补充图2：创建新的GPU加速环境的过程。 屏幕显示了用于创建Conda环境的命令所生成的输出。请点击此处下载该文件。

补充图3：在GPU加速环境中安装CryoSieve。激活新创建的Conda环境后，屏幕显示执行使用Pip安装CryoSieve命令后的输出结果。 请点击此处下载该文件。

补充图4：帮助信息。 请点击此处下载该文件。

补充图5：运行过程。 通过命令行执行CryoSieve后，屏幕将显示有关运行过程的信息。 请点击此处下载该文件。

补充图6：CryoSPARC作业的配置。（A）导入颗粒堆栈。（B）导入三维体积数据。（C-D）均一性 refinement。请点击此处下载该文件。

补充文件1：CryoSieve的选项。 请点击此处下载该文件。

补充文件 2：运行 Cryosieve 的处理时间及最低系统要求。 请点击此处下载该文件。

补充文件 3：通过 CryoSPARC 生成初始模型。 请点击此处下载该文件。

补充文件 4：禁用强制重新执行 GS 分割的原理。 请点击此处下载该文件。

补充文件 5：cryosieve-csrefine 的选项。 请点击此处下载该文件。

补充文件6：cryosieve-csrhbfactor的选项。 请点击此处下载该文件。

讨论

冷冻电镜（cryo-EM）是解析生物大分子结构的关键技术。在此过程中，通过显微成像采集数据后，必须从显微图像中提取颗粒，并经过多个阶段的分类，以构建最终的颗粒堆栈。一个常见的挑战是颗粒中存在大量受损或构象不理想的样本，因此需要反复进行颗粒筛选，以获得高分辨率的密度图。这使得颗粒筛选成为冷冻电镜单颗粒分析（SPA）中获取高质量密度图的关键步骤。现有的颗粒筛选技术包括统计非倾斜验证算法22、基于z分数的方法23以及角度精度估计法24。

在此背景下，CryoSieve 成为一种有价值的工具，能够从最终堆栈中有效去除大量无关颗粒。这种减少不仅提高了重构的计算效率，还简化了处理流程。它提供了一套完整的颗粒筛选方案，其中颗粒剔除的程度以及分辨率随之提升的效果，在很大程度上取决于初始数据的质量以及所采用的数据处理方法。

在本论文中，我们展示了使用流感血凝素三聚体真实数据集（EMPIAR 条目：10097）进行颗粒筛选的完整工作流程。本文涵盖并讨论的步骤可概括为颗粒筛选与构象重新估计。最终获得的三维重构体积分辨率达到 3.62 Å，在后处理后的密度图中，α-螺旋中的侧链比已发表的密度图更为清晰。

CryoSieve 是一种开源方法，可在 GitHub 上获取（https://github.com/mxhulab/cryosieve）。其主页上也提供了详细的使用教程。用户可根据教程安装并使用该方法。此外，还提供了两个模块：cryosieve-csrefine 和 cryosieve-csrhbfactor。其中，cryosieve-csrefine 模块专门用于在 CryoSPARC 中自动顺序执行多种操作（补充文件 5），这些操作包括导入粒子堆栈，以及进行从头重构（ab initio）、均一化精细重构或非均匀精细重构任务。而 cryosieve-csrhbfactor 模块则旨在利用 cryosieve-csrefine 的功能，自动确定 Rosenthal-Henderson B 因子（补充文件 6）。

目前，该方法的应用仅限于单一构象的情况。因此，在颗粒代表多种构象的情形下，其能力受到限制。建议用户在使用该方法进行精细颗粒筛选之前，首先进行三维分类，以分离不同构象的颗粒。此外，尽管该方法在从最终堆栈中过滤掉超过50%的颗粒方面表现出色，但被丢弃颗粒的来源及其对重构质量贡献甚微的根本原因仍不明确。这一认知上的空白需要进一步研究，以全面阐明并可能克服这一局限性。

目前存在三种可能的颗粒分选或颗粒筛分方法。首先，cisTEM4 在完成三维重构后，可为每张单颗粒图像提供一个评分。用户可根据cisTEM评分对颗粒进行分选并剔除不合格颗粒。角图一致性（angular graph consistency, AGC）方法17 也是一种用于剔除错配颗粒的方法。此外，非对齐分类5 是一种利用三维分类剔除颗粒的传统方法。我们将这些方法保留的颗粒质量与CryoSieve进行比较，发现CryoSieve保留的颗粒质量更高15。本文提出的方法显著优于其他替代方法，并在相同分辨率下实现了最少的颗粒数量。

如结果所示，冷冻电镜最终堆叠中的大多数颗粒并未对密度图重构产生贡献。换句话说，在图像采集过程中收集到的所有颗粒中，只有一小部分精选出的最优子集实际参与了最终的重构。因此，该最终子集与所收集颗粒总数的比率可作为评估样品质量的定量指标。这一比率越高，表明样品质量越好。尽管技术进步已使冷冻电镜在结构生物学家中变得更加普及，样品制备仍是工作流程中的主要瓶颈。因此，科研人员和工程师正将精力集中于应对这一挑战25。在单颗粒分析（SPA）中，样品制备包括两个关键步骤：样品优化和载网制备。前者涉及在保持样品最佳生物化学状态的前提下对其进行纯化；后者则包括为在显微镜下进行分析而进行的样品前处理，如载网的化学或等离子体处理、样品滴加以及玻璃化固定。已有多种技术被提出以应对大分子不稳定性问题，但不同方法之间的有效性取决于样品的具体特性25,26。目前，载网制备的结果在很大程度上依赖于操作者的专业知识和经验，这可能使整个过程耗时且具有挑战性27,28。样品和载网制备过程中存在的众多变量使得建立因果关系变得困难，因为研究人员只能通过显微镜在分子水平上评估样品。因此，目前仍缺乏针对不同样品和载网制备方案的定量统计比较，有必要采用系统性方法来探究趋势并深入理解样品行为的基本机制29。

披露

其余所有作者均声明不存在竞争利益。

致谢

本工作由深圳科研与翻译研究院（M.H.）、结构生物学先进创新中心（M.H.）、北京生物结构前沿研究中心（M.H.）及国家关键研发计划&中国国家重点研发计划（No.2021YFA1001300）（资助C.B.），国家自然科学基金（No.12271291）（资助C.B.），以及国家自然科学基金（No.12071244）（资助Z.S.）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CryoSPARCStructura Biotechnology Inc. 多伦多，加拿大CryoSPARC（冷冻电镜单颗粒从头重构与分类）是一款先进的高性能计算（HPC）软件解决方案，用于完整处理单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）数据。CryoSPARC 可用于解析膜蛋白、病毒、复合物、柔性分子、小颗粒、相位板数据以及负染数据的 cryo-EM 结构。
EMPIAR-10097 数据集https://ftp.ebi.ac.uk/empiar/world_availability/10097/data/Particle-Stack/T40_HA_130K-Equalized-Particle-Stack.mrcs该数据集包含流感血凝素三聚体的单颗粒冷冻电镜数据，具有高度优势取向，采用 40 度倾斜采集策略获得。
initial.mrchttps://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097
mask.mrchttps://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097
RELION4.0-beta-2RELION（正则化似然优化）是一款用于冷冻电子显微镜（cryo-EM）数据处理的开源软件，特别适用于大分子结构的高精度重构。该软件采用贝叶斯方法，在信号与噪声分离方面表现优异，能够实现高分辨率结构解析。RELION 支持单颗粒分析、电子断层成像以及亚断层平均化，因其高效性和用户友好的界面，已在结构生物学领域得到广泛应用。
T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.starhttps://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097来自 EMPIAR-10097 的最终粒子堆栈的元数据文件

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