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方法文章

液相色谱-串联质谱在天然产物研究中的应用：以托烷生物碱为例

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DOI：

10.3791/66620

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2024年3月8日

 ,  , 
1Department of Chemistry, Northern Michigan University

本文内容

摘要

我们提出了一种基于质谱（MS）/质谱（MS）的快速标注与分类莨菪烷类生物碱的方法，该方法既可用于含莨菪烷样品的初步去重，也可用于发现需分离的新生物碱。

摘要

尽管当今使用的许多药物均为合成来源，天然产物仍为新颖的化学多样性和生物活性提供了丰富来源，并可为耐药性或新发疾病提供有前景的先导化合物。然而，这一领域面临双重挑战：研究人员不仅需要发现天然产物并阐明其结构，还必须确定哪些成分值得分离和检测（同时排除已知化合物，这一过程称为去重复化）。随着现代分析仪器的发展，天然产物的发现与去重复化进程已显著加快。液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）已成为识别和分类化学结构的特别有价值的技术。托烷类生物碱（TAs）是一类具有重要药理和毒理意义的植物源性化合物。在本研究中，我们开发了一种基于LC-MS/MS的筛选工作流程，利用三重四极杆（QQQ）质谱仪上可用的多种MS/MS模式，根据其特有的碎片化模式对TAs结构进行注释和分类。通过结合使用数据依赖型（DD）产物离子扫描、前体离子扫描（PrIS）和中性丢失扫描（NLS），我们将该方法应用于富含托烷类生物碱的茄科植物Datura stramonium和Datura metel的提取物分析。该方法快速、灵敏，成功用于含复杂TAs样品的初步去重复化，并发现了一个新的候选化合物，可用于后续的分离、纯化及最终的生物活性检测。

引言

尽管全合成分子在近几十年的药物发现中变得越来越重要，但过去39年中获批的所有药物中仍有近三分之二为天然产物或受天然产物启发而开发的药物1,2 ，这凸显了天然产物研究持续的重要性。生物碱是一类含氮的天然产物，因其药用价值而备受重视。托烷类生物碱（TAs）含有[3.2.1.]双环含氮结构，主要由茄科（茄科植物）、古柯科（Erythroxylaceae）和旋花科（Convolvulaceae）植物产生。代表性化合物包括阿托品、东莨菪碱和可卡因；此外，多种半合成或全合成的托烷类化合物也已应用于临床治疗3。TAs及其衍生物可用于治疗多种疾病3,4，其中一些药物被列入世界卫生组织2023年基本药物清单5。由于其强效的药理活性，TAs也被用于娱乐性用途（作为兴奋剂或致幻剂），并可能因摄入含此类成分的植物（或其制剂）而导致中毒6,7。TAs在人和动物食品中属于有害物质8，可能污染茶、香料、谷物、蜂蜜及草本补充剂9,10。 鉴于其潜在的药用价值和毒性风险，能够辅助发现新托烷类生物碱（以及鉴定已知TAs）的分析方法具有重要意义。

在串联质谱法（MS/MS）中，"质量过滤器"（例如四极杆、飞行时间管）在物理上相互连接（"空间串联"），或仪器采用额外的"时间串联"反应/分离步骤。空间串联MS/MS在不同的质量过滤器上使用不同模式，以选择和碎裂不同的离子（例如三重四极杆或QQQ仪器中的四极杆）。这些不同模式可用于确定特定离子产生的具体碎片（产物离子扫描）、样品中哪些离子产生特定碎片（前体离子扫描或PrIS）或发生特征质量的中性丢失（中性丢失扫描或NLS），以及特定化合物是否含有特定碎片（多反应监测）。因此，MS/MS提供的碎片信息可用于推断新化合物的结构或确认已知化合物的存在。MS/MS在药物发现、天然产物化学和代谢组学领域中的应用日益广泛11,12 ，并已被用于分析含生物碱物种的化学成分（用于植物化学表征或化学分类学分析），以及在食品或药用植物中检测和定量特定生物碱10,13,14,15,16。

尽管已有多种质谱技术可用，发现新生物碱仍面临诸多挑战。除了需要筛选合适的候选生物体外，对生物碱进行完整的结构确证也是一个艰巨的过程，可能涉及多种不同的分析技术。此外，研究人员可能分离出已知化合物，从而浪费人力、时间和资源。这一问题在萜类生物碱（TAs）中尤为突出，据报道已有数百甚至数千种TAs，其中许多互为同分异构体。该过程的 "识别已知因素并将其与未知因素区分开来" 被称为去重（dereplication）。已发表的不同生物碱（TAs）及其他化合物的保留时间（r.t.s）和质谱碎片数据库，可辅助这一过程17,18. 尽管如此，去重复化过程十分耗时；仅对样品完整LC-MS/MS色谱图中生物碱进行注释（即指认其可能结构）就需耗费大量时间。近年来，分子网络分析19,20 以及人工去重18,21,22 已用于苯基异喹啉、单萜吲哚和托烷类生物碱，而PrISs已被用于 "结构过滤" 通过光谱分析鉴定吡咯里西啶类和茄啶型生物碱23,24. 目前尚无针对含生物碱（TA）样品的基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的快速去重方法或工作流程，尽管生物碱具有共同且易于识别的碎片离子图1）。本文所述方法结合了数据依赖型（DD）产物离子扫描、前体离子扫描（PrISs）和中性丢失扫描（NLSs），通过一取代、二取代和三取代托烷类化合物特有的碎裂模式，对植物中托烷类生物碱（TA）结构进行注释与分类。图1A）以及这些生物碱中常见酯基团的丢失（图1B）。研究对象为茄属中的多个物种 曼陀罗. 多样化萜类生物碱的丰富来源， 曼陀罗 已被使用 在世界历史上被用于医药和文化目的17- 由于其含有大量结构相似的TAs，是一种难以去重的复杂基质，为我们提供了用于测试方法的理想样品。

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方案

警告：使用所列化学品前，请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。

1. 样品制备

警告：液氮可导致冻伤。请在通风良好的区域使用低温防护手套和眼部保护装置。含生物碱的植物样品可能对皮肤有刺激性；操作时务必佩戴手套。甲醇具有毒性和易燃性，应在通风橱中操作，并远离潜在的点火源。

注意：理论上可使用栽培或野生植物组织（干燥或新鲜研磨）；以下步骤仅为方法开发过程中所采用的流程。

  1. 若所用植物组织为新鲜材料，将其放入聚丙烯锥形管中，并浸入液氮中冷冻2-3分钟。
  2. 将冷冻后的植物组织转移至预冷的研钵中（置于盛有液氮的聚苯乙烯保温盒内），用预冷的研杵将组织研磨成均匀的粉末。
  3. 用预冷的刮勺迅速称取所需量的组织至已去皮重的聚丙烯微量离心管中，并立即加入20%甲醇（室温[RT]），每100 mg组织加入1 mL。
    注意：20%甲醇常用于提取TAs25。有时会添加0.1%甲酸，但在本方法及其他方法的开发过程中未观察到提取效率的差异。
  4. 将盖好的离心管置于摇床（中等速度）上，室温下至少振荡3小时。
  5. 在9464 × g 条件下离心10分钟。用移液器吸取上清液至液相色谱-质谱（LC-MS）自动进样瓶中；若上清液仍浑浊，需先经0.45 µm针头滤器过滤。
    注意：此步骤可作为暂停点，但处理后的植物新鲜样品及提取物在分析前应保存于-80 ˚C冰箱中，以避免生物碱可能发生降解。

2. 液相色谱-质谱仪配置与数据采集

警告：乙腈具有毒性和易燃性；应远离点火源，并在通风橱中控制其蒸气。甲酸具有腐蚀性；避免接触皮肤和眼睛，佩戴适当的个人防护装备。

  1. 使用配备电喷雾电离（ESI）源和反相高效液相色谱柱（C18，4.6 × 100 mm）的液相色谱-质谱联用仪。
  2. 对于高效液相色谱，使用含0.1%甲酸的H2以水作为溶剂A，乙腈中含0.1%甲酸作为溶剂B；用99% A和1% B平衡色谱柱。设置30分钟梯度洗脱程序：在26分钟内B相从1%线性增加至50%，在26.01分钟时返回至1% B，并在1% B条件下保持4分钟。色谱柱温度设为45 ˚C，流速为0.5 mL/min。
  3. 在LC-MS方法中，质谱仪的操作参数如下：接口电压：4.0 kV，雾化气体流速：3 L/min，加热气体流速：10 L/min，DL温度：250 ˚C，加热块温度：400 ˚C，接口温度：300 ˚C，干燥气体流速：10 L/min，碰撞诱导解离（CID）气体（氩气）压力：17 kPa。
  4. 在ESI正离子模式下建立一种质谱方法，该方法包含Q3扫描和Q1扫描（100–1000 Da），其中Q1扫描作为普查事件（持续时间与液相色谱方法一致），并启用自动同位素排除功能。将产物离子扫描作为Q1扫描的依赖事件（DD分析），设置质量窗口为50–1000 Da，碰撞池能量为-20 V，事件时间为 <0.2 秒。
    注意：触发Q1的DD产物离子扫描的计数阈值可以有所不同，但通常采用7,000–10,000计数的水平。在某些仪器上（例如本方法开发所用的仪器），Q3扫描比Q1具有更高的质荷比准确性和灵敏度，因此被纳入以确认在Q1扫描中观察到的离子，但即使省略步骤2.4中的Q3扫描也不会产生问题。
  5. 向上述质谱方法中添加正离子模式的PrISs，其长度与液相色谱方法相同，碰撞池能量为-20 V，事件时间为0.75 s。确保在所有情况下， 自动同位素排除，或 脱同位素 功能已启用。确保 m/z TA片段感兴趣值（单位：Da，参见 图1A分别为124.1（单取代TAs，质量窗口为125–1000 Da）、122.1和140.1（双取代TAs，质量窗口起始值分别为123和141 Da），以及156.1和138.1（三取代TAs，质量窗口起始值分别为157和139 Da）。
    注意：在方法开发过程中，PrIS 被分为两种不同的方法，一种用于单取代和二取代的 TAs，另一种用于三取代的 TAs，尽管它们可根据需要进行拆分或合并。
  6. 构建第二个质谱方法，包含步骤2.4中的参数。
    1. 在该MS/MS方法中，添加正离子模式的NLS，其长度与LC方法一致，碰撞池能量为-20 V，事件时间为0.75 s。在所有情况下均需确保， 自动同位素排除 或 脱同位素 功能已启用。
    2. 确保关注TA上酯类的中性丢失质量（以Da为单位，参见 图1B分别为100.05（来自惕各酸的酯类，质荷比范围110–1000 Da）、60.03（乙酰基，质荷比范围100–1000 Da）和166.06（苯乳酸或扁桃酸酯类，质荷比范围170–1000 Da）。
  7. 下载LC-MS方法，并为感兴趣的样品创建数据文件。当HPLC色谱柱在45 ˚C下平衡后，将感兴趣的样品以批次或项目文件形式进样，不同物种或组织类型之间应插入适当的提取溶剂空白。典型的进样体积为10–20 µL。
    注意：在样品体积特别大时，质谱检测器可能会饱和。若运行浓度很高的样品，务必确保电喷雾离子源已清洁，并定期对仪器进行调谐。在所有数据采集完成后，可在此暂停实验方案。

3. 数据分析

  1. 检查 Q1 和 Q3 扫描（以及 DD 产物离子扫描）的总离子色谱图，注意具有托烷生物碱（TA）特征的丰度较高离子的母离子质量：a) [M+H]+ 离子的质量<500 Da，通常为偶数质量，b) 使用上述液相色谱方法时典型的保留时间（r.t.）在 2–22 分钟之间，c) 来自以下列表的碎片离子：m/z 93、124、142、140、122、138、156、174、110 或 128 Da。
  2. 检查 m/z 124 的前体离子选择（PrIS）色谱图/通道，记录在哪些保留时间（在步骤 3.1 中已记录）的峰/离子会产生该碎片。逐次点击扫描色谱图，并结合依赖性解离（DD）产物离子扫描获得的完整二级质谱图进行分析，尤其针对低丰度物种。
    注意：真正含有该碎片的化合物会在多个扫描中出现，并同时在 Q1 和 Q3 扫描中被检测到（如果使用了后者）。支持信息中附有一个电子表格（补充文件 1），以辅助进行 注释。
  3. 对其他 PrIS 色谱图重复步骤 3.2。由于 m/z 122 和 140 均提示存在二取代托烷生物碱，而 m/z 138 和 156 均提示存在三取代托烷生物碱，因此应将这些色谱图/通道合并分析。
  4. 检查中性丢失扫描（NLS）色谱图/通道中 m/z 100、60 和 166 的信号，记录在哪些保留时间（在步骤 3.1 中已记录）的峰/离子会产生这些中性丢失。与 PrIS 分析类似，逐次点击扫描色谱图，并与 DD 产物离子扫描中获得的裂解谱图进行比较，尤其针对低丰度物种。
  5. 结合 PrIS 和 NLS 数据，并以 DD 产物离子扫描结果作为支持，通过将最小的托烷骨架质量（例如 124、122 或 138）与中性丢失质量相加，再计算剩余质量，对观测到的生物碱进行初步注释。
    注意：常见取代基团及其质量（Da）包括羟基（18）、乙酰基（60）、丙酰基（74）、异丁酰基（88）、惕各酰基（100）、饱和惕各酰基/2-甲基丁酰基（102）以及苯乳酸/扁桃酸（166）。
  6. 将生物碱的注释结果与文献17和数据库（如 MoNA）26中报道的结果进行比较，以确定哪些托烷取代模式已有报道，哪些可能是新化合物。此外，可使用市售的常见托烷生物碱标准品（如阿托品、勒托林、东莨菪碱）进行验证。
  7. 对于低丰度样品，为进一步获取结构信息（PrIS 和 NLS 可能检测到低于依赖事件阈值的离子），应对更浓缩的样品采集针对目标质量作为前体离子的特异性产物离子扫描。
    注意：本方法基于低分辨率三重四极杆（QQQ）仪器开发。对于所有初步鉴定的新化合物，应使用高分辨率质谱仪获取精确质量谱图。

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结果

为验证该方法的有效性，采用了一种标准的TAs混合物（10 µg/mL 乙酰托品/乙酰假托品混合物（单取代）各组分 10 µg/mL 每种混合物包含两种山莨菪碱异构体［二取代］，以及莨菪碱［单取代］、毒扁豆碱［单取代］和东莨菪碱［三取代］，均作为阳性对照进行分析（图2）。完整的 Q1 扫描色谱图（以基峰色谱图形式显示）如图所示 图2A，其中TA标准结构由其对应的峰表示。PrIS为 m/z 124 (图2B) 在其色谱图中显示出单取代托烷生物碱（TAs）的峰；因此，可观察到乙酰托品/假托品混合物、莨菪碱和 littorine 的峰。与乙酰托品和假托品相对应的峰在 m/z 124号色谱峰较小（可能是因为其浓度低于其他标准品，也可能是因为其产生的信号较弱） m/z 124 片段比其他单取代的 TAs 更弱。尽管如此，它们在这张色谱图以及相应的 PrIS 通道中仍然可以被检测到。 图 2C 和

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讨论

尽管 本方案中提供的仪器参数可实现良好的运行效果，但该方法的成功应用可能需要对若干关键步骤予以仔细关注或优化。尽管步骤2.2中提供的高效液相色谱（HPLC）溶剂梯度通常适用于托烷类生物碱，但其可能需要根据待测样品或植物物种的托烷类生物碱谱型进行调整。样品进样体积也可根据仪器的灵敏度及方法的具体应用情况进行调整。 "深度" 代谢谱分析或去重复化应使用较大的进样体积（本研究中使用了15–20 µL），而仅对生物碱进行简单检测时可使用较小的体积。使用大体积样品时需注意：（a）定期清洁离子源；（b）监测高效液相色谱柱的压力变化或堵塞情况（应始终使用合适的保护柱）；（c）防止样品间的交叉污染；（d）检查色谱图中可能存在的 "同位素泄漏" 如上所述。为避免过早发生源内碎裂，接口温度和电压不应显著偏离方法中规定的数值。此外，尽管建议碰撞池电压为20 V，但该参数可能无法对所有萜类生物碱（TAs）均提供最佳的色谱信号（或特征性DD产物离子扫描碎片）。某些质谱仪及其功能具有 "碰撞能量梯度" 特征，或在多种或优化的碰撞能量下采集扫描数据的能力，这一功能在此类方法中也可能具有应用价值

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由北密歇根大学教师研究资助（授予 M.A.C.）、北密歇根大学本科生研究奖学金（授予 J.C）以及化学系资助。作者感谢 John Berger（NMU）在植物组织制备方面的协助，感谢 Hannah Hawkins（NMU）在液相色谱-质谱（LC-MS）仪器维护和故障排除方面的帮助，感谢 Ryan Fornwald 博士及其 CH 495（天然产物合成）课程的学生们制备乙酰托品混合物。作者还感谢 Daniel Jones 博士（密歇根州立大学）协助获取高分辨 MS/MS 谱图。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙腈，用于超高效液相色谱，适用于质谱分析Sigma-Aldrich900667HPLC溶剂
氩气AirGasAR UHP300CID气体
甲酸，99% 分析纯Thermo ScientificAC270480010HPLC添加剂
保护柱柱套Restek25812
高效液相色谱仪，Shimadzu LC-2030C 3D PlusShimadzu228-65802-58HPLC色谱柱
液相色谱-质谱联用仪，Shimadzu LCMS-8045Shimadzu225-31800-44质谱仪；我们使用LabSolutions软件，该软件为Shimadzu仪器的标准配置
液氮AirGasNI 180LT22
甲醇，用于HPLC/UHPLC/LCMSVWRBDH 85800.400用于配制提取溶剂
微量离心机 VWR2400-37
微量离心管，1.5 mLFisher Scientific05-408-129
研钵 Fisher ScientificFB961C用于研磨植物组织
研杵Fisher ScientificFB961M用于研磨植物组织
移液器 1000 µLGilson F144059M
移液器吸头 1000 µLFisher scientific02-707-404
植物组织多种来源N/A可为野生或栽培植物材料
聚丙烯圆锥形离心管，15 mLFisher Scientific05-539-4
聚苯乙烯保温箱ULINES-18312适用于分子生物学试剂运输所用的保温箱类型
Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mmRestek9534315HPLC色谱柱
Roc C18, 10 mm x 4 mmRestek953450210保护柱
摇床振荡器Themo Scientific11-676-680
螺口小瓶便捷套装（9 mm）Fisher scientific13-622-190LCMS自动进样器小瓶
注射器，3 mLFisher Scientific03-377-27
注射器滤器，0.45 µm Avantor/VWR76479-008
水，用于液相色谱和质谱分析JT Baker9831-03用于配制提取溶剂
水溶液，含0.1% v/v甲酸，用于超高效液相色谱，适用于质谱分析Sigma-Aldrich900687-1LHPLC溶剂

参考文献

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