液相色谱-串联质谱在天然产物研究中的应用：以托烷生物碱为例

摘要

我们提出了一种基于质谱（MS）/质谱（MS）的快速标注与分类莨菪烷类生物碱的方法，该方法既可用于含莨菪烷样品的初步去重，也可用于发现需分离的新生物碱。

摘要

尽管当今使用的许多药物均为合成来源，天然产物仍为新颖的化学多样性和生物活性提供了丰富来源，并可为耐药性或新发疾病提供有前景的先导化合物。然而，这一领域面临双重挑战：研究人员不仅需要发现天然产物并阐明其结构，还必须确定哪些成分值得分离和检测（同时排除已知化合物，这一过程称为去重复化）。随着现代分析仪器的发展，天然产物的发现与去重复化进程已显著加快。液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）已成为识别和分类化学结构的特别有价值的技术。托烷类生物碱（TAs）是一类具有重要药理和毒理意义的植物源性化合物。在本研究中，我们开发了一种基于LC-MS/MS的筛选工作流程，利用三重四极杆（QQQ）质谱仪上可用的多种MS/MS模式，根据其特有的碎片化模式对TAs结构进行注释和分类。通过结合使用数据依赖型（DD）产物离子扫描、前体离子扫描（PrIS）和中性丢失扫描（NLS），我们将该方法应用于富含托烷类生物碱的茄科植物Datura stramonium和Datura metel的提取物分析。该方法快速、灵敏，成功用于含复杂TAs样品的初步去重复化，并发现了一个新的候选化合物，可用于后续的分离、纯化及最终的生物活性检测。

引言

尽管全合成分子在近几十年的药物发现中变得越来越重要，但过去39年中获批的所有药物中仍有近三分之二为天然产物或受天然产物启发而开发的药物^1,2 ，这凸显了天然产物研究持续的重要性。生物碱是一类含氮的天然产物，因其药用价值而备受重视。托烷类生物碱（TAs）含有[3.2.1.]双环含氮结构，主要由茄科（茄科植物）、古柯科（Erythroxylaceae）和旋花科（Convolvulaceae）植物产生。代表性化合物包括阿托品、东莨菪碱和可卡因；此外，多种半合成或全合成的托烷类化合物也已应用于临床治疗³。TAs及其衍生物可用于治疗多种疾病^3,4，其中一些药物被列入世界卫生组织2023年基本药物清单⁵。由于其强效的药理活性，TAs也被用于娱乐性用途（作为兴奋剂或致幻剂），并可能因摄入含此类成分的植物（或其制剂）而导致中毒^6,7。TAs在人和动物食品中属于有害物质⁸，可能污染茶、香料、谷物、蜂蜜及草本补充剂

方案

警告：使用所列化学品前，请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。

1. 样品制备

警告：液氮可导致冻伤。请在通风良好的区域使用低温防护手套和眼部保护装置。含生物碱的植物样品可能对皮肤有刺激性；操作时务必佩戴手套。甲醇具有毒性和易燃性，应在通风橱中操作，并远离潜在的点火源。

注意：理论上可使用栽培或野生植物组织（干燥或新鲜研磨）；以下步骤仅为方法开发过程中所采用的流程。

1. 若所用植物组织为新鲜材料，将其放入聚丙烯锥形管中，并浸入液氮中冷冻2-3分钟。
2. 将冷冻后的植物组织转移至预冷的研钵中（置于盛有液氮的聚苯乙烯保温盒内），用预冷的研杵将组织研磨成均匀的粉末。
3. 用预冷的刮勺迅速称取所需量的组织至已去皮重的聚丙烯微量离心管中，并立即加入20%甲醇（室温[RT]），每100 mg组织加入1 mL。
   注意：20%甲醇常用于提取TAs²⁵。有时会添加0.1%甲酸，但在本方法及其他方法的开发过程中未观察到提取效率的差异。
4. 将盖好的离心管置于摇床（中等速度）上，室温下至少振荡3小时。
5. 在9464 × g 条件下离心10分钟。用移液器吸取上清液至液相色谱-质谱（LC-....

结果

为验证该方法的有效性，采用了一种标准的TAs混合物（10 µg/mL 乙酰托品/乙酰假托品混合物（单取代）各组分 10 µg/mL 每种混合物包含两种山莨菪碱异构体［二取代］，以及莨菪碱［单取代］、毒扁豆碱［单取代］和东莨菪碱［三取代］，均作为阳性对照进行分析（图2）。完整的 Q1 扫描色谱图（以基峰色谱图形式显示）如图所示 图2A，其中TA标准结构由其对应的峰表示。PrIS为 m/z 124 (图2B) 在其色谱图中显示出单取代托烷生物碱（TAs）的峰；因此，可观察到乙酰托品/假托品混合物、莨菪碱和 littorine 的峰。与乙酰托品和假托品相对应的峰在 m/z 124号色谱峰较小（可能是因为其浓度低于其他标准品，也可能是因为其产生的信号较弱） m/z 124 片段比其他单取代的 TAs 更弱。尽管如此，它们在这张色谱图以及相应的 PrIS 通道中仍然可以被检测到。 图 2C 和

讨论

尽管 本方案中提供的仪器参数可实现良好的运行效果，但该方法的成功应用可能需要对若干关键步骤予以仔细关注或优化。尽管步骤2.2中提供的高效液相色谱（HPLC）溶剂梯度通常适用于托烷类生物碱，但其可能需要根据待测样品或植物物种的托烷类生物碱谱型进行调整。样品进样体积也可根据仪器的灵敏度及方法的具体应用情况进行调整。 "深度" 代谢谱分析或去重复化应使用较大的进样体积（本研究中使用了15–20 µL），而仅对生物碱进行简单检测时可使用较小的体积。使用大体积样品时需注意：（a）定期清洁离子源；（b）监测高效液相色谱柱的压力变化或堵塞情况（应始终使用合适的保护柱）；（c）防止样品间的交叉污染；（d）检查色谱图中可能存在的 "同位素泄漏" 如上所述。为避免过早发生源内碎裂，接口温度和电压不应显著偏离方法中规定的数值。此外，尽管建议碰撞池电压为20 V，但该参数可能无法对所有萜类生物碱（TAs）均提供最佳的色谱信号（或特征性DD产物离子扫描碎片）。某些质谱仪及其功能具有 "碰撞能量梯度" 特征，或在多种或优化的碰撞能量下采集扫描数据的能力，这一功能在此类方法中也可能具有应用价值

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙腈，用于超高效液相色谱，适用于质谱分析	Sigma-Aldrich	900667	HPLC溶剂
氩气	AirGas	AR UHP300	CID气体
甲酸，99% 分析纯	Thermo Scientific	AC270480010	HPLC添加剂
保护柱柱套	Restek	25812
高效液相色谱仪，Shimadzu LC-2030C 3D Plus	Shimadzu	228-65802-58	HPLC色谱柱
液相色谱-质谱联用仪，Shimadzu LCMS-8045	Shimadzu	225-31800-44	质谱仪；我们使用LabSolutions软件，该软件为Shimadzu仪器的标准配置
液氮	AirGas	NI 180LT22
甲醇，用于HPLC/UHPLC/LCMS	VWR	BDH 85800.400	用于配制提取溶剂
微量离心机	VWR	2400-37
微量离心管，1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
研钵	Fisher Scientific	FB961C	用于研磨植物组织
研杵	Fisher Scientific	FB961M	用于研磨植物组织
移液器 1000 µL	Gilson	F144059M
移液器吸头 1000 µL	Fisher scientific	02-707-404
植物组织	多种来源	N/A	可为野生或栽培植物材料
聚丙烯圆锥形离心管，15 mL	Fisher Scientific	05-539-4
聚苯乙烯保温箱	ULINE	S-18312	适用于分子生物学试剂运输所用的保温箱类型
Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mm	Restek	9534315	HPLC色谱柱
Roc C18, 10 mm x 4 mm	Restek	953450210	保护柱
摇床振荡器	Themo Scientific	11-676-680
螺口小瓶便捷套装（9 mm）	Fisher scientific	13-622-190	LCMS自动进样器小瓶
注射器，3 mL	Fisher Scientific	03-377-27
注射器滤器，0.45 µm	Avantor/VWR	76479-008
水，用于液相色谱和质谱分析	JT Baker	9831-03	用于配制提取溶剂
水溶液，含0.1% v/v甲酸，用于超高效液相色谱，适用于质谱分析	Sigma-Aldrich	900687-1L	HPLC溶剂