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方法文章

基于寒凝血瘀型原发性痛经大鼠模型的神阙穴隔药灸疗法

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DOI：

10.3791/66622

⸱

2024年10月4日

 ,  ,  ,  , 
1The Third Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University, 2The Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, 3Department of Neurobiology and Acupuncture Research, Key Laboratory of Acupuncture and Neurology of Zhejiang Province

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文详细描述了在治疗寒凝血瘀型原发性痛经大鼠时，对脐部进行隔药灸的操作步骤及注意事项。该方法可显著改善痛经大鼠的扭体反应，缓解疼痛症状。

摘要

原发性痛经（PDM）是指在无明显盆腔器质性病变的情况下，出现的以下腹部痉挛性绞痛为主要表现的病症，常伴有其他全身症状，显著降低了患PDM女性的生活质量，影响了45%–95%的经期女性。尽管PDM发病率高，但常得不到有效治疗，也易被相关研究人员及女性自身所忽视。隔药灸（HPM）是中医外治法中的一种特色疗法，在中国广泛用于多种疾病的治疗；该疗法通过将中药方剂置于患者穴位上，再于药上点燃艾柱进行艾灸治疗。本研究所用药材的主要功效为通经活络、温阳散寒，以促进气机运行从而缓解疼痛。艾灸产生的热刺激可加速药物成分向人体内的渗透。因此，隔药灸融合了穴位、药物与热刺激三重作用，适用于妇科疾病的治疗，尤其适合PDM等功能性疾病的干预。本文详细描述了在雌性实验大鼠神阙（CV8）穴位实施隔药灸的操作步骤及注意事项，为今后进一步推广和促进隔药灸在PDM脐部治疗中的应用与发展提供了实验依据。

引言

原发性痛经（PDM），也称为功能性痛经，是影响青春期女孩和育龄期年轻女性最常见的妇科疾病之一1。其特征是在月经前后出现腹痛和子宫收缩（痉挛）等不适症状，并伴有腹部炎症反应，但无盆腔器质性病变的证据2。下腹部绞痛是多囊型PDM的典型症状，通常在月经来潮后8-72小时内开始，在月经量增多的最初几天达到高峰3,4，有时疼痛会放射至背部和大腿。由于对该病症的定义不同，且缺乏评估月经疼痛强度的标准化方法，因此估计女性中痛经的患病率在45%至95%之间3,4,5。约有10%至25%的育龄期女性被认为患有严重的PDM6。PDM的患病率在20至24岁年龄组中最高，之后随年龄增长而逐渐下降2。PDM以周期性下腹痛为主要表现，常伴随其他全身症状，如腰痛、恶心、呕吐、头痛、食欲减退、腹泻7，甚至出现抑郁和焦虑等精神症状8,9。在月经期间，患有痛经的女性整体生活质量明显下降4,8,10。

此外，研究发现反复的经期疼痛可能影响中枢神经系统的功能，导致在疼痛期和无痛期的痛觉感知均发生改变11。由于原发性痛经（PDM）的病因与前列腺素（PGs）有关，目前最常用的药物治疗是非甾体抗炎药（NSAIDs）12,13，其次是口服避孕药14。除了药物的副作用外，有10%–20%的人群对NSAIDs和避孕药治疗无反应3。当前大多数研究关注的是痛经对大脑结构和生理功能的影响，而对治疗策略的关注较少。因此，迫切需要找到一种可在临床实践中广泛应用、疗效确切且易于被患者接受的治疗方案。

隔药灸是一种中医特色外治疗法，在中国广泛用于治疗多种疾病。其优点包括成本低、无副作用、远期疗效好、操作简便且易于被患者接受。研究发现，隔药灸作用于神阙穴对原发性痛经具有显著疗效15，这可能与调节子宫寒热虚实状态以及肥大细胞及其相关受体有关16。研究团队已证实，隔药灸可迅速缓解痛经症状17。

张仲景最初在《金匮要略·妇人杂病脉证并治》中记载了痛经的概念, 记录显示经血排出不畅，伴有下腹部疼痛18根据其主要症状，痛经在中医中可归属于经行腹痛和经期腹痛的范畴。痛经的证型可分为五种：气血虚弱、寒凝血瘀、湿热瘀阻、气滞血瘀以及肝肾不足。16根据相关研究，寒凝血瘀证是原发性痛经最常见的证型。19,20中医认为，经前诸症与寒邪密切相关21在经期或经期前后，血海穴处气血流动过盛，因其能量活跃，易导致气血迅速耗损。因此，女性因健康能量不足，加之子宫及冲脉、任脉中气血的快速波动，易受致病因素影响。22月经期间，体质较好的女性也应注意避免食用生冷食物，并防止受寒。若未加以注意，寒邪可能侵入子宫，导致子宫及冲任二脉中的血液凝滞，从而引起血行不畅，出现疼痛。外感寒邪与体内阴寒过盛均可导致经络阻塞和血液凝结。

痛经的病位在冲脉和任脉，其发病与气血变化密切相关。中医理论认为，艾灸通过激发阳气、温通经络、散寒行血，从而促进血液循环，达到缓解疼痛的作用。根据《灵枢·禁服》23记载：“若脉气与血瘀滞于中，寒凝血结者，宜用灸法”，艾灸是治疗外寒型痛经的典型方法。在既往研究中24，艾叶（Artemisia argyi）被描述为味苦辛，能回阳救逆，通达十二经脉，贯穿三阴经，调和气血，祛除寒湿，温煦子宫；艾灸结合特定穴位，可使病邪从体表外排，内在调和气血，从而发挥疏通经络、活血化瘀、止痛的作用。脐部又称神阙穴（CV8），归属于任脉，与督脉、冲脉、带脉相联系。根据中医理论，神阙与五脏六腑25均有联系，被视为先天之本，阴阳平衡之枢纽。从解剖结构来看，盆腔区域与腹部接近，与子宫有密切的解剖和功能联系。原发性痛经主要影响子宫，其病理机制涉及气血失调及脏腑功能失衡。通过刺激神阙穴，可直接调节子宫的气血状态，有效缓解痛经症状。基于上述理论，本研究选择腹部的神阙穴作为热敏点灸法（HPM）的刺激部位，旨在改善痛经症状，减轻疼痛。

为了尽可能模拟寒凝血瘀型原发性痛经的中医干预，我们在雌性大鼠身上复制了神阙穴（脐部）的温和灸疗法。研究发现，脐部温和灸具有明显的镇痛作用，可减轻痛经大鼠的扭体反应。为了探讨脐部温和灸改善原发性痛经的作用机制并推动其应用，我们建立了一种固定大鼠并在腹部神阙穴实施温和灸的操作技术。

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方案

本实验方案经浙江中医药大学实验动物管理和伦理审查委员会批准。所有涉及动物的实验操作均符合实验动物福利伦理及动物实验安全规范。研究选用浙江中医药大学实验动物中心提供的8至10周龄成年雌性Wistar大鼠。实验前，大鼠在受控环境（温度：23–25 °C，湿度：40%–60%）中适应性饲养1周。大鼠维持12小时光照-黑暗循环（光照时间为8:00至20:00），并可自由获取食物和饮水。以下方案描述了寒凝血瘀型原发性痛经模型的建立及脐部热敷治疗的操作流程。该操作流程示意图见图1。

1. 寒凝血瘀型痛经模型的建立

  1. 通过阴道灌洗法检测大鼠的动情周期。
    1. 将装有60 µL 0.9%生理盐水的移液枪插入大鼠阴道口，反复吹打3–4次，然后吸出液体并滴加到玻璃载片上。
      注意：使用可清洗或可丢弃的毛巾包裹大鼠是合适的。
    2. 加入60 µL 95%乙醇，固定干燥样本8 min，随后冲洗并干燥样本。加入0.1%亚甲蓝染色液，避光孵育10 min。之后，冲洗并干燥样本。
    3. 在显微镜下观察并获取图像。
      注意：若观察到大量白细胞且仅有少量有核上皮细胞，则确认为动情后期阶段（图1B将这些大鼠随机分为对照组、模型组和艾灸组（n = 6）。
  2. 建立寒凝血瘀证PDM动物模型
    1. 在大腿部位皮下注射苯甲酸雌二醇，持续10天（每只大鼠0.5 mg，第1天）st 和 10th 天和第2天的0.2 mgnd 到 9th 天）以诱导子宫收缩。
    2. 将雌性大鼠置于 -20 °C 冰箱中冷冻 4 小时，于第 1 天st 至 5th 建模当天26在4小时的孵育期间，中途打开冰箱门通风30分钟，然后关闭。
    3. 在末次给药后24小时，通过腹腔注射催产素（每只大鼠2 U）以诱导痛经。
      注意：本研究基于先前已发表的研究，该研究聚焦于寒凝血瘀型痛经大鼠模型的制备27对照组注射等体积的生理盐水，冷冻处理程序与模型组相同。

2. 寒凝血瘀型原发性痛经模型雌性大鼠的 HPM 脐疗干预

注意：准备脐疗所需的四种最重要材料（见材料表）。

  1. 制备艾炷。将艾绒用手搓成纺锤形（直径 0.8 cm，高度 0.8 cm）（图2A).
  2. 在中间制作一个带有孔洞（直径1厘米，深度0.8厘米）的面团碗图2B).
  3. 称取0.3 g中药粉末（图2C).
    注：根据杜东庆28，中药粉末浓缩物sists 的 延胡索，吴茱萸, 乳香、白芍、没药、冰片、五灵脂).
  4. 准备大鼠固定袋以固定大鼠，这将在操作过程中保持大鼠的稳定。
    1. 剪裁布料（长×宽：20 cm × 20 cm），沿对角线缝合。在顶部剪出一个小开口用于呼吸，并在布袋一侧开一个直径约5 cm的孔，用于艾灸。
    2. 在袋子的顶部和底部末端分别缝制一条长约10 cm、宽约1 cm的布绳，用于固定图2D).
      注意：实验人员可根据被测动物的大小制作合适尺寸的大鼠袋。
  5. 找到神阙（CV8）穴位的准确位置。
    1. 参考文献29,30，在大鼠腹部中线上定位神阙穴（CV8），该位置位于剑突与耻骨上缘连线的上2/3与下1/3交界处图1D).
  6. 去除神阙穴周围的毛发。
  7. 将大鼠放入大鼠固定袋中，保持腹部朝上，暴露下肢和尾巴。用胶带将大鼠身体的上部和下部以及尾巴固定在手术台上。
    注意：在固定大鼠时，操作者必须动作轻柔，不可用力过猛，以避免引起大鼠恐慌而影响实验结果。应确保固定松紧适度，避免对心脏施加压力，以防导致大鼠死亡。
  8. 使用75%乙醇对神阙及其周围皮肤进行消毒。
  9. 将碗置于腹部，使其孔对准神阙穴，并将中药粉放置于神阙穴上。
  10. 将艾炷放在中药粉上。
  11. 点燃艾炷，待前一个燃尽后更换新的艾炷。持续治疗大鼠30分钟。图1E).
    注意：治疗过程中不要使用麻醉。保持安静。密切观察大鼠，防止艾灸时因温度过高造成烫伤。

3. 进行行为学测试

  1. 每次实验前用75%乙醇擦拭实验箱。
    注意：敞箱为40 cm × 40 cm × 40 cm的立方体，无木箱盖。
  2. 腹腔注射催产素（2 U）或0.9%生理盐水后，将大鼠放入笼中。
  3. 用摄像机记录30分钟内的扭体行为。
  4. 计算扭体潜伏期（WLs）和扭体评分（WS）。
    1. 根据Schmauss31的方法，将扭体行为分为0至3级，共4个等级，依据Schmauss方法对动物进行评分。
      注意：0级：正常姿势（前肢和爪子平放于笼底，或正常探索行为）；1级：身体向左或向右倾斜；2级：后肢伸展，后爪背部弯曲，骨盆频繁旋转；3级：腹肌收缩，后肢向后伸直。大鼠出现扭体反应（腹部收缩、凹陷，躯干及后肢伸展，单肢旋转，子宫收缩），提示寒凝血瘀型原发性痛经模型制备成功。扭体潜伏期指从注射催产素至出现扭体反应的时间。若潜伏期超过30分钟，则按30分钟计算。扭体评分 = (0次 × 0) + (1次 × 1) + (2次 × 2) + (3次 × 3)。

4. 行为学测试后采集标本

  1. 用手固定大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥钠（1 mL/kg）以实现深度麻醉。
  2. 称重大鼠，获取体重。
  3. 从腹部中线切开皮肤和肌肉，暴露心脏。
  4. 从心尖位置插入灌注针，用止血钳固定灌注针，并在右心耳处剪一小口。
  5. 通过左心室和升主动脉灌注0.9%生理盐水，直至大鼠肝脏和眼睛颜色变浅、发白。
  6. 用剪刀取出子宫并称重。
  7. 通过计算子宫重量与体重的比值，获得子宫指数。

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结果

在本研究中，采用苯甲酸雌二醇联合催产素诱导寒凝血瘀型原发性痛经（PDM）模型，以观察中药脐疗（HPM）的作用效果。首先，通过观察大鼠的扭体行为，判断寒凝血瘀型PDM大鼠模型是否成功建立，并通过扭体次数（WS）、扭体潜伏期（WLs）及子宫指数对大鼠的疼痛行为、造模情况及子宫治疗效果进行评估。自第6天起th 到 10th 造模当天，每日在CV8（神阙）进行一次HPM治疗，每次30分钟。第11天th 建模当天，在麻醉下处死大鼠，取出子宫并进行苏木精-伊红（HE）染色，以评估子宫病理状况及HPM对子宫组织的影响。实验流程示意图见于 图1A.

热敏灸神阙穴疗法对寒凝血瘀型原发性痛经大鼠扭体行为的影响
通过评估扭体评分（WS）和扭体潜伏期（WL）来判断寒凝血瘀型原发性痛经（PDM）大鼠模型的痛经程度（表1）。造模后，单因素方差分析显示，与对照组相比，寒凝血瘀型PDM模型组大鼠（n = 6）的扭体...

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讨论

目前，针对寒凝血瘀型原发性痛经的造模方法有多种，但主要以苯甲酸雌二醇联合催产素建立痛经模型为主，本研究在此基础上有所改进。本研究采用整体冷冻法联合苯甲酸雌二醇和催产素进行造模，整体冷冻法的温度设定为−20 °C。在前期预实验中发现，当温度为−25 °C时，大鼠会出现严重冻伤甚至尾部坏死脱落，因此将温度调整为−20 °C，既能保证实现寒凝的目的，又不会对大鼠造成过大的机体损伤。我们通过扭体评分和子宫组织HE染色验证了造模的成功，表明该模型可用于后续研究，具有参考意义。

热针灸疗法（HPM）对多种疾病具有疗效，例如克罗恩病、溃疡性结肠炎和痛经15,32,33。然而，除了临床疗效外，研究人员还需关注其背后的机制。因此，在动物模型中应用HPM是研究其分子机制的必要手段。为了分析HPM的疗效与作用机制，研究人员面临的主要挑战之一是如何将动物固定在合适的位置，使其保持稳定、无不适感，并能接受一段时间的治疗。在...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由以下机构资助： 浙江省自然科学基金 基金，探索计划 Q （LQ20H270012），浙江中医药 医药技术计划（编号：2020ZB124）， 浙江中医药研究项目 中国高校科研基金（编号：2021JKZKTS056B）以及 第三附属医院级别项目 浙江中医药大学附属医院 大学（编号：NO.ZS22ZA01）。我们感谢 浙江实验动物中心 中国医科大学及关键 针灸与神经病学实验室 浙江省为我们提供了 实验条件

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 生理盐水杭州高盛生物科技有限公司SLYSZ1A用于对照组注射 
1 mL 一次性无菌注射器常州悦康医疗器械有限公司3000-0515-14用于药物注射
3 mL（加长型）巴斯德吸管北京兰杰科技术有限公司YCKJ-HC-007245用于封片
75% 消毒酒精杭州奥托珀生物科技有限公司N/A用于处理部位的消毒
带粘合剂的载玻片浙江图治 pharmaceutical 技术有限公司188105W用于 HE 染色
生化培养箱上海博迅工业有限公司医疗设备厂N/A用于 HE 染色中的组织脱蜡
布料材料自制N/A用于包裹大鼠
数字切片扫描系统HamamatsuC13210-01用于 HE 切片扫描
一次性乳胶手套广州利格科技有限公司LG10-102-1I用于操作过程中佩戴
苯甲酸雌二醇合肥新科信动物药业有限公司N/A用于建立痛经模型
Excelsior AS 全自动脱水机Thermo ScientificExcelsior AS用于 HE 染色组织脱水
雌性 Wistar 大鼠浙江中医药大学实验动物中心N/A220–250 g
面粉自制N/A用于隔药灸治疗
镊子浙江图治 pharmaceutical 技术有限公司lsnz用于标本采集
甲醛 上海凌峰化学试剂有限公司441244-1KG用于组织固定
Gemini AS 切片染色机Thermo ScientificGemini AS 染色设备
止血钳浙江图治 pharmaceutical 技术有限公司lsnz用于标本采集
HistoCoreLeica (Arcadia H)14039357258用于 HE 染色组织包埋
医用无菌棉球浙江中医药大学第三附属医院N/A用于处理部位的消毒
亚甲蓝染色液（0.1%）北京鸿鹄联合化工产品有限公司G1300用于动情周期筛选
显微解剖剪杭州高盛生物科技有限公司XWJ12A用于标本采集
显微镜盖玻片（24 mm × 50 mm）杭州正博生物科技有限公司10212450C用于 HE 染色
切片机Leica MicrosystemsRM2255用于组织切片
美的冰箱合肥美的电冰箱有限公司N/A用于建立寒凝血瘀型痛经模型
牙科钳杭州正博生物科技有限公司YGJD-11用于标本采集
封片剂杭州高盛生物科技有限公司CS9603-100mL用于组织封片
艾条浙江中医药大学第三附属医院N/A用于隔药灸治疗
戊巴比妥钠杭州大文生物有限公司N/A用于标本采集
磷酸盐缓冲液（PBS）杭州高盛生物科技有限公司P1010-2L用于标本采集
剪刀 浙江图治 pharmaceutical 技术有限公司lsnz用于标本采集
切片刀片上海赛翰科技有限公司LEICA-819-box用于 HE 染色石蜡切片制备
剃毛器深圳科德士电器有限公司N/A用于剃除大鼠体毛
氯化钠化学试剂有限公司A501218-0001用于标本采集
蔗糖浙江图治 pharmaceutical 技术有限公司S11055-500g用于梯度脱水
保温容器浙江图治 pharmaceutical 技术有限公司lsbwx8l用于石蜡切片脱蜡
组织包埋盒，矩形，带可折断盖浙江图治 pharmaceutical 技术有限公司31050102W用于 HE 染色组织包埋
宽型胶带浙江图治 pharmaceutical 技术有限公司N/A用于治疗过程中固定大鼠

参考文献

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