基于寒凝血瘀型原发性痛经大鼠模型的神阙穴隔药灸疗法

摘要

本文详细描述了在治疗寒凝血瘀型原发性痛经大鼠时，对脐部进行隔药灸的操作步骤及注意事项。该方法可显著改善痛经大鼠的扭体反应，缓解疼痛症状。

摘要

原发性痛经（PDM）是指在无明显盆腔器质性病变的情况下，出现的以下腹部痉挛性绞痛为主要表现的病症，常伴有其他全身症状，显著降低了患PDM女性的生活质量，影响了45%–95%的经期女性。尽管PDM发病率高，但常得不到有效治疗，也易被相关研究人员及女性自身所忽视。隔药灸（HPM）是中医外治法中的一种特色疗法，在中国广泛用于多种疾病的治疗；该疗法通过将中药方剂置于患者穴位上，再于药上点燃艾柱进行艾灸治疗。本研究所用药材的主要功效为通经活络、温阳散寒，以促进气机运行从而缓解疼痛。艾灸产生的热刺激可加速药物成分向人体内的渗透。因此，隔药灸融合了穴位、药物与热刺激三重作用，适用于妇科疾病的治疗，尤其适合PDM等功能性疾病的干预。本文详细描述了在雌性实验大鼠神阙（CV8）穴位实施隔药灸的操作步骤及注意事项，为今后进一步推广和促进隔药灸在PDM脐部治疗中的应用与发展提供了实验依据。

引言

原发性痛经（PDM），也称为功能性痛经，是影响青春期女孩和育龄期年轻女性最常见的妇科疾病之一¹。其特征是在月经前后出现腹痛和子宫收缩（痉挛）等不适症状，并伴有腹部炎症反应，但无盆腔器质性病变的证据²。下腹部绞痛是多囊型PDM的典型症状，通常在月经来潮后8-72小时内开始，在月经量增多的最初几天达到高峰^3,4，有时疼痛会放射至背部和大腿。由于对该病症的定义不同，且缺乏评估月经疼痛强度的标准化方法，因此估计女性中痛经的患病率在45%至95%之间^3,4,5。约有10%至25%的育龄期女性被认为患有严重的PDM⁶。PDM的患病率在20至24岁年龄组中最高，之后随年龄增长而逐渐下降²。PDM以周期性下腹痛为主要表现，常伴随其他全身症状，如腰痛、恶心、呕吐、头痛、食欲减退、腹泻⁷，甚至出现抑郁和焦虑等精神症状^8,

方案

本实验方案经浙江中医药大学实验动物管理和伦理审查委员会批准。所有涉及动物的实验操作均符合实验动物福利伦理及动物实验安全规范。研究选用浙江中医药大学实验动物中心提供的8至10周龄成年雌性Wistar大鼠。实验前，大鼠在受控环境（温度：23–25 °C，湿度：40%–60%）中适应性饲养1周。大鼠维持12小时光照-黑暗循环（光照时间为8:00至20:00），并可自由获取食物和饮水。以下方案描述了寒凝血瘀型原发性痛经模型的建立及脐部热敷治疗的操作流程。该操作流程示意图见图1。

1. 寒凝血瘀型痛经模型的建立

1. 通过阴道灌洗法检测大鼠的动情周期。
   1. 将装有60 µL 0.9%生理盐水的移液枪插入大鼠阴道口，反复吹打3–4次，然后吸出液体并滴加到玻璃载片上。
      注意：使用可清洗或可丢弃的毛巾包裹大鼠是合适的。
   2. 加入60 µL 95%乙醇，固定干燥样本8 min，随后冲洗并干燥样本。加入0.1%亚甲蓝染色液，避光孵育10 min。之后，冲洗并干燥样本。
   3. 在显微镜下观察并获取图像。
      注意：若观察到大量白细胞且仅有少量有核上皮细胞，则确认为动情后期阶段（图1B将这些大鼠随机分为对照组、模型组和艾灸组（n = 6）。
   ....

结果

在本研究中，采用苯甲酸雌二醇联合催产素诱导寒凝血瘀型原发性痛经（PDM）模型，以观察中药脐疗（HPM）的作用效果。首先，通过观察大鼠的扭体行为，判断寒凝血瘀型PDM大鼠模型是否成功建立，并通过扭体次数（WS）、扭体潜伏期（WLs）及子宫指数对大鼠的疼痛行为、造模情况及子宫治疗效果进行评估。自第6天起^th 到 10^th 造模当天，每日在CV8（神阙）进行一次HPM治疗，每次30分钟。第11天^th 建模当天，在麻醉下处死大鼠，取出子宫并进行苏木精-伊红（HE）染色，以评估子宫病理状况及HPM对子宫组织的影响。实验流程示意图见于 图1A.

热敏灸神阙穴疗法对寒凝血瘀型原发性痛经大鼠扭体行为的影响
通过评估扭体评分（WS）和扭体潜伏期（WL）来判断寒凝血瘀型原发性痛经（PDM）大鼠模型的痛经程度（表1）。造模后，单因素方差分析显示，与对照组相比，寒凝血瘀型PDM模型组大鼠（n = 6）的扭体.......

讨论

目前，针对寒凝血瘀型原发性痛经的造模方法有多种，但主要以苯甲酸雌二醇联合催产素建立痛经模型为主，本研究在此基础上有所改进。本研究采用整体冷冻法联合苯甲酸雌二醇和催产素进行造模，整体冷冻法的温度设定为−20 °C。在前期预实验中发现，当温度为−25 °C时，大鼠会出现严重冻伤甚至尾部坏死脱落，因此将温度调整为−20 °C，既能保证实现寒凝的目的，又不会对大鼠造成过大的机体损伤。我们通过扭体评分和子宫组织HE染色验证了造模的成功，表明该模型可用于后续研究，具有参考意义。

热针灸疗法（HPM）对多种疾病具有疗效，例如克罗恩病、溃疡性结肠炎和痛经^15,32,33。然而，除了临床疗效外，研究人员还需关注其背后的机制。因此，在动物模型中应用HPM是研究其分子机制的必要手段。为了分析HPM的疗效与作用机制，研究人员面临的主要挑战之一是如何将动物固定在合适的位置，使其保持稳定、无不适感，并能接受一段时间的治疗。在.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 生理盐水	杭州高盛生物科技有限公司	SLYSZ1A	用于对照组注射
1 mL 一次性无菌注射器	常州悦康医疗器械有限公司	3000-0515-14	用于药物注射
3 mL（加长型）巴斯德吸管	北京兰杰科技术有限公司	YCKJ-HC-007245	用于封片
75% 消毒酒精	杭州奥托珀生物科技有限公司	N/A	用于处理部位的消毒
带粘合剂的载玻片	浙江图治 pharmaceutical 技术有限公司	188105W	用于 HE 染色
生化培养箱	上海博迅工业有限公司医疗设备厂	N/A	用于 HE 染色中的组织脱蜡
布料材料	自制	N/A	用于包裹大鼠
数字切片扫描系统	Hamamatsu	C13210-01	用于 HE 切片扫描
一次性乳胶手套	广州利格科技有限公司	LG10-102-1I	用于操作过程中佩戴
苯甲酸雌二醇	合肥新科信动物药业有限公司	N/A	用于建立痛经模型
Excelsior AS 全自动脱水机	Thermo Scientific	Excelsior AS	用于 HE 染色组织脱水
雌性 Wistar 大鼠	浙江中医药大学实验动物中心	N/A	220–250 g
面粉	自制	N/A	用于隔药灸治疗
镊子	浙江图治 pharmaceutical 技术有限公司	lsnz	用于标本采集
甲醛	上海凌峰化学试剂有限公司	441244-1KG	用于组织固定
Gemini AS 切片染色机	Thermo Scientific	Gemini AS	染色设备
止血钳	浙江图治 pharmaceutical 技术有限公司	lsnz	用于标本采集
HistoCore	Leica (Arcadia H)	14039357258	用于 HE 染色组织包埋
医用无菌棉球	浙江中医药大学第三附属医院	N/A	用于处理部位的消毒
亚甲蓝染色液（0.1%）	北京鸿鹄联合化工产品有限公司	G1300	用于动情周期筛选
显微解剖剪	杭州高盛生物科技有限公司	XWJ12A	用于标本采集
显微镜盖玻片（24 mm × 50 mm）	杭州正博生物科技有限公司	10212450C	用于 HE 染色
切片机	Leica Microsystems	RM2255	用于组织切片
美的冰箱	合肥美的电冰箱有限公司	N/A	用于建立寒凝血瘀型痛经模型
牙科钳	杭州正博生物科技有限公司	YGJD-11	用于标本采集
封片剂	杭州高盛生物科技有限公司	CS9603-100mL	用于组织封片
艾条	浙江中医药大学第三附属医院	N/A	用于隔药灸治疗
戊巴比妥钠	杭州大文生物有限公司	N/A	用于标本采集
磷酸盐缓冲液（PBS）	杭州高盛生物科技有限公司	P1010-2L	用于标本采集
剪刀	浙江图治 pharmaceutical 技术有限公司	lsnz	用于标本采集
切片刀片	上海赛翰科技有限公司	LEICA-819-box	用于 HE 染色石蜡切片制备
剃毛器	深圳科德士电器有限公司	N/A	用于剃除大鼠体毛
氯化钠	化学试剂有限公司	A501218-0001	用于标本采集
蔗糖	浙江图治 pharmaceutical 技术有限公司	S11055-500g	用于梯度脱水
保温容器	浙江图治 pharmaceutical 技术有限公司	lsbwx8l	用于石蜡切片脱蜡
组织包埋盒，矩形，带可折断盖	浙江图治 pharmaceutical 技术有限公司	31050102W	用于 HE 染色组织包埋
宽型胶带	浙江图治 pharmaceutical 技术有限公司	N/A	用于治疗过程中固定大鼠