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方法文章

使用硫酸葡聚糖建立大鼠直肠结肠切除及回肠储袋-肛管吻合术后储袋炎模型

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DOI：

10.3791/66623

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2024年5月31日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Surgery, Tianjin Medical University General Hospital, 2Tianjin General Surgery Institute, 3Department of General Surgery, Zibo Municipal Hospital, 4Department of General Surgery, Binzhou Medical University Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了建立 pouchitis 大鼠模型的方法。通过采用显微外科技术进行回肠储袋-肛管吻合术（IPAA）手术，构建回肠储袋模型。术后，大鼠接受 4% 硫酸葡聚糖钠（DSS）处理，持续 4 天。

摘要

溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性免疫介导性疾病，累及整个结肠和直肠，病程呈复发与缓解交替，导致终身患病。当药物治疗无效，尤其是出现大量胃肠道出血、穿孔、中毒性巨结肠或癌变时，手术成为治愈UC的最后一道防线。全结直肠切除联合回肠储袋-肛门吻合术（IPAA）为长期治疗提供了最佳机会。储袋炎是最常见且最棘手的术后并发症。本研究采用显微外科技术在实验大鼠中建立回肠储袋模型。 通过 IPAA手术。随后，通过葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导回肠储袋炎症，建立持续性大鼠储袋炎模型。通过术后一般状况、体重、食物和饮水摄入、粪便数据，以及储袋组织病理学、免疫组化和炎症因子分析，验证大鼠储袋炎模型建立的成功。该储袋炎实验动物模型为研究储袋炎的发病机制及治疗提供了基础。

引言

贮袋炎是一种非特异性炎症，影响回肠贮袋，是溃疡性结肠炎（UC）患者在接受全直肠结肠切除术及回肠贮袋-肛门吻合术（IPAA）后常见的并发症1,2,3。该疾病的发病率相对较高，可达50%，可引起多种临床表现，包括腹泻、腹痛、粪便带血和发热。尽管目前尚不完全明确贮袋炎的确切病因，但一些研究人员认为，贮袋内菌群的改变可能触发免疫激活，进而引发炎症4,5,6,7。

由于在贮袋炎上开展临床试验存在诸多挑战，动物模型可作为研究贮袋炎药物及机制的有力工具。目前对于大鼠回肠贮袋的构建存在越来越多的关注，已有报道指出其可能引发炎症8。然而，由于该制备过程较为复杂且缺乏明确的操作指南，相关研究仍较为有限9,10。1998年，Lichtman 首次通过全结肠切除术在Lewis大鼠和Sprague-Dawley（SD）大鼠中成功建立了回肠贮袋模型11。他们观察到这些大鼠肠道中存在巨噬细胞浸润、黏膜溃疡以及厌氧菌群增加的现象，为回肠贮袋炎症的进一步研究奠定了坚实基础。该大鼠贮袋炎实验模型在体征表现和潜在机制方面均能较好地模拟人类贮袋炎。

常用的临床前溃疡性结肠炎模型包括DSS模型和TNBS模型。致病化学物质2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）通常用于模拟克罗恩病12。DSS模型因其有效性、安全性及经济性而受到认可，常被用作诱导溃疡性结肠炎的可靠工具，因其可产生明显的症状。鉴于袋状组织的定植特性，我们成功利用DSS诱导出贮袋炎模型13,14。

在本研究中，采用显微外科技术成功在实验大鼠中建立了回肠袋模型 通过 IPAA手术。随后，通过使用DSS诱导回肠储袋炎症，建立稳定的大鼠储袋炎模型。手术过程中的精确操作对于成功建模至关重要，术后护理也同样重要。该模型可用于研究储袋炎的发病机制、评估潜在治疗药物，并进一步加深对该复杂疾病的理解。本研究优化了回肠储袋的制备流程，缩短了手术时间，提高了效率，从而为术后储袋相关疾病的基础研究奠定了坚实基础。

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方案

所有动物实验均按照天津医科大学总医院伦理委员会的政策进行。本研究使用了9至12周龄、体重约为320–360 g的雄性Sprague-Dawley大鼠。所用试剂与设备的详细信息见于 材料表.

1. 动物选择与饲养

  1. 选择一只健康的动物（体重约为 220–240 g）。
  2. 确保其符合无特定病原体（SPF）的标准15 在通风良好（每小时换气8至12次）、温度适宜（20–25 °C）、湿度适当（40%–70%）、噪音最低（低于70分贝）以及自然光照周期（12小时光照与12小时黑暗）的环境中适应性饲养至少2周。
  3. 在此期间，将动物饲养于标准清洁笼具中，每笼3至5只，每周更换垫料两次。提供 随意摄取 可自由获取食物和水，以及实验室大鼠的标准维持饲料。

2. 术前准备

  1. 选择一只体重约为 320 g 至 360 g 的健康大鼠。术前禁食 8–12 小时，并提供生理盐水与 5% 葡萄糖溶液按 1:1 比例混合的液体，供其自由饮用。
  2. 准备已高压灭菌的显微外科器械（术前以酒精浸泡 1 小时）、显微镜、大鼠解剖台、8-0 非吸收性高分子缝合线、4-0 非吸收性缝合线、无菌纱布、无菌棉签等。

3. 大鼠回肠袋模型的建立

  1. 腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液，剂量为6 mL/kg，并使用0.5%罗哌卡因进行切口局部浸润麻醉，以麻醉大鼠。麻醉期间使用电灯维持大鼠体温舒适。
  2. 按照以下步骤进行全结直肠切除术：
    1. 将大鼠在麻醉满意后固定于解剖台上的仰卧位。通过夹捏足趾确认麻醉深度。使用剃毛器清除毛发碎屑，并用碘伏溶液消毒手术区域两次。
    2. 沿中线做一长约6 cm的切口，逐层切开皮肤、白线筋膜和腹膜，进入腹腔。使用拉钩暴露腹膜面，并以浸有抑菌生理盐水的无菌纱布覆盖。
    3. 分离终末空肠的血管血流，使用8-0缝合线结扎其起始部，随后将其切断。将位于回盲瓣1–2 cm处的盲肠残端固定并保持静止，然后将其切断。
    4. 开始行右半结肠切除术，保守结扎右半结肠及中结肠静脉。
    5. 进一步分离肠系膜下动脉，游离直肠下动脉。沿直肠继续向下分离，直至距离肛缘约2厘米处。以与直肠纵轴约45度的斜角切除远端直肠，以避免术后狭窄。
  3. 进行J型袋构造。
    1. 使用切片刀将回肠末端的横切面与肠系膜分离，长度应约为6-7 cm。
    2. 将回肠末端折叠成J形以形成回肠储袋。行后壁吻合。 通过 一种锁边缝合。使用改良的Connell缝合法加强前壁，并保留适当长度的肠管，以匹配远端直肠残端的横截面大小。
    3. 如有需要，使用8-0缝线加固J形 pouch。J形 pouch 的长度应介于2.5 cm至3.5 cm之间。
  4. 行回肠储袋-肛管吻合术（IPAA）。
    1. 确认肠系膜无扭转后，使用8-0缝线间断缝合储袋开口的前侧壁与直肠残端的侧壁，以提供牵引。
    2. 最后，对前壁和后壁均采用全层连续锁边缝合。
    3. 确认无活动性出血后，用生理盐水生理学地冲洗腹腔。依次用4-0缝线缝合腹肌筋膜和皮肤。
  5. 进行术后管理。
    1. 在腹部缝合后，对所有大鼠皮下注射酮洛芬作为术后镇痛（40 mg/kg）。使用电热灯对大鼠进行保温，直至其恢复意识。
    2. 术后至少禁食 72 小时，以降低肠梗阻风险。可自由摄取 5% 葡萄糖饮食，以快速补充能量和体液，并根据排便情况调整喂养频率。
    3. 术后一周开始给予少量营养，随后逐渐增加摄食量。之后让大鼠自由摄取标准啮齿类动物饲料，并每日记录其饮食摄入量、饮水量及体重。

4. 采用DSS建立大鼠回肠袋炎模型

  1. 进行实验分组。
    1. 将12只接受全结直肠切除术并行回肠袋-肛管吻合术（IPAA）的大鼠随机分为IPAA组（A组，n = 6）和贮袋炎组（B组，n = 6）。
    2. 将4 g DSS溶于100 mL纯水中，配制4% DSS溶液，每日新鲜配制。
    3. 术后第31至35天，分别给予IPAA组饮用纯水、贮袋炎组饮用4% DSS溶液。连续给药4天期间，允许大鼠自由饮水和进食标准大鼠饲料。
  2. 进行贮袋组织取样。
    1. 术后第35天早晨，按照机构批准的方案，通过腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液（剂量为6 mL/kg）麻醉大鼠。
    2. 从各组贮袋造口处垂直切断至输入段与输出段连接处，获取贮袋组织标本。
    3. 沿前壁缝合线剪开贮袋，并用生理盐水冲洗肠腔。
    4. 取一小块贮袋组织放入微量离心管中，立即于-80 °C冰箱中冷冻保存，用于后续ELISA检测炎症指标；剩余的贮袋组织用10%甲醛固定，用于组织病理学评分和免疫组化染色。
    5. 最后，在深度麻醉下通过空气栓塞法处死大鼠（遵循机构批准的方案）。

5. 组织学分析

  1. 从大鼠获取袋状组织后，将其浸入4%多聚甲醛中固定24小时。随后进行脱水和包埋处理。将处理后的组织切片以供组织学检查16。
  2. 采用苏木精和伊红染色以识别各组之间的组织病理学差异。在显微镜下观察样本，并拍摄照片进行记录。

6. 免疫组织化学检测

  1. 小心脱蜡并水化组织切片。然后将切片置于柠檬酸钠溶液中冷却进行抗原修复，并用封闭血清封闭20分钟。
  2. 随后，将切片与抗occludin一抗孵育，4 °C过夜。之后，用二抗处理30分钟，再进行苏木精复染16。
  3. 切片干燥后，在光学显微镜下观察并拍照。

7. ELISA 检测

  1. 7.1 使用超声处理在裂解缓冲液中切碎并匀浆组织碎片，以确保充分匀浆。使用所得上清液进行检测。
  2. 为每组的空白、样品及重复样分配孔位。通过在450 nm处读取吸光度（OD值）并进行线性回归分析来测定蛋白质浓度16。

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结果

回肠袋模型大鼠建模后的一般状况评估
手术操作者通过IPAA手术学习曲线后，大鼠对手术耐受良好，手术时长为192.94 min ± 27.15 min，术后并发症较少。术后早期，大鼠饮食摄入量有所下降，但通常在术后10至14天内恢复至术前食欲水平。术后早期活动量轻度减少，眼鼻无明显分泌物。术前术后体重减轻量为21.17 g ± 1.59 g。术后初期体重呈下降趋势，最大减少量为69.58 g ± 33.19 g。术后第8.25天 ± 2.53天开始恢复稳定增长，至第31天时st 术后第1天，体重超过术后当天体重的9.35% ± 4.7%。大鼠在术后24小时内能够排便，粪便呈松软状，但无血便。软便成型出现在第9天th 至 12th 术后第1天

回肠储袋的代偿性增大
在第35天th 术后第1天，在麻醉下打开大鼠腹腔，可见回肠袋与盆腔之间存在严重粘连。仔细分离回肠袋与周围组织间的粘连后，观察到回肠袋代偿性增大、肠壁增厚以...

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讨论

溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性肠道炎症性疾病，以反复发作的上腹部疼痛、腹泻和黏液脓血便为特征。该病主要累及直肠，并可不同程度地向近端结肠蔓延。手术在溃疡性结肠炎的治疗中具有重要作用17,18,19。自 Parks 等人20于1978年提出全结肠切除联合回肠储袋-肛管吻合术（IPAA），以切除病变组织并恢复肠道连续性以来，该术式已成为国际上治疗溃疡性结肠炎的标准外科方案。储袋相关炎症是 IPAA 术后最常见的并发症。

由于在进行有关贮袋炎的临床试验时面临诸多挑战，动物模型已被用作研究与贮袋炎相关的药物及机制的补充实验手段。1998年，Lichtman 等人11 建立了一种大鼠模型，该模型涉及完全切除大肠并将储袋与直肠重新连接。术后四周内，该模型表现出炎症迹象，如单核细胞浸润、管腔渗出、黏膜溃疡以及浆膜炎症...

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无水乙醇天津风船化学试剂科技有限公司中国苏木精-伊红染色
葡聚糖硫酸钠  Yeasen 60316ES76用于诱导袋状炎症
甲醛溶液天津致远试剂公司中国苏木精-伊红染色
纱布江西中赣医疗器械有限公司中国用于动物显微外科手术
苏木精北京中杉金桥公司中国苏木精-伊红染色
干扰素 γ  检测试剂盒Cloud-cloneSEA049Ra检测炎症因子
白细胞介素-10检测试剂盒Cloud-cloneSEA056Ra检测炎症因子
白细胞介素-17检测试剂盒Cloud-cloneSEA063Ra检测炎症因子
白细胞介素-6检测试剂盒Cloud-cloneSEA079Ra检测炎症因子
碘伏唐派医疗器械有限公司中国用于动物显微外科手术
显微操作器械Aesculap德国用于动物显微外科手术
Occludinabcamab216327免疫组织化学检测
缝合针扬州富达医疗器械有限公司中国用于动物显微外科手术
肿瘤坏死因子 α 检测试剂盒Cloud-cloneSEA133Ra检测炎症因子
双人双目手术显微镜OPTON德国用于动物显微外科手术
二甲苯天津盈达稀有贵重试剂厂中国苏木精-伊红染色

参考文献

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