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利用被动左心房加压与被动后负荷进行心脏负荷加载以评估移植物

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DOI：

10.3791/66624

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2024年8月2日

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1Division of Cardiac Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Center for Engineering in Medicine and Surgery, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, Shriners Children's Boston, 3VentriFlo Inc

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

该方案描述了一种猪的ex vivo心脏灌注系统，其中对左心室进行直接负荷可作为移植物健康状况的评估手段，同时还能对移植物功能进行全面评价。本文还讨论了系统设计及可能的评估指标。

摘要

离体机械灌注或常温机械灌注是一种在移植领域中日益重要的器官保存方法。尽管心脏在跳动状态下为评估提供了巨大机会，目前的临床实践仍主要依赖有限的代谢趋势来评价移植物功能。来自左心室负荷的血流动力学测量因其作为客观评估参数的潜力而受到广泛关注。实际上，本方案通过简单增加一个额外储液罐，提供了一种简便有效的方法，可将负荷功能整合到现有的朗根多夫（Langendorff）灌注系统中。此外，本方案还展示了采用被动性左心房加压进行负荷的可行性，据我们所知，此前尚未有研究报道过这一方法。该方法结合了被动式Windkessel模型后负荷系统，作为顺应性腔室，在舒张期最大限度地提高心肌灌注。最后，本方案强调了在心脏负荷过程中获取功能性指标的能力，包括左心室脉压、收缩力和舒张功能，以揭示长时间保存（˃6 小时）后心脏移植物功能的潜在缺陷。

引言

原位心脏移植是目前终末期心力衰竭治疗的金标准1。然而，由于供体严重短缺，该领域的发展受到显著限制，每年仅能实施约2000例心脏移植手术，而实际上有超过20000人可从这一挽救生命的手术中获益2。预计器官短缺状况将进一步恶化，仅在美国，心力衰竭的患病人数到2030年预计将超过800万3。随着医学管理的改善、机械循环支持技术的进步以及UNOS分配政策的调整，等待移植患者的生存时间持续延长，导致任一时间点需要进行移植的患者数量进一步增加4,5。

离体机械灌注或常温机械灌注（NMP）是一种器官保存方式，通过允许使用循环死亡后捐献（DCD）的器官并延长保存时间，在一定程度上扩大了供体器官的来源5,6,7,8。与当前器官保存的金标准——静态冷保存不同，NMP 将器官维持在代谢活跃状态，从而实现了对器官的实时监测和移植物功能评估，并已成为 DCD 移植物的标准保存方法8,9。然而，目前临床使用的 NMP 设备仅限于 Langendorff 灌注模式，该模式缺乏可量化指标来预测移植结果，且无法全面获取器官的功能参数6。例如，在 Langendorff 灌注过程中乳酸的累积被认为是预测移植后预后最佳的代谢指标，目前在临床中被用作评估心脏移植物健康状况的替代指标10。然而，即使作为最佳评估生物标志物，它仍无法可靠地预测移植后是否需要机械循环支持11,12。同样，目前临床常用的心脏机械灌注配置为逆行性灌注，这在很大程度上限制了常用血流动力学参数（如主动脉压力和冠状动脉血流量）的预测能力9。

在离体灌注（NMP）期间建立用于准确、精确评估心脏移植物健康状况的评估方案，不仅有助于改善移植后的预后，还将对该领域产生深远影响。客观的预测工具将能够可靠地评估并可能利用目前因严格筛选标准而被拒绝用于移植的边缘性或扩展标准供体器官（即热缺血时间延长（> 30 min）和冷缺血时间（> 6 h）、供体年龄较大（> 55岁）、合并其他共病等），这些供体来自心脏死亡后捐献者（DCD）和脑死亡捐献者（DBD）13。通过启用边缘性心脏的使用，离体灌注有望增加器官供应量，据估计，若能成功移植目前废弃的一半心脏，即可在2至3年内消除心脏移植等待名单14。在离体灌注期间通过左心室负荷获得的血流动力学测量参数因其作为客观评估指标的潜力而受到广泛关注。既往研究表明，这些参数（如左心室脉压、收缩力和舒张功能）比代谢变化趋势更能反映心脏移植物的功能状态15,16,17。

实际上，研究人员已致力于开发和确定最佳的灌注加载方法，以最大程度提高评估的准确性。通过这些努力，其他研究团队已确定了加载过程中最相关的主动脉灌注模式：当采用被动后负荷（即加载期间不对主动脉进行逆向灌注）时，血流动力学参数与移植后心脏功能之间的相关性更强，优于使用泵辅助后负荷（即加载期间对主动脉进行逆向灌注）的情况18。这表明，辅助性冠状动脉灌注可能会掩盖心脏的功能缺陷。先前的研究已成功将被动后负荷整合到灌注系统中，通过构建模拟Windkessel效应的装置实现18,19,20。Windkessel效应有助于缓冲血压波动，维持组织的持续血流，并改善冠状动脉灌注。本方案通过使用一个被两个弹簧加载板包裹的改良静脉输液袋（IV袋），实现基于Windkessel效应的被动后负荷，其中冠状动脉灌注完全依赖于心脏的射血（专利申请中）。

在灌注加载过程中，尽管被动左心房（LA）加压（即依赖重力的加压）在小型动物心脏灌注中是常见做法，但在大型心脏的加载中却很少被采用21,22,23。相反，文献中报道的绝大多数方法依赖于次级泵来实现左心房加压18,24,25,26,27,28。通过重力依赖性储液器而非泵对左心房进行加压，可显著简化加载方案的实施。重力提供了一个固定且恒定的压力源，从而大大减少了为实现并维持适当左心房加压所需的复杂控制系统。此外，通过这种加压方式，无需使用次级泵，便于将加载功能整合到现有的Langendorff装置中，仅需增加一个额外的储液器即可。将加载功能整合到临床使用的机械灌注系统中，将通过在保存期间对心脏移植物进行详细评估，进一步扩大心脏常温机械灌注（NMP）设备的应用价值。实际上，这能够最大化利用一种因运输和设备使用而对患者护理造成重大经济投入的系统29。

本方案展示了在左心室负荷过程中同时采用被动后负荷和被动左心房加压的可行性。通过对被动后负荷/左心房加压作为负荷方法的验证，本方案还提供了一种简便且有效的方式，可将负荷功能整合到现有的朗根多夫灌注系统中。尤为重要的是，该方法能够通过功能评估揭示在长时间保存（˃6 小时）后，存活心脏与衰竭心脏之间的差异。

方案

本研究严格按照麻省总医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）以及JoVE的动物使用指南进行。采用脑死亡后捐献模型，从约克郡猪（30 - 35 kg，年龄3-4个月，性别混合）获取心脏（170 - 250 g），并通过逆向灌注（Langendorff法）维持6小时后进行负荷实验。所有移植物在器械操作过程中均经历了约1小时的冷缺血时间。

1. 系统设计

  1. 检查系统是否由一个器官腔室（11.046 英寸 × 7.595 英寸 × 3.095 英寸）、两个储液罐（4 L 和 1 L）、一个双夹套式氧合器以及一个Windkessel袋（WB）组成。确认两个储液罐均内置消泡装置，以消除泡沫产生。
  2. 检查各组件是否已使用硅胶管牢固连接，较小的储液罐、WB和器官腔室根据灌注模式（即Langendorff模式或负荷模式）处于两种不同配置中（图1A）。
    1. 使用3/8英寸管将器官腔室底部连接至大容量（静脉）储液罐顶部。将大储液罐置于器官腔室下方，以便利用重力使灌注液从腔室流向储液罐。
    2. 使用3/8英寸管将大储液罐底部连接至泵头的进液口。
    3. 将泵头的出液口连接至一段3/8英寸管，该管一端配有3/8英寸转¼英寸变径接头，另一端连接¼英寸管。将¼英寸管连接至氧合器的进液口。
    4. 在氧合器的出液口安装一段带Y型连接器的¼英寸管，Y型连接器的两端均接¼英寸管。
    5. 序列1 — Langendorff灌注期间的灌注液流动路径（图1A中的蓝色虚线）
      1. 将Y型连接器的第一端连接一个带内置鲁尔接头的¼英寸转3/8英寸扩径接头。使用3/8英寸管将该接头连接至WB底部的第一个接口。在扩径接头的鲁尔接头上安装一个三通鲁尔阀，并用于腺苷滴注给药。
    6. 序列2 — 负荷灌注期间的灌注液流动路径（图1A中的橙色虚线）
      1. 将Y型连接器的第二端连接至较小（负荷）储液罐的顶部。在管路上安装一个Hoffman夹具，用于控制储液罐的充液过程。
      2. 从负荷储液罐顶部引出一条溢流管，连接至大容量储液罐。
      3. 在负荷储液罐底部连接一段¼英寸管，并将其连接至器官腔室底部的一个接口。在管路中段安装一个三通鲁尔阀用于腺苷给药，在接近器官腔室前安装一个单向阀。
      4. 将器官腔室接口的另一端连接至直角插管。
    7. 将Windkessel袋（WB）直接置于器官腔室上方。在WB底部的第二个溢流口安装3/8英寸管，并连接至静脉储液罐的任意进液口。在该管路上安装一个Hoffman夹具，在Langendorff模式期间完全关闭以阻断此通路的液体流动，在负荷模式期间调节该夹具以调控主动脉压力。
    8. 在WB顶部的溢流口连接一个三通鲁尔阀，并使用¼英寸管将WB连接至静脉储液罐的任意进液口。在¼英寸管上安装一个Hoffman夹具。在Langendorff灌注期间保持夹具完全关闭，在负荷模式期间调节夹具以调控主动脉压力。
    9. 通过3/8英寸管将WB的第三个出液口连接至器官腔室的主动脉接口，管路下部3/4处留有中断位置用于插入温度探头。

2. 灌注液系统的准备

  1. 配制基础灌注液，包含0.96% Krebs-Henseleit缓冲液、9.915 mM Dextran、25 mM碳酸氢钠、1.054 mM牛血清白蛋白、1%青霉素-链霉素、0.13%胰岛素、0.02%氢化可的松、0.5%肝素和2.75 mM氯化钙。用蒸馏水定容至4 L。
  2. 灌流系统设置
    1. 用蒸馏水冲洗所有管路、系统组件和储液器，并按正确顺序重新连接（图1A).
    2. 将Windkessel袋置于两块丙烯酸板之间，并使用螺钉-弹簧装置固定补充图1).
    3. 将三通鲁尔阀连接至器官腔的主动脉端口和心房端口的鲁尔接头图1B将两个压力传感器连接到器官盒，一个连接至器官室顶部主动脉端口的阀门，另一个连接至器官室底部心房端口的阀门。
    4. 通过将压力传感器暴露于空气中（0 mmHg压力），并在记录设备中将此读数校准为0，来校准压力传感器。
    5. 将两个流量传感器连接到系统管路。将测量主动脉流量的传感器连接至连接工作台（WB）与主动脉端口的3/8英寸管路。将测量心房流量的传感器连接至连接加载储液器与心房端口的管路。
    6. 将温度探针连接至连接WB与主动脉端口的3/8英寸管路上。将排气管连接至主动脉端口阀门的第三个端口，并始终保持开放。将管路的另一端连接至静脉储液器的任意一个入口。
    7. 将热交换器连接至氧合器，并将其温度设置为 38 °C。将 100% 氧气管路连接至氧合器的气体入口端口。开启氧气，流速设为 0.5 L/min。
  3. 系统预处理
    1. 使用器官腔室向系统中加入 2 L 灌注液。开启脉动泵，使灌注液循环（跳过加载储液器），直至灌注液氧合至 pO₂ 不低于设定最低值2 400 mmHg 且温度已达到约 35 °C。
    2. 让灌注液循环并充满所有系统组件以排除空气。轻轻揉捏含有残留气泡的管路以去除气泡。然后，通过部分阻塞液体流出通道并提高泵的流速来增加压力，从而排出主动脉接口中滞留的空气。压力的升高将迫使空气通过排气/除气管排出。
    3. 让灌注液循环流动，直至达到目标温度（37 ˚C，通过温度探针持续监测），并初步评估生化参数，以确保离子浓度正常表1）以及充分的氧合。
      注意：在溶液升温至37 °C并充分氧合后，再读取离子和pH水平。

3. 心脏移植物的获取

  1. 通过肌肉注射阿托品（0.04 mg/kg）、替拉唑（telazol，4.4 mg/kg）和赛拉嗪（xylazine，2.2 mg/kg）使动物镇静。
  2. 动物镇静后，将其转移至手术室，并通过耳部静脉置管建立静脉通路。
  3. 经静脉通路推注丙泊酚（Propofol）负荷剂量（0.16–0.33 mg/kg），注射后3分钟测试有害刺激反应。若无反射存在，则进行气管插管，并通过持续吸入异氟烷（3%–5%）及按需静脉输注芬太尼（5–20 µg/kg/h）维持麻醉。
  4. 插管后，在任一前肢放置血压袖带，并在下唇尖端连接心电图传感器以监测血氧饱和度。
  5. 启动生理盐水滴注，经耳部静脉通路给药。在动物腹侧覆盖手术巾。
  6. 为准备胸骨切开术，静脉推注枸橼酸芬太尼（5 µg/kg）负荷剂量。
  7. 使用10号刀片在胸骨切迹与剑突之间做一垂直切口（约25 cm）。切开后，使用电凝设备分离皮下脂肪和筋膜，直至暴露胸骨。
  8. 暴露后，在胸骨尾侧用手指钝性分离紧贴胸骨的壁层心包。操作时将手指置于胸骨背侧，分离胸骨与内脏之间的粘连组织。
  9. 在胸骨尾侧插入骨凿。在对骨凿施加向上力量的同时，使用锤子将骨凿推进穿过胸骨骨质。
  10. 当胸骨完全分离（从剑突至胸骨切迹）时，中线胸骨切开术完成。此时置入胸骨牵开器并充分撑开，以获得完全暴露。
  11. 使用梅岑鲍姆剪刀（Metzenbaum scissors）从头侧方向切开心包，直至可见主动脉和肺动脉。
  12. 在主动脉上放置两道荷包缝线（4-0 Prolene），并用止血带套索固定。注意缝线应穿过主动脉中膜层，但不得穿透管腔。缝合过浅将无法固定主动脉根部插管，过深则会导致主动脉出血。
  13. 通过耳部静脉通路推注肝素负荷剂量（100 U/kg），并使其循环3分钟。
  14. 将9F主动脉根部插管垂直插入两道荷包缝线之间，并通过轻柔收紧止血带套索固定。确保插管部位无渗漏。通过让血液从主动脉流出，排出主动脉根部插管的心肌停搏液通路中的空气。
  15. 将心肌停搏液袋连接至鲁尔锁接头。使用加压袋对心肌停搏液袋加压，使其在灌注期间维持80 mmHg压力。将蠕动泵连接至主动脉根部插管的第二通路，用于直接从主动脉抽取1 L血液。
  16. 使用血液回收装置分离红细胞（红细胞经离心并用生理盐水洗涤）。待灌注系统达到目标温度后，将红细胞加入灌注系统。
  17. 收集足够血液后，使用胸外交叉钳夹主动脉，并打开心肌停搏液通路以冲洗器官。
  18. 在交叉钳夹及冲洗开始后立即通过左心耳处5 cm切口对心脏进行排气，并完全切断下腔静脉。此时向胸腔内添加冰屑，以帮助降低器官温度。
  19. 成功排气后，结扎或切断上腔静脉，防止来自头部的温血流入已冷却的心脏。
  20. 当心脏被1 L心肌停搏液冲洗完毕后，切断大血管，包括主动脉、主肺动脉、上腔静脉和下腔静脉以及双侧肺静脉。至此完成心脏摘除术。将心脏从胸腔中取出。
    注意：尽可能保留移植物上大血管的长度。肺静脉应尽可能靠近肺部切断。
  21. 用剖腹纱布包裹器官，并置于冰上保存。

4. 移植物制备

  1. 剪断主动脉弓的分支，形成一个单一的流出道。将主动脉插管由此流出道插入，并用扎带和4-0丝线固定（图2）。
  2. 将双极起搏导线置于右心室后壁。剪断肺静脉，形成一个通向左心房的单一流入道。
  3. 在左心房通道周围缝制两圈4-0 Prolene荷包缝线。用止血带套索固定缝线，并在装管前保持未打结状态。
  4. 使用连续单纯缝合（4-0 Prolene）闭合左心耳。记录初始心脏重量。

5. 心脏移植物复苏

  1. 在主动脉端口前夹紧3/8英寸的管路以停止灌注液流动。将心脏放置为后壁朝向操作者，并将器官腔室倾斜约20°。
    注意：选择该移植物灌注位置是为了增强被动引流，且与先前发表的数据一致，表明与悬挂式灌注相比，心脏功能有显著改善26。
  2. 将主动脉插管置于与主动脉端口成90°角的位置，并缓慢松开主动脉管路夹。通过灌注液的逐步流入排出主动脉插管内的空气。
  3. 缓慢减小主动脉插管的角度，直至其与主动脉端口对齐并完全连接至主动脉管路。
  4. 完全连接后，间歇性轻柔按摩心脏，以防止因左心室充盈引起的心脏扩张。在此期间，通过开放的左心房对左心室进行排气。
  5. 同时监测主动脉压力，并维持在可接受范围内（30 - 40 mmHg）。
  6. 启动数据采集，并以333 µL/min的速率开始腺苷滴注
    注意：在灌注方案中加入腺苷（2 mg/mL），以模拟当前临床灌注条件。但需指出，相关的血管扩张作用可能加重不必要的器官水肿30,31,32。
  7. 将起搏导线连接至起搏器，并设置为60次/分钟作为备用起搏。
  8. 若出现心室颤动，使用30 J电击板对心脏进行除颤。根据需要多次施加电击，直至恢复节律性收缩。
  9. 一旦出现有组织的心律（起搏或自主节律），停止手动排气，并使用钩针将心电图导联直接固定在心脏表面。
  10. 拧紧Windkessel袋上的螺丝，直至主动脉压力传感器显示的波形接近正弦波。按照先前描述的方法33，以Langendorff模式持续灌注心脏6小时。

6. 心脏移植物装载

  1. 将直角插管连接至器官腔的心房端口。连接后夹闭插管，并松开氧合器与加载储液器之间管路上的霍夫曼夹，使液体流入加载储液器。
  2. 向加载储液器注液直至压力达到15–20 mmHg。提高泵的输出量，以维持主动脉和心房压力。
  3. 将直角金属尖端的一半插入左心房，尖端朝向左心耳方向。此位置最能稳定地保证二尖瓣功能正常。
  4. 将压力传感器插入左心室内，用于记录左心室压力。松开插管上的夹子，使左心房充盈。
  5. 排除空气后，使用先前放置的缝线和牵引线套扎完全闭合左心房开口。根据需要调整插管和套扎线，以尽量减少液体泄漏。
  6. 在左心房固定插管后，通过夹闭从氧合器通向WB的管路，完全停止向主动脉的逆行灌注。
  7. 将腺苷滴注管路从通向WB的管路转移至加载储液器与心房端口之间的管路。

7. 灌注结束

  1. 在整个实验期间（10 小时），每 30 分钟记录一次生化指标、心率、主动脉/心房血流及压力。通过心房导管获取流入量的生化读数，直接从肺动脉获取流出量读数。
  2. 灌注结束后，停止数据采集，取出心脏并妥善处理。
  3. 将系统中非固定的部件移至大型水槽，拆解后用大量水冲洗并清洗。
  4. 当组件中不再可见血液残留时，重新组装系统。通过器官腔室向系统内加入大量水，并加入约 100 mL 液体碱性洗涤剂，使其随水循环。
  5. 待洗涤剂与水充分混合后，夹闭系统管路，使所有储液器保持充满洗涤剂溶液状态。
  6. 将氧合器与系统其余部分断开，再次用水冲洗，以彻底去除所有皂液。
  7. 待皂液完全清除后，通过流体入口以尽可能高的流速通入空气，吹干氧合器。

结果

4只约克夏猪（30 - 35 kg）的心脏被取出后，通过Langendorff常温机械灌注（NMP）保存6小时，随后进行4小时的持续负荷。选择该实验条件是因为6小时接近临床平均保存时间（5.1 ± 0.7 h）。34通过增加4小时的持续加载（总计10小时） 离体 一段时间后，出现一定程度的心力衰竭是可预期的，因为既往已有研究明确报道了灌注时间与心肌功能下降之间存在显著相关性。35因此，这为突出功能学指标在移植物评估中的重要性及其区分存活心脏与功能衰竭心脏的能力提供了机会。在此方面，大多数基于兰格多夫（Langendorff）系统的指标显示，心脏移植物之间的存活能力无明显差异，包括冠状血管阻力（CVR, 图2C)，氧气摄取率（OUR， 图 2D），乳酸积累（图 2E），葡萄糖消耗量（图 2F），以及钾的积累（图 2G)在整个灌注期间无统计学差异。类似地，移植物增加的重量也未见差异（图 2H）。然而，在负荷时间达到2小时后，对于功能减退的移植物，观察到心率呈持续下降趋势。图2A），曲线下面积在灌注3小时以内无统计学差异图2B）。此外，与加载相关的指标也包含在 图3 提示在负荷开始30分钟时即出现心功能下降，以收缩性指标（dP/dt）衡量最大）作为指示功能丧失的首个指标（图3C）。与心率类似，左心室脉压也呈现稳定下降的趋势（图 3A2 h 负载灌注后观察到脉压的变化，移植物间的脉压差异具有统计学意义（图3B) 和舒张（dP/dt分钟, 图3D灌注1.5小时后观察到的现象。

心脏灌注系统示意图；逆向流动，主动脉/心房压力分析；灌注模式。
图1：灌注系统设置。（A）灌注系统装置示意图。黑色线条表示两种灌注模式下灌注液的流动路径。蓝色虚线表示仅在朗根多夫（Langendorff）灌注期间灌注液的流动路径，橙色线条表示在负荷灌注期间灌注液的流动路径。（B）主动脉（实线）和心房（虚线）压力传感器的位置。由于心房压力传感器在空间上位于心房下方，因此在准确测定左心房（LA）压力时需考虑该高度差。请点击此处查看该图的放大版本。

心脏功能研究：心率、冠状血管阻力、耗氧率、葡萄糖、乳酸趋势的多图数据分析。
图 2：常规评估指标。 若指标可在Langendorff灌注期间获取，则将其称为常规指标。(A) 心率通过左心室腔内压力传感器获得的压力波形计算得出。但由于该指标也可通过Langendorff灌注期间可获取的心电图（EKG）波形轻松计算，因此被视为常规指标。实线表示中位数，阴影区域表示四分位距（IQR）。(B) 每30分钟灌注时间内心率数据的曲线下面积（AUC）。(C) 移植物的血管阻力（CVR）。(D) 耗氧率（OUR）。(E) 乳酸积累。(F) 葡萄糖消耗。(G) 钾离子积累。(H) 体重增加百分比，作为水肿的替代指标。所有数据均以中位数 ± 四分位距（IQR，n = 4）表示。采用重复测量双因素方差分析及基于标准最小二乘均值的Tukey-Kramer HSD事后检验。* = p <0.01。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示左心室脉压趋势的心功能图，以及比较存活与衰竭状态的柱状图。
图3：非常规评估指标。 当指标仅能在负荷灌注期间获取时，被称为非常规指标。(A) 随时间变化的左心室（LV）脉压曲线。实线表示中位数，阴影区域表示四分位距（IQR）。(B) 每30分钟灌注时间内LV脉压曲线下面积（AUC）。(C) 心肌收缩力的AUC通过每30分钟灌注期间LV脉压最大导数获得。(D) 心肌舒张功能的AUC通过30分钟灌注时间内LV脉压最小导数获得。所有数据均以中位数±四分位距（IQR，n = 4）表示。采用重复测量双因素方差分析及基于标准最小二乘均值的Tukey-Kramer HSD事后检验。* = p <0.01，** = p <0.05，*** = p < 0.001，**** = p <0.0001。 请点击此处查看该图的放大版本。

离子浓度 (mmol/L) 
Na+ 135-145 
K + 3.5-6.0
Ca +2 1.0-1.3 
Cl - 96-106 

表1：灌注液中离子浓度的可接受范围。

补充图1：灌注系统设置。 请点击此处下载该文件。

讨论

常温机械灌注是一种强大的器官保存与评估手段，通过扩大成人供心的供体池，对心脏移植领域产生了重大影响36。这一扩展得益于目前能够利用一部分过去被认为不适合移植的心脏。常温机械灌注可在心脏跳动状态下保存移植物，从而提供功能性和代谢性评估的机会。然而，尽管其具有潜力，当前常温机械灌注的应用仍局限于少数边缘性器官（即循环死亡后捐献的器官，热缺血时间<30分钟，来自年龄<55岁且无合并症的供体）。这一限制源于缺乏准确且精确的评估技术，从而阻碍了对更广泛范围边缘性心脏的可靠评估。

在常温机械灌注（NMP）期间对左心室进行负荷加载已成为一种有前景的评估技术，因为在负荷过程中获得的血流动力学参数与移植后的预后高度相关15,16,18。实际上，在NMP过程中引入心脏负荷技术有助于对扩展标准供体器官进行评估，并可能提高其使用率，从而进一步扩大供体来源。尽管该技术具有巨大的潜在影响，目前临床NMP系统尚不具备负荷加载功能37。为了简化并标准化将负荷功能整合到现有NMP系统中的操作，本方案展示了通过被动左心房（LA）加压（即依赖重力的加压）实现负荷的可行性，该方法在大型心脏灌注中极少被采用。这种加压方式无需额外的泵装置，显著简化了心脏负荷的实施过程。然而，由于重力是决定左心房压力的主要因素，因此必须准确定位负荷储液器及其配套压力传感器（心房压力传感器）的空间位置，这对成功实施心脏负荷至关重要。必须格外注意由高度差异引起的压力变化，因为左心房压力过高或过低都会导致次优的负荷条件，并通过不同机制引发移植物功能衰竭。

使左心房（LA）暴露于异常高的压力下会导致心室充盈压升高（即二尖瓣在左心室尚未完全舒张前即开放），这一现象已知可引起心脏移植物损伤并导致预后不良38。此外，尽管较不明显，高压还会使左心房承受非生理性的牵拉，从而引发异常的机械调节，并可能增加心房利钠肽（ANPs）的分泌39。机械调节和心房利钠肽均已被证实是心房颤动的致病因素40,41。另一方面，左心房压力非生理性地过低可能导致舒张期左心室充盈不足，进而引起心输出量下降。由于本方案采用被动后负荷（即在加载过程中不进行主动脉逆行灌注，冠状动脉血流完全依赖左心室的顺行灌注），心输出量下降可能导致心肌灌注减少和相对性缺血。在加载过程中，左心房也可能出现过高或过低的压力，因此在关闭心房前，预先填充加载储液器并仔细验证其压力至关重要。心房压力设置不当是最可能引起技术依赖性移植物损伤的原因。同时，这也是操作中最难准确执行的部分，经过多次迭代试验，才确定了最佳的操作顺序和最合适的加载导管尺寸。

另一个对实验方案成功和相关性尤为重要的因素是使用能够模拟 Windkessel 效应的被动后负荷 体内 循环。在生理条件下，Windkessel效应是指大中动脉（尤其是主动脉）在收缩期起到储血作用、在舒张期起到导血作用的能力。在收缩期，主动脉的弹性管壁扩张以容纳突然增加的血容量42储存的血液随后在舒张期逐渐释放，这一过程得益于动脉壁的弹性回缩。该机制降低了血流的时间变异性，从而确保器官灌注的相对连续性。43这一点对于心脏尤为重要，因为43 与其他器官不同，心肌灌注几乎仅在舒张期发生44因此，将Windkessel效应纳入 离体 灌注系统提供了更符合生理条件的冠状动脉灌注来源，在逆向灌注和负荷灌注模式下均具有优势。此外，将该系统应用于负荷灌注以进行评估时，似乎可增强预测能力，已有研究显示，采用基于Windkessel后负荷灌注的移植物，其心脏功能与移植术后结果的相关性更强。18在此装置中，Windkessel效应通过一个改良的静脉输液袋实现，该输液袋被夹在两块丙烯酸板之间，并通过一个螺旋弹簧连接补充图1），相较于其他已报道的Windkessel装置，该系统结构相对简单18,19,20此外，通过拧紧或松开加载弹簧，能够极大程度地控制反冲压力，从而便于对实验条件进行精细调节。

利用我们的系统，灌注方法可轻松在朗格多夫模式与负荷模式之间相互切换。负荷模式能够获取移植物左心室的功能数据（即左心室脉压、收缩力、舒张功能） 图3）。这些功能数据揭示了移植物存活性方面的一个显著差异，而这种差异在生化趋势中并不明显（图2），包括乳酸（lactate）图2B），心脏移植物评估的临床标准 离体 灌注系统10此外，按照本方案所述以负载模式进行灌注，能够实现心输出量（CO = 心率 × 每搏输出量）的测量，从而提供一项额外且更为传统的心脏功能评估指标45,46每搏输出量是当前设置中较难获取的变量，可通过定量冠状动脉血流来获得，而冠状动脉血流与心房及主动脉血流结合，可用于计算舒张末期和收缩末期容积。类似地，每搏输出量也可通过超声心动图测量或压力-容积环获得。需要强调的是，该设置仅能对心脏左侧进行负荷，因而仅能提供左心室的功能数据，无法反映右心室功能。这可能是当前方案最主要的局限性，尤其是在心脏移植患者中，右心室功能障碍的发生率高于左心室功能障碍。47然而，有报道称，右心室功能障碍在移植后数周内可自行缓解，这或许降低了其重要性。47.

值得注意的是，本论文结果中涉及的四个移植物均采用Langendorff法获取并灌注，灌注时间均为6小时，操作方式完全相同。选择该实验条件的原因是，6小时为常温机械灌注移植物的平均保存时长，此外还可额外进行4小时的持续负荷（总计10小时） 离体 预计较长的保存时间会导致一定程度的移植物功能衰竭。这种预期中的衰竭为凸显功能学评估指标的必要性提供了机会，并展示了其相较于基于Langendorff方法的评估指标所具备的评价能力。事实上，本文的结果表明，通过被动左心房加压和被动后负荷加载所获得的某些功能参数，能够揭示保存时间延长的DBD心脏移植物之间在存活性方面的差异。尽管本文未对此进行验证，但可以合理推测，此类功能评估方法的有效性可能同样适用于识别具有其他已知损伤和（或）功能缺陷（例如DCD来源移植物、老年供体、合并症等）的心脏移植物的存活性，然而仍需进一步研究以明确这些移植物内部的功能特征及其差异。同样，还需进一步研究来确定功能学指标与可移植和不可移植心脏移植物之间的相关性，以及其他可能的存活性指数来源。例如，主动脉与心房负荷压力之间的差值可作为一个可靠的存活性指标，因为该压力差值的变化能够反映是否存在心源性休克。48.

披露

DV 是位于新罕布什尔州佩勒姆的 VentriFlo 公司的雇员和创始人，且拥有与本研究相关的专利申请。更多信息请见 https://ventriflo.com/patents/。 SNT 拥有与本研究相关的专利申请，并在专注于器官保存技术研发的 Sylvatica Biotech 公司科学顾问委员会任职。所有利益冲突均按照麻省总医院（MGH）和 Partners HealthCare 的利益冲突政策进行管理。 AR 和 AAO 接受来自 Paragonix Technologies 公司的研究资助。

致谢

我们衷心感谢美国国立卫生研究院（K99/R00 HL1431149；R01HL157803；R01DK134590；R24OD034189）、美国国家科学基金会（项目编号：EEC 1941543）、麻省总医院研究执行委员会授予的Claflin杰出学者奖，以及Polsky外科领导力奖为SNT提供的经费支持。 我们感谢Hassenfeld家族基金会、麻省总医院研究执行委员会 以及麻省总医院多元化与包容性中心为AAO提供的研究经费。 我们感谢Sarnoff心血管研究基金会为GO提供的研究经费。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
四通旋塞阀 Smiths Medical MX9341L
4-0 Prolene 缝线 Ethicon 8711
5-0 缝线精细科学工具公司18020-50
主动脉连接器 VentriFLO 公司 定制生产
主动脉根部插管美敦力公司 10012
牛血清白蛋白SigmaA7906
氯化钙SigmaC7902
细胞回收机 美敦力公司 ATLG
细胞回收机滤芯 美敦力公司 ATLS00
右旋糖酐Sigma31389
心外膜心电图导联 VentriFLO 公司 定制生产
设备支架和固定架 VentriFLO 公司 定制生产
体外起搏器 美敦力公司 5392
Falcon 高透明度 50 mL 锥形管费舍尔科学公司14-432-22
流量探头 Transonic Systems 公司 1828
肝素钠注射液MedplusG-0409-2720-0409-2721
中空纤维氧合器和静脉储血器 美敦力公司 BBP241亲和力 Pixie，1 L
HTP 1500  热疗泵HTP6826619
胰岛素Humulin R麻省总医院药房
Iworx 数据采集系统IworxIX-RA-834
Krebs-Henseleit 缓冲液SigmaK3753
白细胞过滤器HaemoneticsSB1E
器官灌流槽VentriFLO 公司 定制生产
双极起搏导线美敦力公司 6495
青霉素-链霉素赛默飞世尔科技15140122
压力传感器 IworxBP100
搏动泵VentriFLO 公司 2100-0270
PVC 管路 美敦力公司 HY10Z49R9
直角金属头插管 20F美敦力公司 67318
碳酸氢钠Sigma5761
标准 PHD ULTRA CP 注射泵哈佛仪器公司88-3015
7 英寸止血带套件 美敦力公司 79006
Transonic 流量仪Transonic Systems 公司 T402
静脉储血器 美敦力公司 CB841亲和力 Fusion，4 L
Windkessel 袋VentriFLO 公司 定制生产
Y 型接头美敦力公司 10005

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