方法文章

使用被动左心房加压和被动后负荷进行移植物评估的心脏负荷

DOI：

10.3791/66624

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2024年8月2日

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1Division of Cardiac Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Center for Engineering in Medicine and Surgery, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, Shriners Children's Boston, 3VentriFlo Inc

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该方案描述了一种猪 离体 心脏灌注系统，其中左心室的直接负载可以作为移植物健康的评估技术，同时提供移植物功能的整体评估。此外，还提供了对系统设计和可能的评估指标的讨论。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

离体 机器灌注或常温机器灌注是一种在移植领域越来越重要的保存方法。尽管由于心脏的跳动状态，评估的机会很大，但目前的临床实践依赖于有限的代谢趋势进行移植物评估。从左心室负荷获得的血流动力学测量值因其可能成为客观评估参数而在该领域引起了广泛关注。实际上，该协议提供了一种简单有效的方法，通过简单地添加额外的储液器，将负载能力整合到已建立的 Langendorff 灌注系统中。此外，它证明了采用被动左心房加压进行负重的可行性，据我们所知，这种方法以前从未被证明过。这种方法由被动 Windkessel 基础后负荷补充，该后负荷充当顺应性腔，以最大限度地提高舒张期心肌灌注。最后，它强调了在心脏负荷期间捕获功能指标的能力，包括左心室脉压、收缩力和松弛，以发现长时间保存时间 （˃6 h） 后心脏移植物功能的缺陷。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

原位心脏移植是目前治疗终末期心力衰竭的金标准1。不幸的是，该领域受到严重的供体短缺危机的严重限制，导致每年仅进行 2,000 例心脏移植手术，而超过 20,000 人将从挽救生命的手术中受益2。预计到 2030 年，仅美国的心力衰竭患病率就将超过 800 万人3，预计这种器官短缺将进一步恶化。由于医疗管理的改进、机械循环支持的进步以及 UNOS 分配政策的修订，等待名单生存时间的稳步增加导致在任何特定时刻需要移植的患者数量进一步增加 4,5。

离体机器灌注或常温机器灌注 （NMP） 是一种保存方式，它通过允许使用循环死亡 （DCD） 后捐赠的器官，同时实现一定程度的保存时间延长，促进了供应池的扩大 5,6,7,8。与当前保存的黄金标准静态冷藏不同，NMP 将器官维持在代谢活跃状态，这为实时监测和移植物评估创造了机会，成为 DCD 移植物的标准保存方法 8,9。然而，目前临床上使用的 NMP 设备仅限于 Langendorff 灌注模式，该模式缺乏预测移植结果的定量指标，并且无法捕获功能参数6。例如，Langendorff 灌注期间的乳酸积累已被表示为移植后结果的最佳代谢预测因子，目前在临床环境中用作心脏移植物健康的代表10。然而，即使作为最好的评估生物标志物，它也无法可靠地预测移植后对机械循环支持的需求11,12。同样，常用的血流动力学参数（即主动脉压和冠状动脉血流）的预测能力在很大程度上受到当前临床使用的心脏机器灌注配置的逆行性质的限制9。

制定评估方案以准确和精确地确定 NMP 期间的心脏移植物健康状况，除了改善移植后结果之外，还将在该领域产生巨大影响。客观预测工具将能够可靠地评估和可能利用边缘或扩展标准器官（即延长暖> 30 分钟）和冷缺血时间（> 6 小时）、供体年龄增加（> 55 岁）、其他合并症等）来自 DCD 和脑死亡供体 （DBD） 由于严格的选择标准而目前被拒绝移植13.通过允许使用边缘心脏，NMP 可以促进器官供应的增加，因为据估计，目前未使用的心脏中有一半的成功移植足以在 2-3 年内消除心脏等待名单14。NMP 期间从左心室负荷获得的血流动力学测量值因其作为客观评估参数的潜力而在该领域引起了广泛关注。先前的研究表明，这些参数，例如左心室脉压、收缩力和舒张，比代谢趋势更能指示心脏移植物功能 15,16,17。

实际上，人们一直致力于开发和确定最佳加载方法，以最大限度地提高评估准确性。通过这些努力，其他小组已经确定了负重期间主动脉灌注的最相关模式，因此，与泵支持的后负荷（即负重期间逆行灌注到主动脉）相比，实施被动后负荷（即在负荷期间逆行灌注到主动脉）时，血流动力学参数与移植后功能之间的相关性更强18.这表明辅助冠状动脉灌注可能掩盖了功能缺陷。以前的研究通过实施模拟 Windkessel 效应 18,19,20 的系统，成功地将被动后载荷纳入灌注设置。Windkessel 效应有助于抑制血压波动，维持流向组织的连续血液并改善冠状动脉灌注。该方案使用封闭在两个弹簧加载板中的改良静脉内 （IV） 袋实现基于 Windkessel 的被动后负荷，其中冠状动脉灌注完全取决于心脏射血（正在申请专利）。

在负重过程中使用被动左心房 （LA） 加压（即重力依赖性加压），虽然在小动物心脏灌注中很常见，但很少用于大心脏的负压 21,22,23。相反，文献中报道的绝大多数方法都依赖于二级泵进行 LA 加压 18,24,25,26,27,28。通过依赖重力的储层而不是通过泵对 LA 进行加压，大大简化了加载协议的实施。重力的使用提供了固定和恒定的压力源，这大大减少了对复杂控制系统的需求，以实现和保持足够的 LA 加压。此外，通过这种加压方法，无需使用二级泵，有助于将负载能力整合到当前的 Langerdoff 设置中，因为只需要一个额外的储液罐。将负载能力集成到临床使用的机器灌注系统中，将通过促进在保存期间对心脏移植物的详细评估来扩大心脏 NMP 设备的应用。实际上，最大限度地提高了由于运输和设备利用率而对患者护理构成重大财务承诺的系统29.

该协议证明了在左心室负荷期间采用被动后负荷和被动 LA 加压的可行性。通过验证被动后负荷/LA 加压作为加载方法，该方案还提供了一种简单有效的方法，将加载能力整合到已建立的 Langendorff 灌注系统中。重要的是，它强调了功能评估的能力，即在长时间保存 （˃6 h） 后发现存活心脏与衰竭心脏的差异。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项研究是根据机构动物护理和使用委员会 （IACUC）、马萨诸塞州总医院和 Jove 的动物指南进行的。使用脑死亡后捐赠模型从约克郡猪 （30 - 35 公斤，年龄 3-4 个月，男女混合） 中收获心脏 （170 - 250 g），并在加载前逆行灌注 （Langendorff） 6 小时。在器械操作期间，所有移植物都暴露在大约 1 小时的冷缺血时间中。

1. 系统设计

  1. 检查系统是否由一个风琴室（11.046 英寸 x 7.595 英寸 x 3.095 英寸）、两个储液器（4 L 和 1 L）、一个双夹套氧合器和一个 Windkessel 袋 （WB） 组成。检查两个储液槽是否都包含内置消泡剂，从而消除泡沫。
  2. 检查组件是否与硅胶管牢固连接，较小的储液器、WB 和器官腔处于两种不同的配置（图 1A），具体取决于灌注方式（即 Langendorff 与负载）。
    1. 使用 3/8 英寸管将风琴室的底座连接到大型（静脉）储液器的顶部。将大型储液槽放在器官腔下方，让重力使灌注液从腔室循环到储液槽。
    2. 使用 3/8 英寸管将大型储液罐的底部连接到泵头的进水口。
    3. 将泵头的流出口连接到一根 3/8 英寸的管子上，另一端装有 3/8 英寸到 1/4 英寸的异径管和 1/4 英寸的管子。将 1/4 英寸连接到氧合器的进气口。
    4. 用一根末端带有 Y 型连接器的 1/4 英寸管子安装氧合器的流出口。用 1/4 英寸管安装 Y 型连接器的两端。
    5. 序列 1 - Langendorff 灌注期间的灌注液流型（ 图 1A 中的蓝色虚线）
      1. 将 Y 型连接器的第一端与带有嵌入式鲁尔接头连接的 1/4 英寸至 3/8 英寸扩展器安装在一起。将 3/8 英寸管路连接到 WB 底部的第一个端口。将三通鲁尔阀连接到膨胀器上的鲁尔接头上，并将其用于腺苷滴注。
    6. 序列 2 - 负载灌注期间的灌注液流型（ 图 1A 中的橙色虚线）
      1. 将 Y 型连接器的第二端连接到较小的（加载）储液槽的顶部。将 Hoffman 夹具连接到管上，并将其用于储液槽填充控制。
      2. 从加载储液槽顶部到较大的储液槽放置一条溢流管。
      3. 用 1/4 英寸的管子安装加载储液槽的底部，并连接到器官室底部的端口。在管道长度的中途添加一个三通鲁尔阀用于腺苷输送，并在到达器官腔之前添加一个单向阀。
      4. 将器官腔端口的另一端连接到直角套管。
    7. 将 Windkessel 袋 （WB） 直接放在风琴室上方。用 3/8 英寸管将第二个溢流口安装在 WB 底部，并连接到静脉储液器的任何流入口。连接霍夫曼夹并完全关闭，以在 Langendorff 期间阻止液体通过该端口，并在加载模式下进行调整以调节主动脉压。
    8. 将三通鲁尔阀连接到 WB 顶部的溢流口，并使用 1/4 英寸的管路将 WB 连接到静脉储液器中的任何流入口。将 Hoffman 夹连接到 1/4 英寸管上。在 Langendorff 灌注期间保持夹具完全闭合，并在加载模式下进行调整以调节主动脉压。
    9. 通过 3/8 英寸管将 WB 上的第三个流出口连接到器官腔上的主动脉端口，在温度探头长度的下部 3/4 处中断。

2. 灌注液系统制备

  1. 制备由 0.96% Krebs-Henseleit 缓冲液、9.915 mM 葡聚糖、25 mM 碳酸氢钠、1.054 mM 牛血清白蛋白、1% Pen Strep、0.13% 胰岛素、0.02% 氢化可的松、0.5% 肝素和 2.75 mM 氯化钙组成的碱灌注液。使用蒸馏水将体积调至 4 L。
  2. 灌注系统设置
    1. 用蒸馏水冲洗所有管道、系统组件和储液槽，然后按正确的顺序重新连接（图 1A）。
    2. 将 Windkessel 袋放在两个亚克力板之间，并用螺丝弹簧装置拧紧（补充图 1）。
    3. 将三通鲁尔阀连接到器官腔主动脉端口和心房端口的鲁尔接头（图 1B）。将两个压力传感器连接到器官盒，一个位于连接到器官腔顶部主动脉端口的阀门上，另一个位于连接到器官腔底部心房端口的阀门上。
    4. 通过将压力传感器打开到空气中（0 mmHg 压力）并在记录设备中将此读数设置为 0 来校准压力传感器。
    5. 将两个流量传感器连接到系统管路。将测量主动脉血流的传感器连接到将 WB 与主动脉端口连接的 3/8 英寸管。将测量心房血流的传感器连接到将负载储液器连接到心房端口的管道。
    6. 将温度探头连接到将 WB 连接到主动脉端口的 3/8 英寸管上。将排气管连接到连接到主动脉端口的瓣膜的第三个端口，并始终保持打开状态。将管路的另一端连接到静脉储液器的任何流入口。
    7. 将热交换器连接到氧合器并将其设置为 38 °C。 将 100% 氧气管线连接到氧合器上的进气口。将氧气调至 0.5 L/min。
  3. 系统启动
    1. 使用器官室向系统中加入 2 L 灌注液。打开脉动泵，让灌注液循环（跳过加载储液罐），直到灌注液充氧至最低 pO2 为 400 mmHg，温度达到 ~35 °C。
    2. 让灌注液循环并填充所有系统组件以去除空气。按摩含有任何残留气泡的管子以将其去除。然后，通过部分阻塞液体流出并增加泵流速来增加压力，以去除滞留在主动脉端口中的任何空气。这种压力的增加将迫使任何空气通过吹扫/除气管。
    3. 让灌注液循环直至达到所需温度（37 °C，通过温度探头持续监测），对生化参数进行初步评估，以确保正确的离子浓度（表 1）和足够的氧合。
      注:在溶液升温 （37 °C） 并适当充氧后，读取离子和 pH 值。

3. 心脏移植物采购

  1. 肌肉注射阿托品 （0.04 mg/kg）、特拉唑 （4.4 mg/kg） 和甲苯噻嗪 （2.2 mg/kg） 使动物镇静。
  2. 镇静后，将动物转移到手术室，并使用放置在任一耳的 IV 管获得静脉通路。
  3. 通过 IV 管推注异丙酚 （0.16-0.33 mg/kg），并在注射后 3 分钟测试有害刺激。如果不存在反射，则对动物进行插管，并根据需要通过连续吸入异氟醚 （3%-5%） 和静脉注射芬太尼 （5-20 μg/kg/h） 来维持麻醉。
  4. 插管后，在任一前肢放置一个压力袖带，并在下唇的顶点连接一个心电图传感器以进行血氧饱和度监测。
  5. 开始盐水滴注并通过耳静脉输液管给药。将手术单放在动物的腹侧。
  6. 静脉推注柠檬酸芬太尼 （5 μg/kg） 为胸骨切开术做准备。
  7. 用 10 刀片手术刀 （~25 cm） 在胸骨切迹和剑突之间做一个垂直切口。切口后，使用电烙术将皮下脂肪和筋膜分开，直到到达胸骨。
  8. 暴露后，在胸骨尾侧使用钝指解剖将粘附的心包与胸骨分开。为此，请将手指放在胸骨的背侧，并将胸骨和内脏之间的任何粘附组织分开。
  9. 在胸骨的尾部插入凿子。在对凿子施加向天空的力时，使用木槌将凿子推进到胸骨中。
  10. 正中胸骨切开术完成后，由胸骨完全分离（从剑突到胸骨切迹）确定，放置胸骨牵开器并打开直至完全暴露。
  11. 用 Metzenbaum 剪刀切开颅心包，直到可以看到主动脉和肺动脉。
  12. 将两根荷包线缝合线 （4-0 Prolene） 放在主动脉上，并用止血带圈套器固定。注意缝合线穿过主动脉的中层，而不是穿过管腔。浅层缝合将无法将主动脉根套管固定到位，而深缝合会导致主动脉出血。
  13. 通过耳 IV 推注肝素 （100 U/kg），并使其循环 3 分钟。
  14. 将垂直于主动脉的 9F 主动脉根套管插入荷包线缝合线之间，并通过轻轻拧紧止血带圈套器来固定。确保插管部位周围没有泄漏。让血液从主动脉流出，使主动脉根套管的心脏停搏线脱气。
  15. 将一袋心脏停痰溶液连接到鲁尔锁连接处。使用压力袋对心脏停搏袋加压，以在冲洗过程中产生 80 mmHg。将蠕动泵连接到主动脉根套管的第二根管路，并使用它直接从主动脉中提取 1 L 血液。
  16. 使用血液回收装置分离红细胞（将红细胞离心并用生理盐水洗涤）。达到所需温度后，将红细胞添加到灌注系统中。
  17. 一旦收集到足够的血液，利用经胸交叉夹住主动脉并打开心脏停搏管以冲洗器官。
  18. 在夹闭和冲洗启动后，立即通过左心耳上 5 cm 的切口并完全切断下腔静脉对心脏进行排空。此时向胸腔冰敷，以帮助降低器官的温度。
  19. 成功通气后，严重或结扎上腔静脉，以阻止来自头部的温血到达冷却的心脏。
  20. 用 1 L 心脏停搏液冲洗心脏后，分开大血管，包括主动脉、主肺动脉、上腔静脉和下腔静脉以及双侧肺静脉。这样就完成了心脏外植体。从腔中取出心脏。
    注意:保持连接到移植物上的大血管的尽可能多的长度。尽可能靠近肺部切开肺静脉。
  21. 将器官包裹在剖腹海绵中，并将其放在冰上。

4. 移植物准备

  1. 切开主动脉弓的分支，形成一个流出道。将主动脉插管插入该束并用扎带和 4-0 丝缝合线固定（图 2）。
  2. 将双极起搏线放在右心室后壁上。切开肺静脉，形成一个进入左心房的流入道。
  3. 在左心房束的周边创建两条荷包状的 4-0 脯氨酸缝合线。用止血带圈套固定缝合线，并在装载前解开。
  4. 使用简单的连续缝合线 （4-0 Prolene） 闭合左心房附件。记录初始心脏重量。

5. 心脏移植物复苏

  1. 夹住主动脉端口前方的 3/8 英寸管路，以停止灌注液流。将心脏放置在后壁面向操作员的位置。将风琴室倾斜约 20°。
    注意:选择移植物灌注的这个位置是为了增加被动引流，并且与先前发表的数据一致，表明与悬挂26 相比，功能有显着改善。
  2. 将主动脉插管与主动脉端口成 90° 角放置，然后慢慢松开主动脉线。通过逐步流入主动脉插管来使主动脉插管脱气。
  3. 慢慢减小主动脉插管的角度，直到它与主动脉端口对齐，并完全连接到主动脉线。
  4. 完全连接后，间歇性地轻轻按摩心脏，以防止因左心室充盈而膨胀。在此期间，通过开放的左心房排出左心室。
  5. 同时，监测主动脉压并保持在可接受范围内 （30 - 40 mmHg）。
  6. 启动数据采集并以 333 μL/min 的速率开始腺苷滴注
    注意:腺苷 （2 mg/mL） 被添加到灌注方案中以模拟当前的临床灌注条件。然而，重要的是要指出，相关的血管舒张可能会加剧不需要的器官水肿 30,31,32。
  7. 将起搏线连接到起搏框，并将其设置为 60 bpm 作为备用起搏。
  8. 如果存在颤动，请使用 30 J 的桨对心脏进行除颤。根据需要进行尽可能多的电击，直到达到有节奏的收缩。
  9. 一旦出现有组织的心律（起搏或内在），就停止手动通气，并使用钩针将心电图导联直接放在心脏上。
  10. 拧紧 Windkessel 袋上的螺丝，直到主动脉压力传感器显示的波形模拟正弦波。如前所述，以 Langendorff 配置灌注心脏 6 小时33.

6. 心脏移植物负荷

  1. 将直角套管连接到器官腔的心房端口。连接后，夹住套管，并通过松开氧合器和加载储液罐之间管路中的 Hoffman 夹，让液体进入加载储液罐。
  2. 填充加载储液罐，直到压力达到 15 - 20 mmHg。增加泵的输出以维持主动脉压和心房压。
  3. 将直角金属尖端的一半插入左心房，尖端指向附件。这种放置最一致地促进了二尖瓣的能力。
  4. 将压力传感器插入左心室内，用于记录左心室压力。松开套管上的夹子，让左心房充满。
  5. 脱气后，使用先前放置的缝合线和止血带圈套器完全闭合左心房的开口。根据需要调整套管和圈套器，以尽量减少液体泄漏。
  6. 将套管固定在左心房后，通过夹住从氧合器到 WB 的管路，完全停止逆行灌注到主动脉。
  7. 将腺苷滴注从通向 WB 的管线移动到负载储液器和心房端口之间的管线。

7. 灌注结束

  1. 在实验期间 （10 小时） 每 30 分钟记录一次生化读数、心率、主动脉/心房血流和压力。从心房线获取生化读数以进行流入测量，直接从肺动脉获取生化读数以进行流出读数。
  2. 灌注结束时，停止数据采集，取出心脏并丢弃。
  3. 将系统的非固定部件移动到一个大水槽中，拆卸、冲洗并用大量水清洁。
  4. 一旦组件中没有可见的残留血迹，请重新组装系统。通过器官室向系统中加入大量水和大约 100 mL 的液体碱性洗涤剂，以便与水循环。
  5. 将洗涤剂与水充分混合后，夹紧系统管路，以保持所有储液罐都装满洗涤剂溶液。
  6. 断开氧合器与系统其余部分的连接，然后再次用水冲洗以去除所有肥皂。
  7. 肥皂完全去除后，以尽可能高的速率通过液体输入吹出空气，吹干氧合器。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

收获 4 头约克夏猪 （30 - 35 kg） 的心脏，并通过 Langendorff NMP 保存 6 小时，然后连续加载 4 小时。选择该实验条件是因为 6 h 是平均临床保存持续时间 （5.1 ± 0.7 h）34。通过增加 4 小时的额外连续负荷（总共 10 小时的 离体 时间），预计会出现一定程度的心力衰竭，因为之前已经报道了灌注时间和心肌功能下降之间的明显相关性35。因此，这提供了展示功能指标在移植物评估中的重要性及其辨别存活心脏和衰竭心脏的能力的机会。在此能力下，大多数基于 Langendorff 的指标表明心脏移植物之间的活力没有明显差异，血管阻力（CVR， 图 2C）、摄氧率（OUR， 图 2D）、乳酸积累（图 2E）、葡萄糖消耗（图 2F）和钾积累（图 2G）在整个灌注时间内没有统计学差异。同样，移植物增加的重量没有差异（图 2H）。然而，在加载时间 2 小时后，失败的移植物的心率稳步下降（图 2A），直到灌注 3 小时，曲线下面积没有统计学差异（图 2B）。此外， 图 3 中的负荷依赖性指标表明，早在负荷时间 30 分钟时心脏功能就会丧失，收缩力的测量 （dP/dtmax） 是表明功能丧失的第一个指标（图 3C）。与心率类似，在负荷灌注 2 小时后观察到左心室脉压稳定下降（图 3A），灌注 1.5 小时后，移植物的脉压（图 3B）和松弛（dP/dtmin， 图 3D）之间存在统计学上的显着差异。

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图 1:灌注系统设置。 （A） 灌注设置。黑线表示两种灌注方式期间灌注液的流动。蓝色虚线表示仅 Langendorff 灌注期间灌注液的流量，橙色虚线表示负荷灌注期间灌注液的流量。（B） 主动脉（实线）和心房（虚线）压力传感器的位置。由于心房压力传感器在空间上位于心房下方，因此考虑了高度差以进行适当的 LA 加压。 请单击此处查看此图的较大版本。

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图 2:常规评估指标。 如果在 Langendorff 灌注期间可以获取指标，则将其表示为常规指标。（A） 根据使用左心室内压传感器获得的压力波计算心率。然而，由于该指标可以很容易地从 EKG 轨迹中计算出来，在 Langendorff 期间也可用，因此它被认为是一个常规指标。实线是中位数，阴影区域是四分位距 （IQR）。（B） 每 30 分钟灌注时间的心率数据曲线下面积 （AUC）。（C） 移植物的血管阻力 （CVR）。（D） 摄氧率 （OUR）。（E） 乳酸积累。（F） 葡萄糖消耗。（G） 钾积累。（H） 作为水肿代表的体重增加百分比。所有数据均表示为中位数±四分位距 （IQR， n = 4）。重复测量标准最小二乘均值的双因子方差分析和 Tukey-Kramer HSD 事后分析。* = p <0.01. 请单击此处查看此图的较大版本。

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图 3:非常规评估指标。 当指标只能在负荷灌注期间获取时，它们表示为非常规指标。（A） 随时间绘制的左心室 （LV） 脉压图。实线是中位数，阴影区域是 IQR。（B） 每 30 分钟灌注时间的 LV 脉压曲线下面积 （AUC）。（C） 心脏收缩力的 AUC 由每 30 分钟灌注的 LV 脉压的最大导数获得。（D） 心脏舒张的 AUC 是从 30 min 灌注时间的 LV 脉压的最小导数获得的。所有数据均表示为中位数±四分位距 （IQR， n = 4）。重复测量标准最小二乘均值的双因子方差分析和 Tukey-Kramer HSD 事后分析。* = p <0.01， ** = p <0.05， *** = p < 0.001， **** = p <0.0001. 请单击此处查看此图的较大版本。

离子浓度 （mmol/L） 
钠+ 135-145
K + 3.5-6.0
钙 +2 1.0-1.3
Cl - 96-106

表 1:灌注液中可接受的离子浓度范围。

补充图 1:灌注系统设置。请点击此处下载此文件。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

正常机器灌注是一种强大的器官保存和评估方式，通过扩大成人心脏的供体库，极大地影响了心脏移植领域36。这种扩展是目前能够利用以前被认为不适合移植的一小部分心脏的结果。正常机器灌注使心脏移植物保持跳动状态，为功能和代谢评估提供了机会。然而，尽管具有潜力，但 NMP 的当前应用仍然局限于有限的边缘器官子集（即 55 岁且无合并症的供体在循环死亡后捐献的器官，热缺血时间< 30 分钟<）。这种限制是由于缺乏准确和精确的评估技术造成的，这阻碍了对更广泛的边缘心脏的可靠评估。

NMP 期间的左心室负荷已成为一种很有前途的评估技术，因为在负荷期间获得的血流动力学参数与移植后结果高度相关 15,16,18。实际上，在 NMP 期间将心脏负荷作为一种评估技术可以促进扩展标准器官的评估和可能的利用，从而进一步扩大供体库。尽管存在巨大的潜在影响，但临床 NMP 系统目前尚不具备负载能力37。为了简化和标准化将负荷能力整合到已建立的 NMP 系统中，该协议证明了被动左心房 （LA） 加压（即重力依赖性加压）的可行性，这种方法很少用于大心脏灌注。这种加压方法消除了对辅助泵的需求，大大简化了心脏负荷的实施。然而，由于重力是 LA 压力的主要决定因素，因此了解负荷储液罐和随附的压力传感器（心房压力传感器）的空间位置对于成功的心脏负荷至关重要。必须格外小心地考虑高度引起的压力差，因为 LA 的超压和欠压都会导致次优负载条件，并可能因不同的机制导致移植失败。

将 LA 暴露于异常高的压力会导致心脏充盈压升高（即，二尖瓣在左心室完全松弛之前打开），这种现象已知会导致心脏移植物损伤和不良预后38。此外，不太明显的是，高压使 LA 暴露于非生理性拉伸，导致异常的机械调节和心房利钠肽 （ANP） 分泌的潜在增加39。机械调节和 ANP 都是已知的心房颤动的病因40,41。另一方面，非生理性低的左心房压可能导致舒张期左心室充盈不足，从而导致心输出量减少。由于该方案利用被动后负荷（即，在负荷期间没有逆行灌注到主动脉，冠状动脉血流完全依赖于左心室的顺行灌注），心输出量减少会导致心肌灌注减少和相对缺血。在加载过程中也可能发生 LA 的超压/欠压，因此在关闭加载套管周围的心房之前，预填充加载储液罐并仔细验证其压力至关重要。不正确的心房加压是技术依赖性移植物损伤的最可能来源。这也是正确执行最具挑战性的部分，进行了多次迭代以确定最佳性能序列和加载套管的理想尺寸。

协议成功和相关性的另一个特别重要的因素是使用被动后载荷，该后载荷模拟体内循环中看到的 Windkessel 效应。在生理条件下，Windkessel 效应是指大中央动脉，尤其是主动脉，在收缩期充当储气库和舒张期导管的能力。在收缩期，主动脉的弹性壁扩张以适应血容量激增42。然后，这些储存的血液在舒张期逐渐释放，并得到动脉壁弹性回缩的作用。这种机制减少了血流的时间变化，确保了一定程度上持续的器官灌注43。这对心脏尤其重要，因为43 与其他器官不同，心肌灌注几乎只发生在舒张期44。因此，将 Windkessel 效应纳入离体灌注系统可提供更生理的冠状动脉灌注来源，在逆行和负荷灌注模式下都有益。此外，将该系统实施到负荷灌注中以进行评估似乎增强了预测能力，因为用基于 Windkessel 的后负荷灌注的移植物的心脏性能与移植后结果更密切相关，如其他人所示18。此设置中的 Windkessel 效果是使用封闭在两个通过旋入式弹簧连接的丙烯酸板之间的改良 IV 袋实现的（补充图 1），这是一个比其他报道的 Windkessel 装置 18,19,20 相对简单的系统。此外，拧紧或松开加载弹簧的能力提供了对反冲压力的巨大控制，有助于微调实验设置。

使用我们的系统，灌注方法可以轻松地在 Langendorff 和负载模式之间来回转换。加载模式能够从移植物的左心室获取功能数据（即左心室脉压、收缩力、松弛，图3）。该功能数据揭示了移植物活力的明显差异，这在生化趋势中并不明显（图 2），包括乳酸（图 2B），离体灌注系统中心脏移植物评估的临床标准10。此外，如本协议所述，在负载模式下的灌注可以测量心输出量（CO = 心率 * 每搏输出量），从而提供额外且更传统的心脏功能指标45,46。每搏输出量是从当前设置中获得的更具挑战性的变量，可以通过量化冠状动脉血流来获得，冠状动脉血流与心房和主动脉血流一起可用于计算舒张末期和收缩末期容积。同样，可以通过超声心动图测量或压力-容量环获得每搏输出量。需要强调的是，这种设置只能负荷心脏的左侧，从而产生左心室的功能数据。该方法未提供有关右心室功能的信息。这可能是当前方案的最大局限性，特别是因为右心室功能障碍在移植中比左心室功能障碍更常见47。然而，据报道，右心室功能障碍在移植后几周后消退，可能降低了其重要性的优先级47。

值得注意的是，本手稿结果中出现的四个移植物是以完全相同的方式使用 Langendorff 和 6 小时灌注的。选择该实验条件是因为 6 小时是正常热机器灌注移植物的平均保存持续时间，并且预计额外增加 4 小时的连续加载（总共 10 小时的 离体 时间）会导致一定程度的移植物失败。这种预期的失败提供了强调功能指标必要性的机会，并与基于 Langendorff 的指标相比展示了它们的评估能力。事实上，这份手稿中的结果表明，通过被动 LA 加压和被动后负荷获得的一些功能参数能够揭示延长保存时间的 DBD 心脏移植物的活力差异。虽然此处未证明，但可以合理地假设这种评估有效性可以复制以确定具有其他已知损伤和/或功能缺陷（即 DCD、老年供体、合并症）的移植物的生存能力，但需要进一步研究来确定这些功能特征和这些移植物内的差异。同样，还需要进一步的工作来确定功能指标与可移植与不可移植心脏移植物的相关性，以及活力指数的其他可能来源。例如，主动脉和心房负荷压之间的差异可以是一个可靠的活力指数，因为这些压力读数之间的差异可以表明缺乏或存在心源性休克48。

披露

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DV 是新罕布什尔州佩勒姆 VentriFlo， Inc. 的员工和创始人，并拥有与本研究相关的专利申请。有关更多信息，请参阅 https://ventriflo.com/patents/。SNT 拥有与本研究相关的专利申请，并在 Sylvatica Biotech Inc. 的科学顾问委员会任职，该公司是一家专注于开发器官保存技术的公司。所有竞争利益均由 MGH 和 Partners HealthCare 根据其利益冲突政策进行管理。AR 和 AAO 获得 Paragonix Technologies Inc. 的研究资助。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们衷心感谢美国国立卫生研究院 （K99/R00 HL1431149;R01HL157803;R01DK134590;R24OD034189），美国国家科学基金会 （National Science Foundation） 的资助号为EEC 1941543、代表 MGH 研究执行委员会的 Claflin 杰出学者奖，以及外科领导者的 Polsky 家族奖。我们感谢 Hassenfeld 家庭基金会、MGH 研究执行委员会和 MGH 多元化和包容性中心对 AAO 的研究资助。我们感谢 Sarnoff 心血管研究基金会对 GO 的研究资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4 通旋塞阀 史密斯医疗 
4-0 Prolene 缝合线 爱彼康 8711
5-0 缝合精细科学工具18020-50
主动脉连接器 VentriFLO 公司 定制
动脉根套管Medtronic Inc 10012
牛血清白蛋白SigmaA7906
氯化钙SigmaC7902
细胞保护剂 美敦力公司 ATLG
Cell Saver 卡夹 美敦力公司 ATLS00
葡聚糖Sigma31389
心电图心外膜导联 VentriFLO 公司 定制
设备支架和支架 VentriFLO 公司 定制的
外部起搏器 美敦力公司 5392
Falcon 高透明度 50mL 锥形管Fisher Scientific14-432-22
流量探头 TranSonic 系统公司 1828
肝素钠注射液MedplusG-0409-2720-0409-2721
中空纤维氧合器和静脉 ReseviorMedtronic Inc BBP241Affinity Pixie， 1L
HTP 1500 热疗泵HTP6826619
胰岛素Humulin RMGH 药房
Iworx 数据采集系统IworxIX-RA-834
Krebs-Henseleit 缓冲液SigmaK3753
白细胞过滤器血液学SB1E
器官室VentriFLO Inc 定制
起搏线 BiopolarMedtronic Inc 6495
青霉素-链霉素ThermoFisher Scientific15140122
压力传感器 IworxBP100
脉动泵VentriFLO Inc 2100-0270
PVC 管 美敦力公司 
直角金属尖端插管 20FMedtronic Inc 67318
Bicarobonate 钠Sigma5761
标准 PHD ULTRA CP 注射泵Harvard Aparatus88-3015
止血带套件 7 英寸 美敦力公司 79006
Transonic Flow 箱TranSonic Sytems Inc T402
静脉再见 美敦力公司 CB841Affinity Fusion， 4L
WIndKessel BagVentriFLO Inc 定制的
Y 型适配器Medtronic Inc 10005
MX9341L主HY10Z49R9

参考文献

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