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方法文章

构建纳米和微米级囊泡中非平衡代谢网络

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DOI：

10.3791/66627

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2024年4月12日

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Groningen

本文内容

摘要

我们介绍一种用于重建膜蛋白并将酶及其他水溶性组分包裹于亚微米及微米级脂质囊泡中的实验方案。

摘要

我们介绍一种使用纯化组分将包含整合膜蛋白、酶和基于荧光的传感器在内的复杂蛋白质网络整合到囊泡中的方法。该方法适用于生物反应器的设计与构建，以及复杂非平衡代谢反应网络的研究。首先，我们根据先前建立的方案，将（多个）膜蛋白重构至大单层囊泡（LUVs）中。随后，通过冻融-挤出法将纯化的酶、代谢物和基于荧光的传感器（荧光蛋白或染料）混合物封装入囊泡，并通过离心和/或尺寸排阻色谱去除未封装的组分。通过荧光检测实时监测ATP/ADP比值、代谢物浓度、内部pH值或其他参数，以评估代谢网络的性能。我们所制备的直径为100–400 nm并含有膜蛋白的囊泡，可通过现有但经过优化的程序转化为巨大单层囊泡（GUVs）。该方法可将可溶性组分（酶、代谢物、传感器）引入微米级囊泡，从而使生物反应器的体积扩大数个数量级。含有代谢网络的GUVs被 捕获在微流控装置中，以便通过光学显微镜进行分析。

引言

自下而上的合成生物学领域致力于构建（最小）细胞1,2 用于生物技术的代谢生物反应器3,4 或用于生物医学目的5,6,7,8合成细胞的构建为研究人员提供了一个独特平台，使其能够在模拟天然环境的明确定义条件下研究（膜）蛋白, 从而实现对蛋白质和反应网络的涌现特性及隐蔽生化功能的发现9作为实现自主运作的合成细胞的中间步骤，研究人员开发出能够捕捉生命细胞基本特征的模块，例如代谢能量的保存、蛋白质与脂质的合成以及稳态维持。这些模块不仅加深了我们对生命的理解，还在医学领域具有潜在应用价值8 和生物技术10.

跨膜蛋白几乎存在于所有代谢网络的核心，它们负责将分子转运进或出细胞，传递信号并响应环境变化，同时还发挥多种生物合成作用。因此，在合成细胞中构建代谢模块通常需要将整合膜蛋白和/或外周膜蛋白重构到由特定脂质组成且具有高完整性的（低通透性）双层膜中。这些膜蛋白的操作具有挑战性，需要专门的知识和实验技能。

已开发出多种方法用于在磷脂囊泡中重建膜蛋白，其主要目的通常是研究特定蛋白的功能11,12、调控机制13、动力学特性14,15、脂质依赖性15,16和/或稳定性17。这些方法包括：将去垢剂溶解的蛋白在脂质存在下迅速稀释至水相介质中18；通过将去垢剂溶解的蛋白与去垢剂不稳定的脂质囊泡共孵育，并利用聚苯乙烯珠吸附去除去垢剂19；或通过透析或尺寸排阻色谱法去除去垢剂20。有机溶剂也曾被用于形成脂质囊泡，例如通过油-水界面的形成21，但大多数整合膜蛋白在接触此类溶剂时会失活。

在我们的实验室中，我们主要采用去垢剂吸附法重构膜蛋白，以形成大单层囊泡（LUVs）19。该方法可实现多种膜蛋白的共重构，并能将酶、代谢物和探针封装于囊泡腔内22,23。含有膜蛋白的LUVs可通过电场成形法24或凝胶辅助溶胀法25，在特定条件下转化为巨大单层囊泡（GUVs），且可选择性地包封水溶性组分，同时保持膜蛋白的完整性26。

本文介绍了一种在大单层脂质体（LUVs）中重建非平衡代谢网络的实验方案，该网络通过将L-精氨酸分解为L-鸟氨酸来再生ATP27。ATP的生成与甘油-3-磷酸（G3P）的产生相偶联，而G3P是磷脂合成的重要前体分子22,28。该代谢途径包含两种整合膜蛋白：精氨酸/鸟氨酸反向转运蛋白（ArcD）和G3P/无机磷酸盐（Pi）反向转运蛋白（GlpT）。此外，还需要三种可溶性酶（ArcA、ArcB、ArcC）以实现ATP的循环利用，并利用L-精氨酸分解产生的ATP，通过甘油激酶（GlpK）将甘油转化为甘油-3-磷酸。代谢途径的示意图见图1。本方案为未来构建更复杂的反应网络（如脂质或蛋白质合成、细胞分裂等）提供了良好的起点。该脂质体的脂质组成支持多种整合膜蛋白的活性，并已针对多种分子进出脂质体的运输过程进行了优化27,29,30。

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图1：ATP生成及甘油-3-磷酸合成与分泌途径概览。 请点击此处查看此图的放大版本。

简而言之，将纯化的膜蛋白（溶于十二烷基-β-D-麦芽糖苷，DDM）加入已用Triton X-100去稳定的预制脂质体中，使蛋白插入脂膜。随后通过缓慢添加活化的聚苯乙烯珠去除去垢剂分子，从而形成封闭性良好的蛋白脂质体。可将可溶性组分加入脂质体，并通过冻融循环将其包裹在膜融合过程中形成的内部空间。所得脂质体高度异质，且多数为多层结构。随后通过孔径为400、200或100 nm的聚碳酸酯滤膜挤出，获得尺寸更均一的脂质体；孔径越小，所得脂质体越均一且更倾向于单层结构，但内部容积相应减小。未嵌入的蛋白和小分子可通过尺寸排阻色谱法从外部溶液中去除。蛋白脂质体（proteoLUVs）可通过凝胶辅助溶胀法转化为微米级脂质体，这些微米级蛋白大脂质体（proteoGUVs）随后被收集并捕获于微流控芯片中，用于显微表征与操作。图2展示了该完整实验流程的示意图。

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图2：重建膜蛋白并将酶及水溶性组分包封于亚微米级（LUVs）和微米级（GUVs）脂质体中的实验方案概览。 请点击此处查看该图的放大版本。

重组和包封方案效果良好，且蛋白质的功能得以保留，但蛋白脂质体（proteoLUVs）和大单层囊泡（proteoGUVs）在尺寸上具有异质性。微流控方法31,32 可形成尺寸更均一的微米级囊泡，但通常无法实现膜蛋白的功能性重组，原因是双分子层中残留的溶剂会使蛋白质失活。蛋白脂质体的尺寸范围为100至400 nm，在酶浓度较低时，包封可能导致囊泡内代谢通路不完整（随机效应；见图3）。大单层脂质体（LUVs）适用于构建特定的代谢模块，本文展示了其用于生成ATP以及如G3P等基本构建单元的应用。此类蛋白脂质体有望被进一步包封于大单层囊泡（GUVs）中，作为宿主囊泡内的类细胞器区室。

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图3：直径为100、200或400 nm的囊泡中每囊泡分子数。（A）当包封的蛋白质（酶、探针）浓度在1–10 µM范围内时。（B）膜蛋白与脂质（mol/mol）的重组比例分别为1:1,000、1:10,000和1:100,000。我们假设分子以所示浓度被包封，并以这些蛋白-脂质比例整合到膜中。对于某些酶，我们观察到它们会结合到膜上，这可能会增加其在囊泡中的表观浓度。缩写：LPR = 脂质-蛋白比例 请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

1. 常规准备

  1. 化学品
    1. 将脂质（粉末形式）溶解于 CHCl 中，浓度为 25 mg/mL3 用于制备预先形成的脂质体。
      注意：建议制备新鲜的脂质储备液，但储备液也可在 -20 °C 几周内。以粉末形式操作脂质比使用已溶于CHCl的脂质更为准确。3. CHCl3 应使用玻璃移液管和/或注射器操作，并储存于玻璃容器中，因为 CHCl3 溶解塑料。
    2. 将小分子（核苷酸、氨基酸、荧光探针）溶解于50 mM KPi中（缓冲液A，参见 表1) 并将 pH 调至 7.00 ± 0.01. 溶解 MgCl2 在去离子水中溶解，以避免形成磷酸镁沉淀。
      注意：储备液可保存于 -20 °C 数周内有效，DTT 除外，其需在实验当天新鲜配制。
    3. 将离子载体（例如缬氨霉素、尼日里菌素）溶解于DMSO或EtOH中，配制成100-500 µM. 储存于 -20 °C 几周内；避免蒸发。
      注意：DMSO 不易挥发，因此比 EtOH 更为合适。应使用玻璃瓶而非塑料瓶，以避免离子载体黏附在瓶壁上。
  2. 缓冲液
    1. 在实验当天配制新鲜的缓冲液（表1不要储存超过24小时。
  3. 可溶性蛋白质的纯化
    1. 表达 ArcA、ArcB、ArcC（我们使用一种名为 ArcC1 的特定变体）、PercevalHR 和 GlpK，方法如前所述27,28,33确保在细胞裂解缓冲液中加入10% v/v甘油，以增强蛋白质的稳定性。按照所述方法纯化可溶性蛋白质27,28,33 随后简要报告。
    2. 在冰水浴中解冻10 mL细胞裂解液（约5 g湿重）。同时，加入2 mL（1个柱体积）Ni2+-Sepharose 树脂用去离子水（12 个柱体积）和缓冲液 B（4 个柱体积）在重力流柱（20 mL 容量）上进行平衡 洗涤。将解冻的裂解液转移至冰上；除非另有说明，否则操作均需在冰上进行。
    3. 向解冻的裂解液中加入咪唑，使其终浓度为 10 mM，然后将溶液倒入重力流柱中，于室温下孵育 1 小时 4 °C 轻柔地旋转振荡。
    4. 孵育1小时后，弃去穿流液，并用缓冲液C洗涤树脂（20个柱体积）。
    5. 用缓冲液D洗脱蛋白。第一步洗脱使用60%柱体积，随后进行4至6步40%柱体积的洗脱。
    6. 测定蛋白浓度，并加入Na-EDTA至终浓度为5 mM。
    7. 在低温台式离心机中离心纯化的蛋白质（最大转速，10 分钟） 4 °C). 使用缓冲液 E 通过尺寸排阻色谱法进行纯化。收集洗脱组分，并使用截留分子量为 30 kDa 的浓缩滤器将其浓缩至约 10 mg/mL。准备适当体积的分装样品（约 20 µL)，用液氮速冻，并于 -80 °C 以备后续使用。
      注意：必须将酶浓缩至50–100 µM 以最小化包封所需的体积。
  4. 膜蛋白的纯化
    1. 过表达 ArcD 和 GlpT，方法如前所述22,27,33确保向细胞裂解缓冲液中加入终体积比为10%的甘油； 用于ArcD的纯化， 缓冲液中加入 2 mM 还原剂（例如 DTT）。 通过Ni亲和层析纯化带标签的蛋白质2+-Sepharose 层析
      1. 在冰水浴中解冻一份粗膜囊泡（总膜蛋白10-20 mg）。
        注意：解冻后，除非另有说明，始终在冰上操作。参见 表1 本节所用缓冲液。
      2. 将膜囊泡加入至缓冲液 F（ArcD）或缓冲液 G（GlpT），终体积为 6 mL。样品于 37 °C 下孵育 1 h 4 °C 轻轻振荡。
      3. 通过超速离心（337,000 ×g，4 °C，30 分钟）将溶解的膜蛋白与膜碎片分离 × g，30 分钟， 4 °C）。同时，加入0.25 mL（1个柱体积）的Ni2+将-Sepharose树脂装入重力流柱（10 mL容量），用去离子水（40个柱体积）平衡，随后用缓冲液H（ArcD）或缓冲液I（GlpT）（20个柱体积）冲洗。
      4. 将溶解的蛋白加入重力流层析柱，并加入咪唑至终浓度为 10 mM。在室温下孵育 1 h 4 °C 轻柔地旋转振荡。
      5. 孵育1小时后，弃去穿流液，并用20个柱体积的缓冲液J（ArcD）或缓冲液K（GlpT）洗涤树脂。
      6. 以60% CV洗脱膜蛋白（1st）和 40% CV（2nd-6th) 使用缓冲液 L（ArcD）或缓冲液 M（GlpT）进行步骤操作。
      7. 测定蛋白浓度，并继续进行2.2节的膜重建实验。
        ​注意：对于膜蛋白而言，尺寸排阻纯化并非必需，因为膜重组过程本身已具有类似的纯化效果。步骤1.4和2.2可在一天内完成。建议早晨开始进行蛋白质纯化（步骤1.4），下午继续进行重组（步骤2.2）。重组过程将持续至次日（详见第2.2节）。暂停点：纯化后并以DDM溶解的ArcD和GlpT可于-80℃保存 oC 以备后续使用，但并非所有膜蛋白都适用此方法。准备适当体积的分装样品（50-200 µL)，用液氮速冻，并于 -80 °C 供后续使用。这些蛋白质在 -80°C 保存时可保持活性数月。80 °C 在含有10%（v/v）甘油的条件下。
  5. 样品制备 β用于封闭的-酪蛋白
    1. 重悬100 mg的 β-酪蛋白溶于20 mL去离子水中，用1 M NaOH滴定至 β-酪蛋白完全溶解后，加入1 M乙酸调节pH至7.0，并用去离子水定容至50 mL。将溶液经滤膜过滤 0.2 µm 注射器滤器过滤并分装 500 µL.
      注意 β-酪蛋白可在 -20 °C 6个月。建议过滤 β使用前再次避免 -casein β防止κ-酪蛋白聚集体堵塞微流控芯片。

缓冲液 成分
缓冲液 A 50 mM KPi，pH 7.0
缓冲液 B50 mM KPi，100 mM KCl，10% v/v 甘油，10 mM 咪唑，pH 7.5 
缓冲液 C50 mM KPi，100 mM KCl，10% v/v 甘油，50 mM 咪唑，pH 7.5
缓冲液 D50 mM KPi，100 mM KCl，10% v/v 甘油，500 mM 咪唑，pH 7.5
缓冲液 E50 mM KPi，100 mM KCl，10% v/v 甘油，pH 7.0
缓冲液 F50 mM KPi，100 mM KCl，0.5% w/v DDM，10% v/v 甘油，2 mM β-巯基乙醇，pH 7.5
缓冲液 G50 mM Tris-HCl，0.5% w/v DDM，20% v/v 甘油，pH 8
缓冲液 H50 mM KPi，100 mM KCl，0.02% w/v DDM，10% v/v 甘油，2 mM β-巯基乙醇，10 mM 咪唑，pH 7.5
缓冲液 I50 mM Tris-HCl，0.04% w/v DDM，20% v/v 甘油，10 mM 咪唑，pH 8.0
缓冲液 J50 mM KPi，200 mM KCl，0.02% w/v DDM，10% v/v 甘油，2 mM β-巯基乙醇，50 mM 咪唑，pH 7.5
缓冲液 K50 mM Tris-HCl，0.04% w/v DDM，20% v/v 甘油，50 mM 咪唑，pH 8
缓冲液 L50 mM KPi，200 mM KCl，0.02% w/v DDM，10% v/v 甘油，2 mM β-巯基乙醇，500 mM 咪唑，pH 7.5
缓冲液 M50 mM Tris-HCl，0.04% w/v DDM，20% v/v 甘油，500 mM 咪唑，pH 8
缓冲液 N50 mM KPi，58 mM NaCl，2 mM DTT，pH 7.0
缓冲液 O50 mM KPi，0.5 mM L-鸟氨酸，10 mM Na-ADP，10 mM MgCl2，2 mM DTT，pH 7.0
缓冲液 P50 mM KPi，pH 7.0，2 mM DTT，x mM 葡萄糖（x 的取值用于匹配内外环境的渗透压）
缓冲液 Q50 mM KPi，pH 7.0，0.5 mM 蔗糖，2 mM DTT
缓冲液 R50 mM KPi，pH 7.0，2 mM DTT，10 mM L-精氨酸，x mM 葡萄糖

表1：本方案中使用的缓冲液。

2. 蛋白脂质体：将纯化的膜蛋白重组到预先形成的脂质囊泡中

  1. 第1天
    1. 预制脂质体的制备
      1. 选择脂质组成（例如，合成磷脂， E. coli 基于膜蛋白的需求对极性脂质进行调整。
        注意：DOPE、DOPG 和 DOPC 的混合物（25:25:50 摩尔比）是一个良好的起始选择，但某些蛋白质可能需要添加甾醇或心磷脂；对于酵母质膜蛋白，我们使用棕榈酰-油酰脂质代替二油酰脂质30DOPE、DOPG 和 DOPC（25:25:50 摩尔比）的混合物足以用于 ArcD 和 GlpT 的重建。
      2. 将所需脂质（溶于CHCl₃中）混合3）并蒸发氯仿（CHCl₃）3 在旋转蒸发仪中蒸发至形成脂质膜。通过加入与CHCl等体积的乙醚洗涤脂质3蒸发乙醚，得到干燥的脂质薄膜。
      3. 将脂质膜重悬于水相介质（缓冲液A）中，使总脂质浓度达到20 mg/mL。先加入总体积一半的缓冲液A，轻轻振荡；然后小心将脂质转移至一个洁净且大小合适的试管或瓶中。向原容器中加入新鲜的缓冲液A，重复操作以溶解残留的脂质，并将其转移至新的容器中。最后加入适量缓冲液A，调节至终浓度为20 mg/mL。
      4. 使用探头式超声仪对重悬的脂质进行超声处理。对于直径为6 mm的超声探头，采用以下参数： 4 µm 强度，70% 振幅，工作 5 秒，间歇 45 秒，循环 16 次。将脂质浸入含有乙醇的冰水浴中，以避免超声过程中过热。
      5. 将超声处理后的样品（50 mL 离心管中体积为 40 mL）在液氮中快速冷冻，然后在室温水浴中解冻。重复一次；随后，将脂质体分装为所需体积（例如，1 mL 或每 1.5 mL 塑料管中含 20 mg 总脂质）。
        ​暂停点：此步骤可暂停。再次对每份样品进行速冻（第三次冻融循环），并置于液氮中保存，可保存数月。注意用针头在管盖上刺两次孔，以避免液氮快速沸腾导致管子爆炸。
  2. 第2天
    1. 纯化膜蛋白在预制脂质体中的重组
      1. 在室温水浴中解冻一份脂质体（总脂质20 mg）。同时，安装所选滤膜（例如聚碳酸酯膜，孔径400 nm）至挤出器中，用缓冲液A预平衡挤出器，并将解冻后的脂质体（“乳白色溶液”）装入其中。") 推入挤出器，并使其通过滤膜13次。收集挤出后的脂质体（现为大型单层囊泡； "不透明溶液") 置于适当大小的玻璃或塑料容器（例如 15 mL）中。用缓冲液 A 将脂质体稀释至 4 mg/mL  添加 2 mM DTT。
      2. 将1 mL浓度为4 mg/mL的脂质体转移至1 mL透明比色皿中。使用分光光度计在540 nm处测定初始光密度。将测定后的样品倒回原容器，并加入 50 µL 加入体积分数为10%的Triton X-100至脂质体中。
        注意：滴定体积为 50 µL 10% Triton-X100 适用于 5 mL 体积中含 20 mg 脂质的情况；加入 Triton X-100 会使脂质浓度稀释约 5%。当使用不同量的脂质体时，需调整滴定体积。为获得稳定的光密度信号，应在室温下用 Triton X-100 对脂质体进行滴定。
      3. 重复步骤 2.2.1.2，并记录达到最大光密度的时间（R饱和）。继续滴定至光密度值约为60% Rsat 达到（图4将去垢剂处理后不稳定的囊泡倒回玻璃/塑料管中（最终体积约为5.2 mL），将样品转移至冰上，静置冷却。
      4. 将纯化的膜蛋白加入去稳定的脂质体中，以达到所需的脂质与蛋白比例（w/w）。使用400:1至100:1的比例 w/w；由于 ArcD 和 GlpT 的分子量均为约 55 kDa，脂质与蛋白质的比例为 400:1 w/w 相当于每种蛋白质约含30,000个脂质分子，每400 nm直径囊泡中约含50个ArcD和GlpT分子。
        注意：此处我们使用 400:1 w/w 对应于 50 µg 每20 mg脂质中各蛋白质的含量。
      5. 轻柔旋转混匀样品 4 °C 孵育15分钟，使膜蛋白插入去稳定的脂质体膜中。
      6. 为去除去垢剂，加入200 mg干燥的聚苯乙烯珠，按制造商说明书进行制备。置于旋转混合仪上孵育 4 °C 再继续 15 分钟。
        注意：200 mg 干珠适用于 20 mg 脂质，但当使用不同样品量时应相应调整。
      7. 重复步骤 2.2.1.6 两次，共加入聚苯乙烯微球三次。然后在 4 °C 轻轻旋转振荡。
  3. 第3天
    1. 重复步骤 2.2.1.6；但此次进行进动处理 4 °C 1小时。
    2. 将空的重力流层析柱（10 mL 容量）固定在冰上预冷的空超速离心管（6.5 mL）上方。将样品倒入层析柱中，收集蛋白脂质体于超速离心管内（珠粒保留在层析柱中）。
    3. 用含有2 mM DTT的0.5 mL缓冲液A洗涤珠子，并将滤液收集至超速离心管中。
    4. 通过超速离心（337,000 × g）浓缩蛋白脂质体 × g，30 分钟，4 oC). 将蛋白脂质体重悬于总体积为 200 µL （100 mg脂质/mL）溶于含2 mM DTT的缓冲液A中；离心后囊泡的干燥体积约为40至 120 µL27. 分装为所需体积的等份（例如，将总脂质分为三份，每份6.66 mg）。
      注意：分装体积是任意的，但会影响后续步骤中的沉淀物大小（见步骤 3.2.3.1）。可暂停点：此处可暂停实验流程。将每份分装样品迅速冷冻后，置于液氮中保存，可保存数周。注意用针头在管盖上刺两个孔，以防止液氮快速沸腾导致管子爆炸。

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图4：Triton X-100对预先形成的脂质体的滴定。 将脂质体（5 mg脂质/mL）在50 mM KPi缓冲液（pH 7.0）中通过聚碳酸酯滤膜（400 nm）挤出，随后用Triton X-100进行滴定（实验步骤2.2.1.2）。在A540处测定囊泡的浊度。箭头所示为囊泡发生充分去稳定化的Triton X-100浓度，此条件可用于膜蛋白的自发插入，如文献19所述。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 在亚微米级囊泡中包封用于ATP循环和甘油-3-磷酸合成的代谢网络

  1. 第1天
    1. 组分混合
      1. 进行标准包封时，在最终体积为200 µL的溶液中使用66.6 µL蛋白脂质体（总脂质浓度为33.33 mg/mL）。根据目标浓度计算所需各组分（酶、辅因子）的体积，将这些组分加入蛋白脂质体中，并用缓冲液A（表2）定容至200 µL。
        注意：蛋白浓度可根据实验设计进行调整。但需注意，每个囊泡中平均应含有多个拷贝（>10个）的每种酶，以避免不必要的随机效应。通常浓度 > 1 µM 是安全的；在直径为400 nm的囊泡中，1 µM 浓度约对应20个拷贝（图3）。
      2. 将缓冲液A移入一个空的1.5 mL离心管中，加入DTT、Na-ADP、MgCl2、L-鸟氨酸（如需进行内部pH测定，则加入pyranine）。随后加入酶并轻轻混匀。将该溶液加至预先形成的蛋白脂质体上方，并在低速下短暂涡旋振荡。
        注意：为避免生成不必要的磷酸镁沉淀，必须先加入Na-ADP，再加入MgCl2。由于溶液黏稠，需通过涡旋实现充分混合；但应尽量减少涡旋时间和速度，以避免对蛋白质造成机械损伤。PercevalHR与pyranine不能共包封，因其光谱存在重叠。
    2. 内部渗透压测定
      1. 按照步骤3.1.1.1所述方法配制50 µL溶液，但不加入蛋白脂质体，并使用冰点渗透压仪测定其渗透压。
      2. 使用缓冲液（50 mM KPi pH 7.0）和不同浓度的盐（如NaCl）或糖类建立标准曲线。确定与内部渗透压相匹配的渗透调节剂浓度（缓冲液N）。
        注意：不能使用膜通透性组分（如甘油）来匹配内部渗透压。对于溶解在含甘油缓冲液（如缓冲液E）中的蛋白，应使用不含甘油的相同缓冲液。用于配制等渗外部缓冲液的渗透调节剂应为膜不通透性物质，且不得干扰代谢网络。
    3. 冻融处理
      1. 将蛋白脂质体与可溶性组分一起在液氮中快速冷冻，并在约10 °C的冰水浴中解冻。
      2. 重复步骤3.1.3.1，共进行5次。
        暂停点：可在此处暂停实验。跳过最后一次解冻步骤，将冷冻样品在液氮中保存1–3天。注意用针头在管盖上穿刺两次，以防止液氮快速沸腾导致管体爆炸。与-80 °C相比，液氮保存更优，可最大限度减少脂质氧化。
  2. 第2天
    1. 挤出处理
      注意：所有挤出步骤均在室温下进行，否则气密性注射器可能发生泄漏。
      1. 安装选定的滤膜（如聚碳酸酯膜，孔径400 nm）至挤出器中。用含有与囊泡包封所用相同缓冲液和代谢物的溶液（如缓冲液O加0.1 mM pyranine）清洗挤出器。
        注意：应使用专用挤出器用于加载含pyranine的蛋白脂质体，因为染料会吸附在挤出器表面，可能导致后续样品污染。
      2. 将包封混合物装入挤出器，反复通过滤膜13次。将挤出后的溶液收集至1.5 mL离心管中。
    2. 尺寸排阻层析（可选）
      注意：此步骤旨在通过尺寸排阻层析去除外部分子（如pyranine等染料）。若系统中不含染料，且其他组分在低浓度下不产生干扰（注意：后续还会通过超速离心洗涤囊泡），则可跳过步骤3.2.2。
      1. 溶胀Sephadex G-75树脂，并将其装入玻璃层析柱（长22 cm，宽1.5 cm）。用过量的外部缓冲液（如，缓冲液N）平衡树脂。
      2. 将步骤3.2.1.2所得的挤出蛋白脂质体上样至预平衡的尺寸排阻层析柱，施加外部缓冲液重力洗脱。弃去空体积（约7 mL），然后收集十个1 mL的洗脱组分。通过短时间紫外灯照射观察含蛋白脂质体的组分。合并含有大部分蛋白脂质体的组分（2–4 mL）。
    3. 洗涤与重悬
      1. 通过超速离心洗涤挤出后的蛋白脂质体。在6.5 mL超速离心管中加入5.8 mL缓冲液N，将挤出样品小心铺于上层。若已进行尺寸排阻层析，则将合并的洗脱组分（2–4 mL）加入管中，并用缓冲液N定容至6 mL。
      2. 在337,000 × g、4 °C条件下离心30分钟。弃去上清液，用无尘纸巾彻底干燥超速离心管内壁，注意勿触碰沉淀。用少量缓冲液N（200 µL）重悬沉淀。待沉淀完全重悬后，用缓冲液N补至6 mL。
        注意：重悬沉淀需要一定时间，操作时应谨慎。
      3. 重复步骤3.2.3.1–3.2.3.2共两次，总计洗涤三次；若已进行尺寸排阻层析，则仅需一次离心即可。最终通过加入适量缓冲液N，将沉淀重悬至目标浓度（如总脂质浓度为5.55 mg/mL）。
        ​暂停点：蛋白脂质体可立即使用，或在4 oC下保存至少48小时。超速离心管的规格应根据样品量选择。对于总脂质为6.66 mg的沉淀，使用6.5 mL管较为合适。对200 µL蛋白脂质体（总脂质浓度33.33 mg/mL；干燥沉淀体积约40 µL）28进行三次、每次6 mL缓冲液的洗涤，可使外部组分在每步洗涤中被稀释约100倍。若使用不同规格的离心管，建议相应调整洗涤次数。
  3. 第3天
    1. 通过荧光检测ATP合成
      1. 在黑色石英比色皿（窗口尺寸3 × 5 mm，最小内体积100 µL）中，将反应组分混合至终体积120 µL（表3）。
        注意：可加入离子载体以消除电化学离子梯度。1 µM缬氨霉素与1 µM尼日里菌素的混合物可有效消除质子和钾离子梯度。
      2. 将样品在设定为30 °C的荧光仪中预热，采集PercevalHR的激发光谱（激发波长400–520 nm，带宽5 nm；发射波长550 nm，带宽5 nm）。待探针信号稳定后，加入过量L-精氨酸（5–10 mM）启动代谢网络；若ATP循环与甘油-3-磷酸合成偶联，则同时加入甘油（400 µM）。持续监测反应进程。
    2. 数据分析
      1. 绘制F500/F430随时间变化的曲线，该比值可定性反映ATP/ADP比值。如需对ATP生成进行更定量的评估，可在蛋白脂质体中构建标准曲线，或采用其他补充方法（如通过化学发光法测定ATP含量28）。
组分终浓度
缓冲液 A50 mM KPi pH 7.0
DTT2 mM
Na-ADP 10 mM
MgCl210 mM
L-鸟氨酸 0.5 mM
荧光探针（PercevalHR 或 pyranine）分别为 5.8 µM 或 0.1 mM
ArcA（精氨酸脱亚胺酶）1 µM
ArcB（鸟氨酸氨甲酰转移酶）2 µM
ArcC1（氨甲酰激酶）5 µM
GlpK（甘油激酶）1.6 µM
蛋白脂质体总脂质 33.33 mg/mL

表2：包封组分。 组分按添加顺序列出。可溶性蛋白质溶于缓冲液E中；其余所有组分（除MgCl2溶于去离子水外）均溶于缓冲液A中。

组分终浓度
缓冲液 K 50 mM KPi pH 7.0, 58 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7.0
蛋白脂质体（脂质浓度为 5.55 mg/mL）脂质终浓度为 2.7 mg/mL
离子载体（缬氨霉素、尼日里菌素）各 1 µM

表3：实验条件。 组分按添加顺序列出。蛋白脂质体位于缓冲液N中，离子载体位于DMSO或乙醇中。

4. 用于微米级囊泡的代谢网络放大

  1. 第1天
    1. 微流控芯片制备
      ​注意：本实验使用了 Robinson 等人开发的微流控装置。34. 其他设计的微流控芯片也可获得35,36,37 并且可以轻松地在本方案中实施。
      1. 剪切 200 µL 将移液器吸头插入微流控捕获装置底部三分之一处，并将吸头的底部插入预先制备好的微流控捕获装置中。
      2. 向芯片的入口储液池中加入 400 µL 的 β-酪蛋白溶液（2 mg/mL；参见步骤1.5），注意在此步骤中避免引入空气。将一个96孔板桶放入台式锥形管离心机中，并在其中放置一张实验室用纸巾。将芯片置于纸巾上方，以900 × g离心6分钟 × g 以实现微流控芯片的钝化。离心步骤完成后，微流控芯片的进样储液池与出样尖端处的液面应保持齐平；检查芯片是否存在泄漏。孵育 β在微流控芯片中孵育 -casein 溶液至少 30 分钟。
      3. 去除大部分钝化溶液，避免引入空气，并加入 400 µl 洗涤缓冲液（缓冲液P）。将芯片置于96孔板支架上，在900 × g条件下离心 × g 6 分钟。将芯片置于洗涤液中直至使用（最多不超过 4 小时）。
  2. 用于制备蛋白-大单层囊泡的凝胶制备
    注意：以下描述摘自并改编自25,38.
    1. 将0.5%（w/w）低凝胶温度（LGT）琼脂糖溶于去离子水中，通过微波加热使溶液溶解；确保琼脂糖完全溶解，并避免溶液沸腾。将琼脂糖保持在 50 °C 直至进一步使用。
      注意：溶解的琼脂糖可在室温下保存数周。如需重复使用琼脂糖，只需用微波炉加热融化凝胶即可。
    2. 取两张载玻片，并在载玻片上画出垫片的轮廓。使用高浓度氧气等离子体清洗1分钟，使载玻片具有亲水性。
    3. 将LGT琼脂糖加至载玻片上，直至完全覆盖载玻片表面（约500 µL）；然后，将载玻片倾斜至一个角度 90 ° 并将多余的琼脂糖沥到纸巾上。将载玻片在室温下静置30分钟 50 °C.
    4. 取保存在液氮中的蛋白脂质体（第3节），在冰上解冻。用缓冲液Q将囊泡稀释至脂质浓度为5 mg/mL。
      注意：第3节制备的蛋白脂质体不含可溶性蛋白，若保存在液氮中，可提前较长时间制备。使用蛋白大单层脂质体（proteoGUVs）时，务必对工作溶液进行过滤，以防止微流控装置发生堵塞。
    5. 使用带有1 mm探头的手持式探针超声仪对蛋白脂质体进行超声处理，超声10个循环，每个循环0.5秒 在 和 0.5 s 关闭 在70%的振幅下进行。将囊泡（此后称为proteoSUVs）置于冰上30秒，重复超声处理5次。
    6. 填充 100 µL 注射器（手持式LCP分配器）中的蛋白-小单层脂质体悬浮液。沉积 0.5 µL 将蛋白-小单层脂质体（proteo-SUVs）液滴加至先前制备好的琼脂糖凝胶上；注意不要扰动琼脂糖层，并保持足够间距以防止液滴融合。
      ​注意：使用手持式LCP分配器可实现可重复的液滴沉积，但也可使用其他移液系统。采用玻璃毛细管点样效果较差，因其会扰动已干燥的琼脂糖凝胶。
    7. 使用氮气流代替压缩空气，约10分钟内干燥SUV液滴，以降低脂质氧化的可能性。
    8. 配制1 mL 1.25倍浓缩的缓冲液O（表 4) 在缓冲液 A 中并流经一个 0.2 µm 醋酸纤维素滤膜。取 800 µL 1.25 倍浓缩溶液，并将可溶性酶和探针加入至所示浓度 表 4使用去离子过滤水定容至1 mL。
    9. 准备 100 µL 含有所有组分的膨胀液 表4，蛋白质和甘油除外。使用经三点校准的冰点渗透压计测定膨胀溶液的渗透压。
      注意：准备 100 µL 不含蛋白质和甘油的溶胀溶液，以准确测定该溶液的渗透压。甘油存在于蛋白质溶液中，会影响渗透压，但在GUVs中，甘油能迅速穿过膜，仅 导致短暂的渗透压差异。
    10. 通过将含有凝胶和干燥小单层囊泡（SUVs）的两片物镜玻璃与一片厚度为1.5或3.0 mm的聚四氟乙烯（Teflon）垫片夹心组装，构建GUV溶胀室。然后，使用注射器和针头经侧面的小孔将溶胀溶液加入腔室中。
      注意：可通过改变间隔垫片从1.5 mm至3.0 mm来调整膨胀溶液的体积。
  3. 囊泡膨胀与GUVs的收集
    1. 通过将腔室置于适当环境中使囊泡膨胀 22 °C 至少 30 分钟。
      注意：如果蛋白质或脂质带有荧光标记，可通过光学显微镜（例如台式相差显微镜或宽场荧光显微镜）观察囊泡的肿胀过程。
    2. 通过轻轻敲击腔室所在的固体表面（例如实验台），对凝胶施加温和的物理振荡，从而收获GUVs；取出三分之一体积的液体，并利用产生的气泡轻柔地促使剩余液体流动，使GUVs从凝胶上脱离。
    3. 在GUVs膨胀的同时，配制缓冲液P，并通过调节葡萄糖浓度使其渗透压与膨胀溶液相匹配。将缓冲液经由滤膜过滤 0.2 µm 注射器滤器
      注意：通常情况下，洗涤液和底物溶液应保存在 ± 5 mosmol/kg。流经芯片的任何溶液都应非常洁净，因为污染物可能会堵塞通道。每次均应配制新鲜缓冲液，或在-20 °C 使用前过滤。
  4. 用于显微镜实验的GUV捕获
    1. 将钝化后的微流控芯片安装在显微镜的样品台上。检查是否存在可能的缺陷（如泄漏、截留气泡、通道堵塞）。
      注意：可在使用前尽早检查芯片，以便必要时重新制备新芯片。
    2. 使用弯针将管路连接到储液器的出口端，并将另一端连接至1 mL注射器。将注射器安装到泵上，并将流速设置为最大 10 µL/min.
    3. 从储液池中移除洗涤缓冲液（步骤 4.1.1.3），更换为新鲜培养基（缓冲液 P）。通过注射器以 1-10 µL/min. 用至少 80 µL 渗透压平衡的洗涤缓冲液（缓冲液 P）
    4. 从储液池中移除多余的洗涤缓冲液，并将（蛋白）GUVs加入储液池中。调节流速至0.1- 1 µL/min 使GUVs流经芯片。持续观察芯片，直至有足够数量的GUVs被捕获在芯片中。
      注意：含有相对大量（>引入带电脂质（如磷脂酰甘油（PG）、磷脂酰丝氨酸（PS）或磷脂酸（PA））或非双层形成脂质（如磷脂酰乙醇胺（PE）），其摩尔分数为20 mol%，通过芯片时采用较低流速，以防止破裂。由纯磷脂酰胆碱（PC）组成的囊泡通常更稳定。
    5. 去除多余的GUV溶液，并使用0.1–的恒定流速加入洗涤缓冲液P，1 µL/min，以更换外部培养基并清洗被捕获的GUVs至少1小时，以去除未包封的化合物，并在荧光染料被包封时降低背景荧光。随时间监测背景荧光；若背景荧光未下降，芯片可能已堵塞。
    6. 定位含有足够囊泡的捕获位点并记录其位置。在显微镜上应用相应设置（如激光强度、增益、波长），并开始时间序列实验。
    7. 向储液池中加入渗透压平衡的底物溶液（缓冲液 R），并启动设定的流速 0.5 µL/min.

缓冲液 L 组分
组分1.25 倍浓度工作浓度
缓冲液 A62.5 mM KPi pH 7.050 mM KPi pH 7.0
蔗糖 125 mM100 mM
DTT2.5 mM2 mM
Na-ADP 12.5 mM10 mM
MgCl212.5 mM10 mM
L-鸟氨酸 0.625 mM0.5 mM
包封组分
Pyranine 或 PercevalHR1 mM 或 20 µM
ArcA（精氨酸脱亚胺酶）1 µM
ArcB（鸟氨酸氨基甲酰转移酶）2 µM
ArcC1（氨基甲酸激酶）5 µM

表4：缓冲液O及包封组分。 组分按添加顺序列出。所有组分（除MgCl2溶于去离子水外）均溶于缓冲液A中。包封组分按添加顺序列出。所有水溶性蛋白质均溶于缓冲液E中。

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结果

将溶解的膜蛋白重建入脂质体中，需要对预先形成的囊泡进行去稳定化处理。加入少量Triton X-100最初会导致540 nm处吸光度（A540）升高，这是由于囊泡膨胀引起光散射增强所致（图4）。A540达到最大值时，表明脂质体已达到去垢剂饱和点（Rsat）；此后继续添加Triton X-100将导致囊泡部分溶解。在Rsol时，脂质体完全溶解（图4）。在膜蛋白重建实验中，我们通常使用去垢剂处理至超过Rsat 60%的去稳定化囊泡（以箭头指示）。

重组膜蛋白 ArcD 用于将 L-精氨酸转运进囊泡，同时将 L-鸟氨酸转运出囊泡，并与包封的酶 ArcA、ArcB 和 ArcC 共同作用，利用 ADP 和无机磷酸盐再生 ATP。GlpT 是一种甘油-3-磷酸/磷酸盐反向转运蛋白，需与 GlpK 共同作用，以利用 ...

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讨论

我们提出了一种合成含有（膜）蛋白的亚微米级脂质囊泡（proteoLUVs）以及将proteoLUVs转化为巨大单层囊泡（proteoGUVs）的实验方案。该方案适用于其他膜蛋白13,19,30,40的重建，以及除本文所述L-精氨酸降解和甘油-3-磷酸合成途径以外的其他代谢网络的封装。

膜蛋白在脂质体中的重组通常会导致蛋白质在脂质膜中随机取向。对于 ArcD 和 Glpt 而言，取向无关紧要，因为这些蛋白质具有双向功能，溶质的移动方向取决于总电化学势的符号。但对于单向功能的蛋白质来说，当其取向为50/50时，将有一半的分子无法参与活性作用。

通过聚碳酸酯滤膜挤出囊泡可缩小其尺寸分布，且滤膜孔径越小，囊泡的均一性越高。然而，囊泡尺寸越小，其体积也越小，导致每个囊泡所含的蛋白质（...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

作者感谢 Aditya Iyer 在 pBAD-PercevalHR 基因克隆方面的工作，以及 Gea Schuurman-Wolters 在蛋白质表达与纯化方面的协助。本研究由荷兰科学研究组织（NWO）引力计划"构建合成细胞"（BaSyC）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖Sigma AldrichA9414-25g
Amicon 截留滤膜Sigma AldrichMillipore 离心滤过装置 Amicon Ultra 
BioBeadsBioRad152-3920
CHCl3Macron Fine ChemicalsMFCD00000826
D(+)-葡萄糖Formedium-
D(+)-蔗糖福麦迪姆-
DDM糖原D97002 -C
乙醚Biosolve52805
DMSOSigma-Aldrich276855-100ml
DOPCAvanti850375P-1g
DOPEAvanti850725P-1g
DOPGAvanti840475P-1g
DTTFormedium DTT005
EtOHJ.T.Baker AvantorMFCD00003568
挤出器Avestin IncLF-1
荧光计JascoSpectrofluorometer FP-8300
甘油BOOM51171608
重力流柱Bio-Rad732-1010
Hamilton 注射器 100 µLHamilton7656-01
Hamilton 注射器 1000 µLHamilton81320
手持式LCP分配器Art Robbins Instruments620-411-00
手持式超声波破碎仪Hielscher 超声波技术UP50H
HClBOOMx76021889.1000
咪唑RothX998.4-250g
K2HPO4Supelco1.05099.1000
KClBOOM76028270.1
KH2PO4Supelco1.04873.1000
KimwipeKimtech Science7552
大容量Falcon管离心机EppendorfCentrifuge 5810 R
L-精氨酸Sigma-AldrichA5006-100G
光学显微镜LeicaDM LS2
L-鸟氨酸RothT204.1
共聚焦激光扫描显微镜ZeissLSM 710 ConfoCor 3
MgCl₂2Sigma-AldrichM2670-1KG
微流控芯片自制 基于 PDMS 的DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADPSigma-AldrichA2754-1G
NaClSupelco1.06404.1000
NanoDrop 分光光度计Isogen生命科学ND-1000 分光光度计 NanoDrop
NaOHSupelco1.06498.1000
用于GUV的针头Henke-Ject14-1457527 G x 3/4'' 0.4 × 20 mm
微流控用针头Henke-Ject14-1553818 G × 1 1/2'' 1.2 × 40 毫米
Ni2+ SepharoseCytiva17526802
尼日里菌素Sigma-AldrichN7143-5MG
摆动器VWR83007-210
渗透压仪Gonotec SalmenkippOsmomat 3000 basic 冰点渗透压仪
Plasmacleaner等离子体刻蚀PE-Avenger
聚碳酸酯滤膜Cytiva WhatmanNuclepor 微孔蚀刻膜 产品编号：104171040.4 µm
聚碳酸酯超速离心管Beckman Coulter355647
吡喃宁Acros OrganicsH1529-1G
石英比色皿（黑色）Hellma Analytics108B-10-40
Sephadex G-75 树脂 GE Healthcare17-0050-01
超声波破碎仪Sonics Sonics & 材料公司 INCSonics Vibra Cell
注射器滤器SarstedtFiltropur S plus 0.20.2 µm
注射泵哈佛仪器A-42467
台式离心机Eppendorf离心机 5418
聚四氟乙烯垫片自制 基于聚四氟乙烯45 × 26 × 1.5 或 45 × 26 × 3 或 20 × 20 × 3 mm
TrisPanReac AppliChemA1086.1000
Triton X-100Sigma AldrichT8787-100 ml
超速离心机贝克曼库尔特Optima Max-E
紫外灯SpectrolineENB-280C/FE
紫外/可见光分光光度计JascoV730 分光光度计
缬氨霉素Sigma-AldrichV0627-10MG
宽场荧光显微镜蔡司AxioObserver
β-酪蛋白Sigma AldrichC5890-500g

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