本方案描述了一种大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注模型，该模型在不造成损伤的情况下保留了脑血管的解剖结构。
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本文内容
摘要
摘要
缺血性脑卒中是全球成年人群中导致长期残疾和死亡的首要原因。缺血性脑卒中的动物模型极大地促进了我们对其病理机制的理解以及潜在治疗方法的开发。目前，有两种常用的方法采用尼龙线（血管内缝线）技术来建立脑缺血动物模型。然而，这些方法存在固有的局限性，例如脑部血流灌注减少、颈外动脉系统受损、摄食和/或饮水功能受损以及面部感觉功能障碍。本文介绍了一种新的方法，可在不破坏脑血管解剖结构的前提下建立大鼠缺血性脑卒中模型。在本研究中，暴露Sprague-Dawley大鼠的颈总动脉（CCA），并作一切口。随后将一根尼龙线经切口插入颈内动脉，以阻塞大脑中动脉。在诱导缺血1.5小时后，将阻塞用的尼龙线从颈内动脉和颈总动脉中完全撤出。随后在显微镜（4倍放大）下使用11-0显微缝合线缝合颈总动脉切口。通过应用显微外科技术修复颈总动脉，本研究成功建立了一种独特的方法，在保留脑血管解剖完整性的前提下诱导大鼠缺血性脑卒中模型。
引言
脑卒中是全球成人致死和长期神经功能障碍的首要原因，包含多种类型，其中缺血性脑卒中约占病例的81.9%，脑出血和蛛网膜下腔出血分别占14.9%和3.1%1。缺血性脑卒中常由动脉粥样硬化或大脑中动脉（MCA）闭塞引起，导致局部脑血流减少及继发性脑损伤。营养供应减少使缺血细胞能量耗竭，引发细胞膜完整性丧失、细胞肿胀并最终发生溶解。此外，细胞内钙离子升高、兴奋性氨基酸释放、自由基生成增多以及炎性细胞活化等因素也参与了脑卒中后脑组织的损伤过程2。
缺血性卒中的治疗目标是多方面的：减轻正在进行的神经功能损伤，降低死亡率和长期残疾；预防因活动受限和神经功能障碍引起的并发症；并尽量减少卒中复发的风险。鉴于缺血性卒中病理生理学的复杂性，建立一个可靠的卒中模型对于针对缺血性卒中的治疗研究与开发至关重要。
目前，大脑中动脉闭塞（MCAo）是一种常见的缺血性脑卒中动物模型3。MCAo通常通过将一根硅胶包头或火焰烧钝的单丝线从颈动脉插入，直至到达大脑中动脉（MCA）起始处来实现。1986年，Koizumi 及其同事开发了一种技术，通过在颈总动脉（CCA）做切口，插入硅胶包头的单丝线，使其到达MCA入口并阻断其血流4。1989年，Longa 团队报道了另一种MCAo方法，即通过在颈外动脉（ECA）做切口插入单丝线，使其穿过颈内动脉（ICA）与颈外动脉（ECA）的分叉处，最终到达MCA的起始部位5。
目前两种诱导大脑中动脉闭塞（MCAo）方法的局限性显而易见。Koizumi 方法需要永久性阻断同侧颈总动脉（CCA），导致大脑中动脉灌注减少，因为再灌注完全依赖于 Willis 环4。相反，Longa 方法需切断颈外动脉（ECA），从而损伤 ECA 系统，并继发影响面部肌肉功能5。这种损伤可能影响动物的食物和水摄入，并导致面部感觉功能障碍，进而影响缺血性脑卒中后的神经功能康复及评估6。
本方案旨在通过建立一种不损伤脑血管解剖结构的缺血性脑卒中模型新方法，克服上述局限性。该创新性方法采用显微外科技术修复颈总动脉（CCA），从而避免了既往方法所存在的缺陷。
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方案
本实验程序已获得烟台大学机构动物护理和使用委员会的批准（批准号：YTDX20230410），并遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》。本研究使用体重在300-350 g之间的雄性Sprague-Dawley大鼠。所用动物、试剂和设备的详细清单见材料表。
1. 动物准备
- 将动物饲养在保持12小时光照/12小时黑暗循环、温度和湿度受控的环境中，确保其可自由获取食物和饮水。
2. 麻醉
- 麻醉大鼠 通过 腹腔注射给予氯胺酮（80 mg/kg）和赛拉嗪（20 mg/kg）混合溶液。
注意：将大鼠的头部和身体向下倾斜。注射部位位于动物腹部右下象限。注射前回抽针栓。平均注射体积为0.4 mL。 - 通过评估后肢足垫的缩足反射和眨眼反射来确认麻醉诱导效果。若麻醉深度不足，可在手术过程中补充异氟烷。
3. 缺血模型构建步骤
- 使用高压灭菌器对手术器械进行灭菌。用70%乙醇对手术台及相关设备进行消毒。
- 剃除预期切口部位周围的毛发，准备手术区域。用聚维酮碘和70%乙醇对手术部位的皮肤消毒三次。
- 在腹侧做一条长约1.5 cm的正中切口，并切开浅筋膜。
- 采用锐性与钝性分离技术，暴露颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA）和颈总动脉（CCA），操作方法参照先前描述的方法7。
- 在颈总动脉（CCA）上放置三根4-0丝线缝合线，并在接近颈内动脉（ICA）分叉处的颈外动脉（ECA）上放置另一根丝线缝合线。在近端CCA上打一个可松解的滑结。使用止血钳收紧远端CCA上的缝线以阻断血流。缝合过程中在CCA上松松地打另一个滑结，确保血管未被完全闭塞。
注意：确保滑结不要过紧，仅需足以阻断血流即可，因为在血管缝合过程中需要将其松开。 - 使用剪刀在CCA上近端丝线缝合与中间缝合线之间的位置做一个0.5 mm的切口。
注意：确保切口大小允许栓线（硅胶包被尖端）进入CCA。 - 将一段长3 cm的4-0栓线（硅胶包被尖端）插入CCA。收紧围绕CCA的丝线缝合以固定管腔内栓线并防止出血；随后移除远端CCA上的缝线。
- 继续将栓线插入大脑中动脉（MCA）管腔，同时控制ECA周围的缝线，确保栓线不进入ECA。通常插入长度为18 mm至20 mm。
- 启动计时器，并记录闭塞开始的时间。用3-0丝线缝合颈部切口，小心地将动物放入恢复笼中。腹腔注射0.5 mL生理盐水。
4. 颈总动脉的显微外科缝合
- 在缺血后1.5小时重新麻醉大鼠。用70%乙醇对切口部位消毒三次，并重新打开切口。
- 轻轻撤出阻塞的线栓，直至白色尖端在颈总动脉（CCA）切口附近清晰可见。将微型夹钳水平放置在靠近CCA分叉处已固定的管腔内缝合结附近。
注意：避免夹住白色线栓尖端，以防硅胶脱落并继发血栓形成。 - 松开已固定的管腔内缝合结，并完全移除线栓。
- 在近端CCA结的心脏端一侧附近放置另一个微型夹钳，随后拆除围绕近端CCA的缝合结。
注意：正确放置夹钳对于后续步骤中抬高固定血管以利于微血管缝合至关重要。应将夹钳水平固定在周围肌肉组织上，以防滑脱。 - 用生理盐水冲洗切口部位，并用无菌棉球擦干，清除血液，以获得清晰的手术视野。
- 在显微镜下（4倍放大），使用11-0显微缝合线以间断缝合法缝合CCA切口，通常根据切口大小需要两针。
- 缝合完成后，移除CCA两端的微型夹钳，以恢复血流。
- 用无菌棉球对CCA缝合部位加压30秒。观察CCA 2分钟，确认无出血后，缝合大鼠颈部切口，并将动物置于35 °C的护理箱中，待麻醉苏醒后送回笼中。
注意：术后通过腹腔注射给予美洛昔康，剂量为2 mg/kg，用于镇痛。
5. 使用2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（TTC）染色
- 缺血-再灌注后第3天 在4%异氟烷深度麻醉下实施安乐死，并行颈椎脱位。
- 取出脑组织，使用手术刀片将其切成2 mm厚的冠状切片8.
- 将脑切片在37 °C下用2% TTC孵育20分钟。
- 用10%甲醛溶液将脑切片冲洗两次，然后在室温下用10%甲醛溶液固定30分钟。
- 拍摄连续切片的数字照片，并使用 Image J 软件定量测量梗死面积。
6. 神经功能测试
注意：神经功能采用Garcia试验进行评估，方法参照先前的报道9。
- 评估自发活动、四肢运动的对称性、前爪伸展、攀爬能力、躯体本体感觉以及对触须触碰的反应。根据Garcia评分标准进行评分，最高分为18分，表示神经功能正常。
7. 统计分析
- 使用 GraphPad Prism 通过学生 t 检验 进行统计分析。数据以均值 ± 标准差表示。若均值之间的差异满足 P < 0.05，则认为具有统计学显著性。
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结果
显微缝合过程
将缝线从颈总动脉（CCA）切口附近抽出，直至可见白色的缝线尖端（图1A）。随后在颈总动脉上放置微型夹子（图1B）。在4倍放大倍数的显微镜下，采用间断缝合法，使用显微外科缝线缝合颈总动脉切口（图1C）。接着移除颈总动脉上的微型夹子，恢复其解剖结构和血流（图1D）。
TTC 染色与死亡率
共选取 12 只成年雄性大鼠，随机分为两组：假手术组和模型组（每组 n = 6）。不幸的是，假手术组中有 1 只动物因麻醉过量死亡，模型组中有 1 只动物在 24 小时内死亡。脑缺血所致的梗死灶在纹状体和皮层中均可观察到（图 2A）。缺血性脑卒中术后 3 天，全脑半球梗死面积百分比为 29.3% ± 1.6...
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讨论
大脑中动脉阻塞（MCAo）是一种广泛用于建立卒中动物模型的方法，通过缺血后恢复血流，有效模拟患者中观察到的卒中过程10,11,12。本实验室开发了一种缺血性卒中模型，可在不损伤颈外动脉（ECA）的情况下实现颈总动脉（CCA）的再灌注。在诱导缺血后，对颈总动脉进行显微外科修复。尽管未直接测量颈总动脉的血流量，实验人员在实施再灌注前观察到了颈总动脉的血管搏动。该技术在保持颈部血管解剖完整性的同时，高度模拟了患者卒中的病理过程。此外，神经功能评估和脑缺血面积分析已证实，该手术方法所诱导的卒中具有良好的模型有效性。
先前描述的缺血性脑卒中模型可能受到多种因素的影响。在Koizumi等人4所建立的方法中，由于颈总动脉（CCA）被结扎，血液再灌注在很大程度上依赖于Willis环。然而，脑血管结构的个体差异可能影响最终的脑梗死体积，并可能因血流灌注不足而增加脑卒中...
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披露
作者无任何潜在的利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到2023年河北省引进国外智力项目的资助。我们感谢来自理文编辑（Edanz）（www.liwenbianji.cn）的Lisa Kreiner博士对本稿件初稿的英文文本进行编辑。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10% 甲醛 | 北京莱伯捷科技有限公司 | BL913A | |
| 11-0 显微外科缝合线 | 宁波医用缝针有限公司 | 3/8 1×5 | |
| 2,3,5-三苯基氯化四氮唑 (TTC) | SIGMA | T8877 | |
| 3-0 丝线缝合线 | 宁波医用缝针有限公司 | 3-0 | |
| 4% 异氟烷 | 天津瑞普生物技术股份有限公司 | 20221102 | |
| 6-0 丝线缝合线 | 宁波医用缝针有限公司 | 6-0 | |
| 70% 乙醇 | 山东利尔康医疗科技股份有限公司 | 20230408 | |
| 线栓 | 西安诺博尔生物科技有限公司 | 2838-A5 | |
| 氯胺酮 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 230613BL | |
| 雄性 Sprague Dawley 大鼠 | 济南朋悦实验动物繁育有限公司 | SCXK (鲁) 20190003 | |
| 微型夹 | 上海金钟医疗器械厂 | W40150 | |
| 显微镜 | ZEISS | S100 OPMI pico | |
| 护理箱 | 北京福意电器有限公司 | FYL-YS-100L | |
| 赛拉嗪 | SIGMA | PHR3263 |
参考文献
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