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利用流式细胞术定量小胶质细胞对突触物质的吞噬作用

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DOI：

10.3791/66639

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2024年5月31日

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1Psychoneuroimmunology, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association, 2Experimental Ophthalmology, Charité Universitätsmedizin Berlin

本文内容

摘要

本文介绍了两种利用流式细胞术定量分析小胶质细胞吞噬vGLUT1阳性突触以及pHRodo Red标记的粗制突触体的实验方案。

摘要

小胶质细胞在大脑突触修剪过程中发挥关键作用。分析小胶质细胞对突触的吞噬作用对于理解该过程至关重要；然而，目前用于识别小胶质细胞吞噬突触的方法（如免疫组织化学和成像技术）均存在操作繁琐且耗时较长的问题。为解决这一挑战，本文提出 体外 和 在体内* 利用流式细胞术快速高通量定量小胶质细胞吞噬突触的检测方法

在 体内* 实验中，我们通过对成年小鼠脑组织新鲜分离的细胞进行vGLUT1细胞内染色，以定量分析小胶质细胞对vGLUT1+ 突触的吞噬作用。在 体外 突触体吞噬实验中，我们利用从成年小鼠脑组织新鲜分离的细胞，定量分析小胶质细胞对pHrodo Red标记的突触体的吞噬情况。这些方案共同提供了一种时间效率高的方法，用于定量小胶质细胞对突触的吞噬作用，并为传统依赖繁琐图像分析的方法提供了有前景的替代方案。通过简化分析流程，这些检测方法有助于更深入地理解小胶质细胞在不同疾病模型中突触精细调控中的作用。

引言

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻免疫细胞1。它们持续监测自身的微环境并执行监视功能1,2。此外，它们频繁与突触相互作用，并介导突触活性的精细调节3。因此，小胶质细胞已成为突触精细化过程中的关键参与者。

多个研究团队已证实小胶质细胞通过吞噬突触在突触精细化过程中发挥重要作用3,4,5,6,7。该过程的异常可能参与精神分裂症和阿尔茨海默病等神经发育障碍和神经退行性疾病的病理机制8。在多种神经系统疾病的小鼠模型中，已检测到小胶质细胞介导的突触异常精细化现象5,9,10。因此，明确小胶质细胞吞噬突触的不同分子机制，对于理解神经发育和神经退行性疾病的病理生理学至关重要8。

靶向小胶质细胞对突触的吞噬作用在干预疾病进展以及深入理解神经发育性和神经退行性疾病潜在机制方面具有重要意义。为促进相关研究，亟需快速且高通量的技术方法。目前的方法学手段包括 体内, 离体 和 体外 能够检测小胶质细胞内突触物质的检测方法。通常，小胶质细胞吞噬突触的检测主要依赖免疫组织化学（IHC）和基于显微镜的技术5,6,11，这些方法耗时耗力，且在分析大量小胶质细胞时存在局限性。

鉴于这些技术上的局限性，探索替代方法势在必行。为克服这一问题，我们优化了一种基于流式细胞术的方法，可实现对小胶质细胞吞噬突触过程的高效、无偏倚且高通量的分析。我们选择海马体作为主要研究区域，因其具有高度的突触重塑和可塑性12，但该方案也可适用于其他不同脑区。尽管流式细胞术已在先前的研究中用于检测小胶质细胞对突触的吞噬作用13,14,15，本文中我们提供了一种逐步操作的方法，使用目前 commercially available 的荧光染料偶联vGLUT1抗体。此外，我们还提供了一种互补的 in vitro方法，通过使用粗制突触体进行小胶质细胞吞噬突触物质的高通量筛选。

方案

实验流程的总体示意图如下所示 图1A所有涉及活体动物操作的实验均严格遵循德国动物保护法，并经柏林地区卫生与社会服务局（Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Germany）批准。小鼠饲养于柏林马克斯·德尔布吕克分子医学中心（Max Delbrück Center for Molecular Medicine, MDC）动物实验中心，在通风笼具中按标准实验室条件进行群养，光照/黑暗周期为12小时/12小时。自由供应食物和水 随意摄取 参见 表1 缓冲液和试剂的配制 材料表 有关本方案中使用的所有试剂、仪器和材料的详细信息。对于vGLUT1特异性检测，我们使用了术语 体内在整个手稿中需注明流式细胞术需要进行组织匀浆和细胞分离，且小胶质细胞在分离程序后存活率约为95%（图1B 和 补充图 S1因此，它们仍具有吞噬突触物质的能力 离体，短暂保存至固定前。因此，vGLUT1的定量分析+ 小胶质细胞包括两者 在体 短期 离体 吞噬作用持续至固定步骤。

1. 用于检测的细胞内 vGLUT1 染色 体内* 小胶质细胞对谷氨酸能突触的吞噬作用

注意：以下细胞分离步骤改编自文献16。所有细胞分离操作均应在冰上进行。

  1. 使用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠。用 10 mL 冰冷的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）进行心脏灌注，持续约 2 分钟。
    注意：每个样本使用一只小鼠（n）。
  2. 将脑组织从颅骨中取出，并保存在 1 mL 神经细胞培养基中。
    注意：使用神经细胞培养基（如 Hibernate-A 培养基），以确保组织解离后细胞具有较高的存活率。
  3. 将脑组织转移至盛有 1 mL 冰冷神经细胞培养基的培养皿中，按照先前描述的方法分离海马体17。
  4. 将海马体转移至含有 1 mL 神经细胞培养基的达恩斯匀浆器中，使用松动的研杵轻轻研磨约 25 次，以解离组织。
  5. 在 5 mL 聚丙烯管上放置 70 µm 滤网，并加入 500 µL 神经细胞培养基。将组织匀浆液通过滤网转移至该 5 mL 聚丙烯管中。
  6. 用 1 mL 冷神经细胞培养基冲洗达恩斯匀浆器两次，然后在 400 × g 条件下离心 8 分钟。
  7. 吸除上清液，通过轻柔吹打将沉淀重悬于 500 µL 冰冷 DPBS 中。确保形成均匀悬液后，用 DPBS 定容至 1.5 mL。
  8. 向样本中加入 500 µL 等渗 Percoll 溶液，轻轻重悬，再在其上方覆盖 2 mL 冷 DPBS。
  9. 在全速加速、无刹车条件下，于 3,000 × g 离心 10 分钟。吸除上层液体以及中间相的髓鞘层。
    注意：除非另有说明，后续所有离心步骤均在 4 oC 下进行。
  10. 向样本中加入 4 mL 冷 DPBS，在 400 × g 条件下离心 10 分钟。吸除上清液，将细胞重悬于 100 µL 可固定的活率染色液中，在 4 °C 下孵育 30 分钟。
  11. 向样本中加入 1 mL 冷 FACS 缓冲液，在 300 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，加入 100 µL CD16/CD32 染色液（以 FACS 缓冲液 1:200 稀释）。涡旋约 5 秒，在 4 °C 下孵育 10 分钟。
    注意：CD16/CD32 染色是一种预处理步骤，旨在减少抗体与表达 Fc 受体的细胞（如小胶质细胞）之间的非特异性结合，适用于流式细胞术等应用。
  12. 向样本中加入 1 mL FACS 缓冲液，在 300 × g 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，加入 100 µL 染色主混合液-I（抗 CD11b/抗 CD45 1:100，抗 Ly6C/抗 Ly6G 1:200，溶于 1× FACS 缓冲液中）。在 4°C 黑暗条件下孵育 20 分钟。
  13. 向样本中加入 1 mL FACS 缓冲液，在 300 × g 条件下离心 5 分钟。
  14. 将沉淀重悬于 250 µL 固定缓冲液中，在 4 °C 下孵育 25 分钟。
  15. 加入 2 mL 1× 透化缓冲液（PERM Buffer），在 300 × g 条件下离心 5 分钟。
  16. 弃去上清液，加入 100 µL vGLUT1 或同型对照染色液。涡旋约 5 秒，在 4 °C 下孵育 50 分钟。
  17. 加入 2 mL 1× PERM 缓冲液，在 300 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，向样本中加入 2 mL FACS 缓冲液。
  18. 在 300 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。将细胞重悬于 250 µL FACS 缓冲液中，并通过 40 µm 滤网过滤。
  19. 使用流式细胞术分析单细胞/活细胞/CD11b++/CD45+ 小胶质细胞中 vGLUT1 的荧光强度。每次实验均以脾脏巨噬细胞作为阴性对照。
    1. 通过将剪碎的脾组织轻轻挤压穿过 70 µm 滤网两次来分离脾细胞。用 40 mL DPBS 冲洗滤网，将悬液收集至 50 mL 锥形管中。
    2. 在 350 × g 条件下离心 10 分钟，将所得沉淀重悬于 1 mL 红细胞裂解缓冲液中，在冰上孵育 10 分钟。
    3. 孵育结束后向样本中加入 10 mL DPBS，在 350 × g 条件下离心 10 分钟。
    4. 继续执行步骤 1.11 至 1.17 中所述的染色步骤。
      注意：定义脾脏巨噬细胞为 CD11b ++/ CD45 ++/ 活细胞群体的设门策略见补充图 S2。
    5. 设门策略（图 1）
      1. 第一道门：调整前向散射面积（FSC-A）[x 轴] 和侧向散射面积（SSC-A）[y 轴]，使小胶质细胞群体位于设门区域内，并排除细胞碎片。
      2. 调整前向散射面积（FSC-A）[x 轴] 和前向散射高度（FSC-H）[y 轴]，以排除双联体。单细胞在此散点图中呈对角线分布。
      3. 调整 CD11b-PECy7 [y 轴] 和 CD45-APC [x 轴]，选择表面 CD11b 高表达、CD45 中等表达的细胞群体作为小胶质细胞。
      4. 在 FITC[y 轴] 阴性门中排除死细胞。可选：也可在 FITC 阴性门中进一步排除 Ly6C 和 Ly6G-FITC 阳性的细胞，以从分析中剔除中枢神经系统相关巨噬细胞。
        注意：与活细胞不同，死细胞的细胞膜完整性受损，允许可固定的活率染料进入胞质，从而增加蛋白标记量18。因此，死细胞的荧光信号强于活细胞，而活细胞位于所定义的设门区域内。
      5. 调整 CD45-APC [x 轴] 和 vGLUT1-PE [y 轴]；相对于脾脏样本中未检测到阳性事件的阈值门（内部生物学阴性对照，图 1E），高于该阈值的细胞群体被视为样本中的 vGLUT1 阳性部分。

2. 检测 体外 小胶质细胞对粗制突触体的吞噬作用

  1. 粗制突触体的制备及pHrodo Red标记
    注意：以下所有步骤均需在冰上进行。
    1. 执行步骤1.1至1.2。
    2. 将脑组织转移至含有1 mL冰冷新生神经细胞培养基的培养皿中，仔细分离海马体。始终将培养皿置于冰上。在下一步中使用海马体进行小胶质细胞的分离。
    3. 将剩余脑组织（不包括小脑和嗅球）转移至含有1 mL突触蛋白提取试剂的Dounce匀浆器中，使用松散研杵轻轻匀浆，约进行30次。每10 mL提取试剂中加入一片蛋白酶抑制剂片剂，然后根据制造商说明书分离突触体。
      注意：突触蛋白提取试剂（如SynPER19）可用于制备含有生物活性突触前和突触后蛋白的突触体。
    4. 将粗制突触体沉淀溶解于500 µL的0.1 M Na2CO3溶液中。用10 µL的0.2 mM pHrodo Red对突触体样本进行染色。将粗制突触体样本在室温（24–25 °C）下轻轻振荡孵育1.5小时。
    5. 向样本中加入1 mL冷DPBS，以最大速度（20,815 × g）离心1分钟，并吸除上清液。
    6. 重复步骤2.1.5，共进行7次，以彻底去除样本中未结合的过量pHrodo Red。
    7. 最后一次离心后，进行标准BCA法测定样本的蛋白浓度。
    8. 可选：使用液氮将突触体样本在含5% DMSO的DPBS中速冻，并于-80 °C保存3周。用铝箔包裹管子以尽量减少光照暴露。
  2. 体外使用新鲜分离的成年小胶质细胞进行粗制突触体吞噬实验
    1. 配制aCSF，并用95% O2:5% CO2平衡30分钟。
      注意：对于步骤2.2.2–2.2.4，请遵循制造商说明书配制基于木瓜蛋白酶的消化液。
    2. 向木瓜蛋白酶试剂盒中的2号小瓶加入4 mL aCSF。将小瓶置于37 °C水浴中约10分钟，直至木瓜蛋白酶溶液变得澄清。
    3. 向木瓜蛋白酶试剂盒中的3号小瓶加入400 µL aCSF。通过缓慢移液轻轻混匀约10次。
    4. 从3号小瓶中取出200 µL加入2号小瓶（在步骤2.2.3中已重构）。保留剩余的3号小瓶内容物。
    5. 取步骤2.1.2中分离的海马体，使用手术刀将其切碎。
    6. 将切碎的海马体转移至组织解离管中，管内已加入2 mL步骤2.2.5配制的酶溶液。将管子放入组织解离仪中，运行程序：37C_ABDK_01（约需30分钟）。
    7. 将样本置于37 °C水浴中约20分钟，每5分钟用1 mL移液器轻轻吹打混合一次，避免产生气泡。
      注意：此过程应持续进行，直至组织完全解离且外观均匀，以确保高效解离。除非另有说明，后续所有离心步骤均在4 oC下进行。
    8. 小心将浑浊的细胞悬液转移至新的15 mL离心管中，以300 × g离心5分钟。
    9. 在该5分钟期间，为每个样本配制以下洗涤液（5 mL）：将木瓜蛋白酶试剂盒中提供的重构白蛋白-卵黏蛋白抑制剂溶液500 µL加入4.5 mL aCSF中。再将步骤2.2.5中剩余的3号小瓶溶液加入该洗涤液中。
    10. 弃去步骤2.2.8中的上清液，并立即将细胞沉淀重悬于上述洗涤液中。
    11. 将样本通过70 µm滤膜转移至新的5 mL微量离心管中。以300 × g离心5分钟。
    12. 继续执行此前步骤1.7–1.9中所述的Percoll梯度离心步骤。
    13. 通过缓慢吹打，小心地将细胞重悬于MACS染色缓冲液中。将样本在4 °C下孵育15分钟。
    14. 向每个样本中加入1 mL MACS缓冲液，以300 × g离心8分钟。
    15. 将细胞重悬于500 µL MACS缓冲液中。
    16. 将阳性选择柱置于磁力分离器中。用3 mL MACS缓冲液冲洗柱子以平衡。
    17. 轻轻混匀后，将500 µL细胞悬液加至柱子上。用3 mL MACS缓冲液洗涤柱子3次。
    18. 将柱子从磁力分离器上取下，置于15 mL锥形管上。向柱子中加入5 mL MACS缓冲液，并立即用推杆冲洗出细胞。以300 × g离心10分钟。
    19. 在此期间，配制20 mL含40% FBS的DPBS。将每样本1 mL DMEM在水浴中预热至37 °C。
    20. 将最终的细胞沉淀溶解于1 mL预热的DMEM中。在24孔板中，每孔加入约150,000–200,000个细胞，溶于500 µL预热的DMEM中。作为对照，在额外1–2孔中接种相同数量的细胞。使用光学显微镜检查所有孔中的细胞汇合度。
      注意：若目标脑区为海马体或类似较小脑区，可将5只小鼠的组织合并为一个样本（n），以分离约150,000个小胶质细胞。对于全脑组织，每n使用1只小鼠即可通过两种分离方案获得相似数量的细胞。或者，可将约40,000个细胞接种于96孔板中，终体积为100 µL，以启动吞噬实验。此方法减少了分析的细胞数量，但也减少了每n所需的小鼠数量。由于DMEM中缺乏FCS导致的蛋白质剥夺将触发吞噬作用。
    21. 将培养板在培养箱中（37 °C，5% CO2）孵育1–2小时。
      注意：此步骤旨在使细胞在功能吞噬实验开始前，从分离过程带来的应激效应中恢复。
    22. 非常缓慢地从每孔中取出250 µL培养基，向每孔加入250 µL新鲜预热的DMEM，并在顶部加入3 µg pHrodo Red标记的突触体。使用光学显微镜检查所有孔中的细胞汇合度。
      1. 对于阴性对照孔，在接种了细胞的额外孔中加入等量未标记的突触体。
      2. 对于实验孔，确保第1孔仅含细胞；第2孔含细胞+未标记突触体；第3孔含细胞+3 µg pHrodo Red；第4孔含DMEM + 3 µg pHrodo Red。
    23. 将细胞与突触体在培养箱中（37 °C，5% CO2）共孵育2小时。
    24. 吸除培养基，用冷DPBS洗涤各孔。每孔加入200 µL胰蛋白酶/EDTA溶液，消化35秒以使细胞脱落。
    25. 每孔加入1 mL含40% FBS的DPBS，通过滤网将细胞转移至5 mL聚丙烯管中。在此过程中保持培养板和离心管在冰上，以促进细胞脱落。
    26. 用500 µL冰冷新生DPBS洗涤每孔2次。将收集的样本以500 × g离心5分钟。
    27. 将细胞重悬于染色液中，染色液含1/200稀释的CD16/CD32于100 µL FACS缓冲液中，在冰上孵育10分钟。
    28. 孵育后，在染色液中加入CD11b和CD45抗体，终浓度均为1/100。在4 °C避光条件下孵育20分钟。
    29. 用1 mL FACS缓冲液洗涤样本，以300 × g离心10分钟。
    30. 将沉淀重悬于250 µL FACS缓冲液中，使用流式细胞仪记录至少100,000个总事件。分析CD11b++/CD45+小胶质细胞中pHrodo Red的荧光强度。
    31. 设门策略（图2C）
      1. 调整主门：前向散射面积（FSC-A）[x轴]与侧向散射面积（SSC-A）[y轴]，使小胶质细胞群体位于设门区域内，并排除细胞碎片。
      2. 调整前向散射面积（FSC-A）[x轴]与前向散射高度（FSC-H）[y轴]，以排除双联体。单细胞在此散点图中呈对角线分布。
      3. 调整CD11b-PECy7 [y轴]与CD45-APC [x轴]，选择表面CD11b高表达、CD45中等表达的细胞群体作为小胶质细胞。
      4. 计算该群体中pHrodo-PE的中位荧光强度。使用与未标记突触体共孵育的相同细胞作为阴性对照。

结果

在本项目中，我们优化并提出了两种用于测量的方案 体内* 和 体外 小胶质细胞对突触的吞噬作用。在第一个实验方案中，我们重点关注了 体内* 吞噬 vGLUT1 阳性突触。作为起点，我们采用了一种先前已发表的方案14然而，本方案中使用的FACS抗体已停产，我们增加了多项优化步骤以及一种新的小胶质细胞分离方法16因此，本文所介绍的方案值得与科学界共享，作为对已发表方案的全面更新。

为了定量分析小胶质细胞对突触的吞噬作用，我们使用了11至14周龄的雄性C57BL/6N小鼠。由于海马区具有高度的突触重塑和可塑性，因此被选为主要的研究区域12。我们分析了C57BL/6N小鼠海马区表达vGLUT1阳性的小胶质细胞百分比以及小胶质细胞特异性的vGLUT1-PE荧光强度（MFI）。每次实验均以同一只动物来源的脾脏巨噬细胞作为生物学阴性对照。我们通过实验证实，海马区小胶质细胞的vGLUT1-PE荧光信号高于同型对照组和脾脏巨噬细胞，从而验证了vGLUT1抗体的有效性（图1B-E）

此外，我们比较了小胶质细胞在小脑以及嗅球（作为突触可塑性较高的另一个参照区域）中对突触的吞噬情况20。我们发现，与海马相比，来自嗅球的小胶质细胞中vGLUT1荧光信号较强，而小脑中的信号较弱（图1F）。脾脏巨噬细胞中的信号强度最低，作为内部阴性对照（图1E）。此外，我们使用Vglut-IRES-Cre/ChR2-YFP小鼠来检测vGLUT1抗体的免疫反应性。这些小鼠的谷氨酸能神经元表达YFP，表明YFP阳性细胞群中应包含vGLUT1阳性亚群。采用该染色方案，我们检测到98.7%的YFP阳性细胞为vGLUT1阳性，验证了该抗体的有效性（补充图S3）。

总体而言，这些结果验证了vGLUT1抗体及本研究所采用染色方案的有效性。我们证明，该方案与抗体可被可靠地用于定量分析 体内与其它实验方法相比，能够以高通量且快速的方式吞噬突触。

接下来是 体外 方法，我们分离了成年小胶质细胞，并将其与来自相同动物的新鲜分离的pHrodo Red标记的突触体共孵育，以定量分析其吞噬活性 体外 吞噬作用（图 2A）。我们使用 pHrodo Red 对突触体进行标记，该染料在酸性环境 pH 条件下可自然增强荧光信号21我们 freshly 分离了突触体，并将其暴露于不同的 pH 值（pH = 4 和 pH = 11）条件下。在低 pH 条件下观察到荧光信号增强，以此作为原理验证实验的结果（图2B），我们将这些突触体与新分离的微胶质细胞共同孵育1.5–2小时。作为对照，我们将微胶质细胞与未标记的突触体共同孵育。随后，我们分析了来自CD11b的pHrodo Red-PE荧光信号++/CD45+ 小胶质细胞并观察到阳性PE荧光，其强度与pH=4时从突触体获得的荧光相当（图 2C因此，该方法可实现对目标物的快速、高通量分析 体外 突触体的吞噬作用，并可经必要的优化步骤后拓展应用于淀粉样斑块或其他潜在靶标的吞噬作用研究。事实上，Rangaraju 等人采用类似的基于流式细胞术的方法，对小胶质细胞吞噬淀粉样蛋白 β 进行了定量分析。22总之，这两种方法均可对小胶质细胞吞噬突触的过程进行可靠、高效且高通量的定量分析 体内* 和 体外.

海马体分析、流式细胞术、vGLUT1表达、组织制备示意图、实验结果。
图1：小胶质细胞在体内吞噬vGLUT1+突触的分析。（A）实验流程的示意图，展示细胞内vGLUT1染色的步骤。（B）定义来自海马体的单细胞/CD11b++/CD45+/活细胞群体的设门策略。该细胞群用于分析vGLUT1-MFI以及量化海马体中vGLUT1+小胶质细胞的比例。红色矩形所示门控表示总样本中vGLUT1+细胞所占部分。（C）直方图显示vGLUT1-PE荧光强度。（D）红色矩形所示门控表示脾脏巨噬细胞中无显示同型对照-PE免疫反应性的阳性细胞部分。直方图显示同型对照-PE荧光强度。（E）红色矩形所示门控表示脾脏巨噬细胞中无显示vGLUT1-PE免疫反应性的阳性细胞部分。直方图显示vGLUT1-PE荧光强度。直方图上的门控起始于脾脏vGLUT1-MFI终止的水平（~104），用于分析脑组织样本中vGLUT1阳性细胞比例。（F）叠加直方图显示脾脏巨噬细胞（灰色）、海马体小胶质细胞（红色）、小脑（紫色）和嗅球（浅蓝色）的PE荧光强度比较。请点击此处查看该图的放大版本。

CD11b+ 细胞的流式细胞术检测方法。突触体分离、染色示意图及分析结果。
图2小胶质细胞吞噬突触体突触的分析 体外 (A) 体外突触体吞噬实验操作流程示意图，展示实验各步骤。B在两种不同 pH 值下孵育的突触体，在 pH = 11 时显示出较低的 pHrodo Red-PE 荧光信号，而在 pH = 4 时显示出较高的 pHrodo Red-PE 荧光信号。C单细胞/CD11b++/CD45+ 使用细胞群体分析pHrodo Red-PE的荧光强度。以未标记的突触体孵育的小胶质细胞作为阴性对照。 请点击此处以查看此图的放大版本。

表1：本实验方案中使用的缓冲液和试剂列表。 请点击此处下载该表格。

补充图 S1：新鲜分离的成年小胶质细胞的代表性图像。 采用基于木瓜蛋白酶的组织解离方案及基于 MACS 的 CD11b+ 小胶质细胞分离后，使用20倍物镜的光学显微镜获取的图像。比例尺 = 50 µm。 请点击此处下载该文件。

补充图 S2：代表性流式细胞术图示，展示用于定义脾脏巨噬细胞的设门策略。 在检测海马区小胶质细胞对突触的吞噬作用时，每次实验均以脾脏作为阴性对照。上述流式图将脾脏巨噬细胞定义为 CD11b++/CD45++/活细胞群体。该群体被用于设定阈值，以定量脑样本中高于此阈值门控的 vGLUT1+ 小胶质细胞。 请点击此处下载该文件。

补充图 S3：代表性流式细胞术图展示用于检测 vGLUT1 抗体效率的设门策略。（A）实验流程的图示，描述 vGLUT1 染色的各个步骤。使用 YFP+ 谷氨酸能神经元来检测 vGLUT1 抗体的免疫反应性。（B）设门策略用于定义来自 Vglut-IRES-Cre//ChR2-YFP 小鼠海马中的 YFP+ 细胞群，该细胞群作为检测 vGLUT1 流式抗体效率的阳性对照。对 YFP+ 细胞群设门以确定谷氨酸能突触。在此细胞群中，分析 vGLUT1 抗体的免疫反应性以评估其特异性。与（C）同型对照相比，（D）97.9% 的 YFP 阳性细胞被检测为 vGLUT1 阳性。（E）重叠直方图显示同型对照与 vGLUT1 抗体之间 PE 荧光信号的比较。请点击此处下载该文件。

讨论

通过小胶质细胞与突触的相互作用实现突触精细化，是神经免疫学领域中一个引人关注的研究方向，为揭示小胶质细胞在神经退行性疾病和神经发育障碍中的作用提供了有前景的见解。2011年，Paolicelli 等人提供了小胶质细胞内存在突触物质的证据，阐明了其在突触吞噬过程中的参与作用4另一项引人入胜的研究采用了延时成像和一种 离体 脑切片器官型培养模型，并报道小胶质细胞会进行一种称为胞啃作用（trogocytosis）的吞噬过程，即它们吞噬突触前结构，而非完整的突触结构23最近一项使用新型转基因小鼠模型的研究能够对完整组织中的吞噬作用进行测量，结果显示伯格曼胶质细胞介导了突触修剪 体内 在运动学习后24因此，已有充分证据表明胶质细胞（包括小胶质细胞）参与突触吞噬过程。然而，小胶质细胞这一功能对突触修剪的动态性和选择性过程的影响程度，仍需进一步证据加以阐明。

尽管如此，小胶质细胞吞噬突触的定量分析仍是一个有价值的指标，可部分揭示小胶质细胞与突触相互作用的复杂动态过程，尤其是突触精细化过程。已有综述总结了目前用于研究小胶质细胞吞噬突触的各种实验方案25。需要强调的是，我们的实验方案是在现有并已广泛应用的方案基础上进行优化而得。本研究中所呈现的方法可在不同分离的脑区中实现快速、高通量的小胶质细胞吞噬突触的定量分析。根据脑区的不同，两种方法均可在最多两天内分析至少10,000个小胶质细胞，因此非常适合并行测试多种小鼠模型。

我们承认vGLUT1的定量分析+ 小胶质细胞包括两者 体内 短期 离体 吞噬过程直至固定步骤。因此，我们建议本实验方法可作为一种快速且可靠的方式，用于在后续分析之前定量小胶质细胞内突触物质的含量 体内 使用如免疫组化（IHC）等方法进行验证。

流式细胞术分析的另一个缺点是可用于突触标志物的抗体种类有限，尤其是针对抑制性突触的抗体。目前很难找到商业化的、直接偶联且对这些标志物产生强信号的抗体。由于针对突触标志物的不同抗体需要耗费大量时间进行优化测试，因此与科学界共享经过充分优化的细胞内染色实验方案显得尤为重要，本文研究中即提供了此类方案。

关于本研究中的数据分析，我们使用同型对照作为技术性阴性对照，以校正vGLUT1抗体的非特异性结合，因为它们可在优化基于流式细胞术的检测时，提供样本中抗体非特异性结合的估计值26。然而，同型对照主要针对表面染色步骤的非特异性背景信号进行了优化，对于胞内染色对照而言并非最佳选择27,28。因此，在进行涉及固定和透化步骤的胞内染色时，不应依赖同型对照来区分阴性和阳性细胞群，因为这些步骤可能影响抗原检测、自发荧光以及荧光染料的亮度29。此类胞内染色实验需要使用适当的生物学内部对照，以确定针对胞内标志物染色的阳性细胞群29。因此，考虑到我们采用的是胞内染色方案，我们使用了内部生物学阴性对照（脾脏巨噬细胞），并根据来自同一批小鼠的脾脏巨噬细胞来界定阳性与阴性细胞群的分界。我们将门控上方、且在作为生物学阴性对照的脾脏巨噬细胞中无vGLUT1阳性事件的区域定义为阳性细胞群（图1）。

本研究中介绍的两种方法均能在短时间内以高通量方式对小胶质细胞吞噬突触的现象进行初步分析，可分析来自小脑区的超过10,000个细胞，而这是传统显微镜技术无法实现的。因此，这些方法相较于耗时耗力的传统方法具有显著优势，并且通过分析更大量的小胶质细胞，能够对突触吞噬现象提供更为全面的评估。此外， 体外 本研究中提出的方法特别适用于检测不同处理对小胶质细胞吞噬突触影响的作用。该方法能够在排除其他细胞类型干扰因素的情况下，直接量化处理对小胶质细胞的影响。此外，该方法还可作为间接手段，用于验证微环境或其他细胞类型对突触吞噬过程可能产生的作用。因此，我们得出结论：这些方法尤其是并行使用时，为分析小胶质细胞对突触物质的吞噬提供了直观且具有优势的替代方案。

然而，通过基于FACS的吞噬功能检测对新鲜分离的小胶质细胞进行分析 离体 可能存在一些缺点。首先，必须采用经过良好优化的实验方案，以从成年大脑中分离出新鲜的微胶质细胞，同时避免 离体 小胶质细胞的活化与应激反应。Dissing-Olesen 等人通过在 37 ℃ 下采用组织解离程序，并结合转录和翻译抑制剂的使用，以解决这一问题。 oC30Mattei 等人则提出了一种冷机械组织解离方案，以避免诱导应激相关基因在体外的表达16 并在第一部分中调整了该方案以避免 离体 在进行细胞内vGLUT1染色之前激活与应激相关的小胶质细胞反应。在第二部分中，我们在 体外 基于木瓜蛋白酶组织解离后小胶质细胞得率较高（数据未显示），采用突触体吞噬实验。小胶质细胞在37℃下不可避免地保持 o在与突触体共同孵育的培养条件下于37℃孵育时 oC 确实可以诱导小胶质细胞发生改变，这是所有方法的常见缺点 体外 检测和细胞培养操作。因此，我们建议同时采用文中提供的两种方案，以更全面地得出关于小胶质细胞吞噬突触的结论。

此外，在定义设门策略以选择 CD11b++/CD45+ 小胶质细胞时，必须谨慎考虑脑实质中其他也表达这些标志物的免疫细胞的存在31。更重要的是，在选择特异性标记小胶质细胞的分子（如 TMEM119、P2RY12）时，必须注意到这些标志物在病理和炎症条件下其表达水平可能发生改变32，在建立用于定量小胶质细胞吞噬突触的流式细胞术检测 panel 之前，应充分考虑这些变化。最后，必须强调的是，前文讨论的任何一种方法，包括基于免疫组织化学和显微镜的 体内 方法，均无法单独捕捉小胶质细胞对突触的主动且选择性修剪过程。这些方法无法区分小胶质细胞的主动修剪行为与对脑实质内突触碎片的被动清除作用。因此，在评估和讨论数据时，必须明确区分这些不同的概念。

披露

作者声明无竞争利益。

致谢

感谢Regina Piske在小胶质细胞分离方面的技术支持，感谢Caio Andreta Figueiredo博士在补充图S1显微图像采集方面的帮助。感谢MDC流式细胞分选（FACS）平台提供的技术协助。本手稿部分展示了2024年提交至《脑、行为与免疫》期刊的代表性图像。图1A、图2A及补充图S3A使用BioRender.com绘制。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 玻璃匀浆器Active Motif货号 40401
5 mL 离心管Eppendorf货号# 0030119452
抗CD11b赛默飞世尔科技货号 25-0112-82
抗CD45BD货号# 559864
抗Ly6CBD货号 553104
抗Ly6GBD货号# 551460
BCA 蛋白检测试剂盒皮尔斯货号 23227
C-TubesMiltenyi Biotech货号# 130-096-334
CD11b 微珠Miltenyi Biotech货号 130-093-634
CD16/CD32 抗体赛默飞世尔科技货号#14-0161-82
Cytofix/Cytoperm 试剂盒BD货号# 554714
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）Gibco货号 41966029
杜尔贝科´磷酸盐缓冲液  （DPBS）Gibco货号 14190144
Falcon 圆底聚苯乙烯试管 赛默飞世尔科技货号# 08-771-23
可固定的活力染料赛默飞世尔科技货号 L34969
Hibernate A 培养基赛默飞世尔科技货号 A1247501
LS-柱Miltenyi Biotech货号 130-042-401
木瓜蛋白酶解离系统沃辛顿货号 LK003150
PercollTh.Geyer货号 17-0891-02
培养皿赛默飞世尔科技货号 11339283
pHrodoRed赛默飞世尔科技货号 P36600
蛋白酶抑制剂罗氏货号# 5892970001
红细胞裂解缓冲液Sigma 货号 11814389001
Steritop E-GP 无菌过滤系统默克货号# SEGPT0038
SynPer 溶液赛默飞世尔科技货号 87793
vGLUT1 抗体Miltenyi Biotech货号 130-120-764

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突触体吞噬VGLUT1染色磁珠细胞分选Percoll梯度CD11b小胶质细胞pHrodo Red突触体神经免疫相互作用
利用流式细胞术定量小胶质细胞对突触物质的吞噬作用
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