脂质过氧化氢含量是衡量铁死亡最常见的指标。本文展示了在诱导铁死亡后，通过流式细胞术逐步分析细胞内脂质过氧化氢含量的操作流程。
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本文内容
摘要
摘要
铁与氧的相互作用是地球生命演化过程中的一个基本组成部分。然而，这种独特的化学反应至今仍令人着迷并带来诸多谜题，推动着新的生物学探索。2012年，哥伦比亚大学的一个研究团队认识到这一相互作用是导致一种新型调控性细胞死亡的关键事件，并将其命名为"铁死亡（ferroptosis）"。铁死亡的主要特征是脂质氢过氧化物的累积，其原因包括：(1) 抗氧化防御系统功能障碍和/或 (2) 过度的氧化应激，后者通常伴随着细胞内游离可溶性铁含量的升高。这一过程通常由经典的抗铁死亡通路加以抑制，该通路包括胱氨酸转运体xCT、谷胱甘肽（GSH）以及谷胱甘肽过氧化物酶4（GPx4）。由于铁死亡并非程序性细胞死亡类型，因此不涉及凋亡所特有的信号通路。验证此类细胞死亡最常用的方法是使用亲脂性抗氧化剂（如维生素E、ferrostatin-1等）进行抑制。这些分子能够进入细胞膜并清除其中的氧化损伤。揭示铁死亡表型的另一个重要方面是检测脂质氢过氧化物的前期累积，为此可使用特异性染料BODIPY C11。本文将展示如何通过不同诱导剂——erastin、RSL3和铁供体——在野生型髓母细胞瘤细胞中诱导铁死亡。同样，将在含有NAC条件下生长的xCT基因敲除（xCT-KO）细胞中进行实验，当去除NAC后，这些细胞会发生铁死亡。在铁死亡触发后12–16小时内，可在光学显微镜下观察到典型的"起泡"表型。此外，将采用BODIPY C11染色结合流式细胞术（FACS）分析，以显示脂质氢过氧化物的累积，并利用碘化丙啶（PI）染色法检测随之发生的细胞死亡。为证实细胞死亡的铁死亡性质，将使用ferrostatin-1作为特异性的铁死亡抑制剂进行验证。
引言
铁死亡是一种新近被定义的、依赖活性氧（ROS）的细胞死亡类型1。除了ROS之外，铁在此类细胞死亡中也发挥着关键作用，因此得名2。铁死亡的最终执行步骤是由铁催化的质膜脂质氧化损伤的累积，最终导致膜完整性与选择性通透性受损，并通过出泡方式引发细胞死亡。脂质过氧化物的生成是一种自然发生的现象；然而，其在细胞膜中的传播通常被细胞的抗氧化防御系统所抑制。在这一过程中起主要作用的是含硒蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4（GPx4），它能够靠近膜结构并将脂质氢过氧化物转化为毒性较低的醇类衍生物3。GPx4所需的还原力主要（但不仅限于）由谷胱甘肽（GSH）提供，GSH是由三种非必需氨基酸——甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸组成的三肽。半胱氨酸是GSH生物合成的限速氨基酸4。尽管半胱氨酸被归类为非必需氨基酸，但在高度增殖的细胞（如癌细胞）中，其需求量往往超过细胞内源性合成能力，因此已被重新归类为条件必需氨基酸。细胞摄取半胱氨酸主要通过Xc-系统完成，该系统以胞内谷氨酸外排为代价，实现氧化态（主要存在形式）半胱氨酸（即胱氨酸）的摄入5。Xc-系统由一个不依赖Na+、依赖Cl-的转运亚基xCT和一个伴侣亚基CD98组成。直到最近，xCT-GSH-GPx4轴的抗铁死亡功能一直被认为具有独特性和不可替代性
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方案
本研究采用DAOY野生型（WT）髓母细胞瘤细胞系进行，细胞在37 °C、5% CO₂条件下培养2 在添加了8% FBS的DMEM培养基中培养。xCT基因敲除细胞系在相同条件下维持培养，实验所用培养基中额外添加1 mM N-乙酰半胱氨酸（NAC）。细胞定期使用 commercially available Mycoplasma Detection Kit（见 材料表）并培养至第10代th 传代
1. 细胞的收获与接种
注意：所有步骤均在组织培养超净工作台中使用无菌无菌技术进行。DAOY 髓母细胞瘤细胞为贴壁细胞，因此可通过不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤弃去所有未贴壁细胞。
- 取含有细胞的储备培养皿（直径100 mm的培养皿），使用移液器去除培养皿中的悬浮细胞和培养基。
- 向培养皿中加入5–10 mL磷酸盐缓冲液（PBS），通过旋转培养皿清洗底部，然后使用移液器将PBS从培养皿中移除。
- 向培养皿中加入1 mL胰蛋白酶（10倍稀释），将培养皿孵育至轻敲培养皿可使细胞脱落。取10 mL添加了8%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，通过机械方式将细胞从培养皿上收集下来。
- ....
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结果
将髓母细胞瘤细胞系 DAOY 在含 8% FBS 的标准 DMEM 培养基中培养，直至细胞融合度达到约 60%。实验当天，收集细胞，并根据表 1将每孔 100,000 个细胞接种于 6 孔板中。次日，细胞（设三个重复）分别用 1 µM 的 erastin、0.3 µM 的 RSL3 或 250 µM 的 FAC 处理。随后将培养板置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中。处理 6 小时后，在显微镜下观察细胞，检测出现气泡的细胞（如图 1中箭头所示）。该现象表明药物在细胞进行脂质氢过氧化物染色及后续流式细胞术分析前，已有效诱导了铁死亡。
为了检测脂质氢过氧化物含量，使用特异性染料 BODIPY 581/591 C11 在终浓度为 2 µM 的条件下染色 30 分钟。由于该染料对氧化还原状态敏感，因此必须去除细胞中的任何处理试剂，并用预热的 PBS 洗涤细胞。染色半小时后，细胞用 PBS 洗涤两次，随后使用细胞解离液将细胞脱离，并准备进行流式细胞术（FACS）分析。此步.......
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讨论
铁死亡（ferroptosis）的主要特征是细胞质膜中脂质氢过氧化物不受控制地累积。这种氧化损伤可能以酶促或非酶促的方式发生，但无论哪种情况，该反应都依赖于铁或由铁催化，这也是这种细胞死亡类型名称的由来。脂质氢过氧化作用通常通过检测其降解产物（如4-羟基-2,3-反式壬烯醛（4-HNE）或丙二醛（MDA））进行间接评估。这些产物由多不饱和脂肪酸的过氧化分解产生，可与多种大分子发生反应，导致多种病理状态，例如神经退行性疾病、糖尿病和慢性心力衰竭等。然而，这些仅仅是脂质过氧化事件的后果，目前已有大量研究致力于开发特异性针对脂质氢过氧化物的优良探针。
一种常用的探针是BODIPY 581/591 C11，但它也存在一些缺点，需加以考虑。具体而言，BODIPY 591/581的荧光颜色具有两个发射峰，分别对应其还原态（590 nm）和氧化态（510 nm）。若目标是实现精确定量，则这两个波长处荧光强度的比值尤为重要。然而，在已有文献中，BODIPY 591/581单发射荧光强度的测量已被广泛采用1,
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披露
我们声明，本研究不存在利益冲突。
致谢
本工作得到了摩纳哥公国政府、“摩纳哥企业抗癌联盟”（GEMLUC）以及弗拉维安基金会的支持，后者为购买BD FACS Melody提供了资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BODIPY 581/591 C11 | Thermo Fisher | D3861 | |
| 细胞计数仪 | Beckman | Coulter Z1 | |
| DMEM 培养基 | Gibco | 10569010 | |
| Erastin | Sigma-Aldrich | E7781-5MG | |
| 柠檬酸铁铵 | Acros Organics | 211842500 | |
| 铁死亡抑制剂-1 | Sigma-Aldrich | SML0583-25MG | |
| 胎牛血清 (FBS) | Dominique Dutcher | 500105N1N | |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences | FACS Melody | |
| Gibco StemPro Accutase 细胞解离试剂 | Thermo Fisher | 11599686 | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| PlasmoTest 支原体检测试剂盒 | InvivoGen | rep-pt1 | |
| 碘化丙啶 | Invitrogen | P3566 | |
| RSL3 | Sigma-Aldrich | SML2234-25MG | |
| 胰蛋白酶 - EDTA 10X - 100 mL | Dominique Dutcher | X0930-100 |
参考文献
- Dixon, S. J., et al. Ferroptosis: An iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 149, 1060-1072 (2012).
- Yang, W. S., Stockwell, B. R. Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-depende....
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