揭示髓母细胞瘤的铁死亡表型

铁死亡是一种新环境化的活性氧 （ROS） 依赖性细胞死亡类型¹。除了 ROS，铁在这种类型的细胞死亡中起着至关重要的作用，因此得名²。铁死亡的最后也是执行步骤是铁催化脂质氧化损伤在质膜中的积累，最终导致细胞完整性和选择性通透性受损，最后导致细胞因冒泡而死亡。脂质加氢过氧化事件是一种自然发生的现象;然而，细胞的抗氧化防御阻止了它在整个细胞膜中的传播。在这种情况下，主要参与者是 Se 蛋白谷胱甘肽过氧化物酶 4 （GPx4），它可以接近膜并将脂质氢过氧化物转化为毒性较小的醇衍生物³。GPx4 的还原能力主要但不限于谷胱甘肽 （GSH） 提供，谷胱甘肽 （GSH） 是一种由非必需氨基酸（甘氨酸、谷氨酸和半氨酸）组成的三肽。GSH 生物合成的限速氨基酸是半胱氨酸⁴。虽然半胱氨酸被归类为非必需氨基酸，但它的需求很容易超过其在高度增殖细胞（如癌细胞）中的内部产生。因此，它被重新归类为半必需氨基酸组。半胱氨酸的必要输入主要通过 Xc- 系统进行，它允许以牺牲谷氨酸输出为代价输入氧化（显性）形式的半胱氨酸（又名胱氨酸）⁵。Xc- 系统由一个 Na+ 非依赖性、Cl 依赖性转运亚基（称为 xCT）和一个伴侣亚基（称为 CD98）组成。直到最近，xCT-GSH-GPx4 轴的抗铁死亡特性一直被视为独特且不可复制的⁶。然而，在 2019 年，已经描述了一种由泛醇（辅酶 Q10）及其再生酶 - 铁死亡抑制蛋白 1 （FSP1） 组成的替代抗铁死亡途径 ^7,8。不久之后，又报道了另一种涉及 GTP 环水解酶-1/四氢生物蝶呤 （GCH1/BH4） 的脂质氢过氧化物解毒系统⁹。尽管如此，xCT-GSH-GPx4 轴在预防铁死亡中的核心作用似乎没有受到挑战。

在过去的十年中，铁死亡已在多种肿瘤类型中得到广泛研究，显示出作为抗癌策略的巨大潜力（由 Lei 等人综述¹⁰）。此外，据报道，对常规化疗药物表现出高度耐药性和/或转移倾向的癌细胞对铁死亡诱导剂（例如 GPx4 抑制剂）非常敏感 11,12,13。然而，在脑肿瘤的情况下，铁死亡诱导剂的潜力在很大程度上仍未得到充分研究。虽然这种类型的细胞死亡与脑缺血再灌注损伤¹⁴和神经退行性疾病¹⁵ 密切相关，但它在脑肿瘤中的潜力主要局限于胶质母细胞瘤，这是最常见的恶性颅脑肿瘤（由 Zhuo 等人综述 ¹⁶）。另一方面，髓母细胞瘤（最常见的恶性儿科脑肿瘤和儿童死亡的主要原因）对铁死亡诱导剂的敏感性在很大程度上仍未得到探索。据我们所知，很少有同行评审的文献将铁死亡和髓母细胞瘤联系起来。尽管如此，一些研究表明，铁在髓母细胞瘤和胶质母细胞瘤癌症干细胞 （CSC） 的存活、增殖和致瘤潜力中起着至关重要的作用^17,18，可能使它们更容易受到铁死亡诱导的影响。这一点尤其重要，因为髓母细胞瘤因其 CSC 或肿瘤起始/增殖细胞亚群而臭名昭著，这似乎是导致肿瘤化疗耐药、播散和复发的主要原因¹⁹。

通常通过测量脂质氢过氧化物含量/积累来研究对铁死亡诱导的敏感性，这可能导致也可能不会导致细胞死亡。最常用的铁死亡诱导剂是 （1） erastin，xCT 转运蛋白²⁰ 的抑制剂，（2） RSL3，GPx4 酶² 的抑制剂，和/或 （3） 铁供体，如柠檬酸铁铵 （FAC）²¹。使用选择性探针 BODIPY 581/591 C11²² 评估脂质氢过氧化物含量，其在还原态下在 581/591 nm 处具有最大激发和发射波长。在与脂质氢过氧化物相互作用并被脂质氢过氧化物氧化时，探针将其激发和发射最大值移至 488/510 nm。通常，脂质氢过氧化物含量的显著增加在铁死亡细胞死亡之前。由于铁死亡不是程序性细胞死亡，因此没有分子信号级联导致其执行。因此，确认它的唯一方法是监测脂质氢过氧化物含量并使用针对此类细胞死亡的特异性抑制剂，例如铁司他汀 1²³。Ferrostatin 1 是一种亲脂性抗氧化剂，可以穿透细胞的脂质区室并解毒脂质氢过氧化物，从而防止铁死亡事件。

本研究使用 DAOY 野生型 （WT） 髓母细胞瘤细胞系进行，这些细胞系在 37 °C 和 5% CO₂ 中在补充有 8% FBS 的 DMEM 培养基中培养。在相同条件下维持 xCT 缺失的细胞系，在补充有 1 mM N-乙酰半胱氨酸 （NAC） 的培养基中进行实验。使用市售的支原体检测试剂盒（参见 材料表）定期筛选细胞的支原体，并培养至^第 10 代。

1. 收获和接种细胞

注:所有步骤均在组织培养层流罩中使用无菌技术进行。DAOY 髓母细胞瘤细胞是粘附的，这意味着所有未附着的细胞都可以通过用不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤来丢弃。

1. 取带有细胞的汤皿（培养皿，直径 100 mm），并使用抽吸器从板中取出漂浮的细胞和培养基。
2. 向培养皿中加入 5-10 mL PBS，用培养皿打圈清洗底部，然后使用抽吸器从板中取出 PBS。
3. 向培养皿中加入 1 mL 胰蛋白酶（10 倍稀释）。孵育板，直到轻轻敲击板使细胞脱落。取 10 mL 补充有 8% FBS 的 DMEM 培养基，并从培养皿中机械收获细胞。
4. 将细胞悬液转移到 15 mL 试管中。
5. 取 500 μL 细胞悬液，放入比色皿中进行计数。计算每 mL 细胞悬液的细胞数。本研究使用自动细胞计数仪（参见 材料表）。
6. 计算从细胞悬液中取出 1,00,000 个细胞所需的体积。
7. 取 6 孔板，将计算体积的细胞悬液加入每个孔中，然后在每个孔中加入补充有 8% FBS 的 DMEM 培养基至 2 mL。

2. 细胞的处理

注意:控制和处理一式三份进行。组如下:对照 （DMSO），1 μM erastin，0.3 μM RSL3,250 μM FAC，2 μM Ferrostatin 1,1 μM erastin + 2 μM Ferrostatin 1,0.3 μM RSL3 + 2 μM Ferrostatin 1,250 μM FAC + 2 μM Ferrostatin 1。实验需要四个 6 孔板，如 表 1 所示）。材料 表中列出了所有必需试剂的商业细节。

1. 接种后 24 小时，将相应的处理剂添加到含有细胞的孔中。
2. 将培养皿置于 37 °C 和 5% CO₂ 的培养箱中。

3. 用 BODIPY 581/591 C11 探针对处理过的细胞进行脂质氢过氧化物染色

注:脂质氢过氧化物特异性探针的储备液在 DMSO 中制备浓度为 1 mM。将储备溶液的等分试样在-20°C下储存在不透明的试管中。对于染色，在补充有 8% FBS 的 DMEM 培养基中制备 2 μM 探针工作溶液。

1. 处理后 6 小时，在光学显微镜下观察细胞（细胞圆角应该是可见的）。
2. 从培养箱中取出培养皿，并将它们放入组织培养层流罩中。
   使用抽吸器去除培养基和漂浮（死）细胞。
3. 向每个孔中轻轻加入 2 mL PBS，用 6 孔板的圆周运动清洗底部，然后使用抽吸器从孔中取出 PBS。
4. 加入 2 mL 探针的工作溶液（补充有 FBS 的 DMEM 中 2 μM 终浓度）。
5. 将培养皿放在37°C和5%CO₂ 的培养箱中，在黑暗中放置30分钟（板可以用铝箔包裹）。

4. 流式细胞术分析处理细胞中脂质氢过氧化物含量

注意:以下所有步骤均在黑暗中执行（层流罩中没有灯光）。

1. 将培养皿从培养箱中取出，放入组织培养层流罩中。
   使用抽吸器去除染色液。
2. 向每个孔中轻轻加入 2 mL PBS，用 6 孔板的圆周运动清洗底部，然后使用抽吸器从孔中取出 PBS。
3. 再次重复洗涤步骤，并使用吸气器从孔中吸出任何剩余的 PBS。
4. 在每个孔的底部加入 150 μL 市售的细胞解离试剂（参见 材料表），然后孵育板，直到轻轻敲击板使细胞脱落。取 250 μL FACS 缓冲液（PBS、2 mM EDTA、0.5% BSA）并从孔中机械收获细胞。
5. 将细胞转移到带有过滤器盖的相应（先前标记的）FACS 管中。将装有细胞的试管置于黑暗中的冰上，直至进行分析（分析应在染色后一小时内进行）。
   注意:FACS 机器的设置和校准取决于所使用的机器（参见 材料表）。
6. 创建一个新实验并为其命名（DAOY 中的铁死亡 - 脂质氢过氧化物）。
7. 在实验设计中，选择激光器 （488 nm） 和滤光片 （FITC）。
8. 在 查看数据中，选择合适的 细胞大小 （>12 μm），设置 PMT 电压 （细胞群应出现在 SSC-H/FSC-H 点图的第一象限），然后对点图进行选通。
9. 添加新图 - 直方图，y 轴上有 FITC-A 和对数刻度。
10. 涡旋 FACS 管中的样品，将它们放入 FACS 机器中并加载样品。记录 10,000 个 FSC 单重态事件并命名文件（例如，DAOY WT CTL 6h）。将文件导出为 .fcs。

5. 处理后死细胞的碘化丙啶 （PI） 染色

注:实验设计与脂质过氧化氢测量完全相同（参见步骤 1 和步骤 2）。

1. 播种后 24 小时，将培养皿从培养箱中取出，放入层流罩中。
2. 将培养基（含死细胞）收集在 15 mL 试管中。
3. 向每个孔中加入 1 mL PBS，用 6 孔板的圆周运动清洗底部，然后将 PBS 与相应的培养基一起收集到试管中。
4. 在每个孔的底部加入 200 μL 胰蛋白酶（10 倍稀释），然后孵育板，直到轻轻敲击板使细胞脱落。使用相应的培养基 + PBS 从孔中收获细胞。
5. 在室温下以 180 x g 离心细胞悬液 10 分钟。使用抽吸器去除上清液。
6. 将细胞沉淀重悬于 300 μL FACS 缓冲液中，并将其置于冰上直至分析。
7. 在分析之前，添加 PI 溶液（参见 材料表）至终浓度为 2 μg/mL。

6. 处理后 24 小时死细胞的流式细胞术分析

注意:FACS 机器设置和校准如前所述完成（参见步骤 4）。

1. 创建一个新实验并为其命名（DAOY 中的铁死亡 - 细胞死亡）。
2. 在实验设计中，选择激光器 （488 nm） 和滤光片 （PE）。
3. 在 视图数据中，选择合适的 细胞大小 （>12 μm），设置 PMT 电压 （细胞群应出现在 SSC-H/FSC-H 点图的第一象限），然后对点图进行选通。
4. 添加新图 - 直方图，PE-A 位于 y 轴和对数刻度上。
5. 涡旋 FACS 管中的样品，将它们放入 FACS 机器中并加载样品。
6. 记录 10,000 个 FSC 单重态事件并命名文件（例如，DAOY WT CTL 6h）。将文件导出为 .fcs。

7. DAOY xCT-/- 细胞中脂质氢过氧化物含量的流式细胞术分析

注意:xCT^-/- 细胞已如前所述生成²⁴.

1. 对于该实验，按照步骤 2 中的指示接种细胞，但不是处理，而是用 1 mM NAC 补充培养基过夜。
2. 第二天，将 NAC 维持在一组中，并将其从另一组中移除。
3. 按照步骤 6 中描述的完全相同的方式对脂质氢过氧化物含量进行流式细胞术分析。

8. 流式细胞仪结果分析

1. 在 FlowJo 软件中打开 .fcs 文档（参见 材料表）。
2. 双击 单个文件 以打开单个样品中记录的所有事件（不仅仅是 FCS 单峰）（SSC-A/FSC-A 点图）。由于设置是这样的，即不保留机器上完成的门控，因此有必要再次进行门控并命名种群（例如，DAOY WT）。
3. 双击 门控群体 以打开另一个包含直方图的窗口。
4. 将 Y 轴更改为使用的荧光滤光片 （Comp-FITC/PE-A）。
5. 将 X 轴更改为 模态 （将每个峰归一化为其模式，即特定 bin 中找到的最大单元格数的百分比）。
6. 将直方图复制到布局编辑器中。对所有样本重复此操作，每次在布局编辑器中粘贴新的直方图时，将其拖动到前一个直方图上，以便直方图叠加（半偏移）。

将髓母细胞瘤细胞系 DAOY 在补充有 8% FBS 的标准 DMEM 培养基中培养，直至达到约 60% 汇合。根据 表 1，在实验当天，收获细胞，每孔 1,00,000 个细胞接种在 6 孔板中。第二天，用 1 μM erastin、0.3 μM RSL3 或 250 μM FAC 处理细胞（一式三份）。然后将板置于 37 °C 和 5% CO2 的培养箱中。6 小时后，在显微镜下观察细胞以检测冒泡细胞，如图 1 中的箭头所示。这作为一个指标，表明在准备用于脂质氢过氧化物染色和随后的 FACS 分析的细胞之前，该药物可有效诱导铁死亡。

为了检测脂质过氧化氢含量，使用终浓度为 2 μM 的特异性染料 BODIPY 581/591 C11 30 分钟。由于这种染料对氧化还原敏感，因此有必要从细胞中去除任何处理并用预热的 PBS 洗涤它们。染色半小时后，用 PBS 洗涤细胞两次，使用细胞分离溶液分离，并制备用于 FACS 分析。在此步骤中获得的数据显示，用所有三种药物处理的样品中染料的绿色荧光增加（图 2）。然而，使用 0.3 μM 的 RSL3 观察到最有效的效果（图 2B），而 1 μM 的 erastin （图 2A）和 250 μM 的 FAC（图 2C）在处理 6 小时后显示出稍小的效果。

为了确定检测到的脂质氢过氧化物积累导致细胞死亡，特别是铁死亡，应用 表 1 中概述的相同处理 24 小时。为了通过流式细胞术分析死细胞，收获细胞和上清液。通过离心沉淀活细胞和死细胞，然后重悬于 FACS 缓冲液中用于后续流式细胞术分析。 图 3 中提供的数据表明，所有三种处理都诱导了大量细胞死亡，使用铁死亡特异性抑制剂 ferrostatin-1 完全阻止了这种情况。这显然支持髓母细胞瘤细胞在 xCT 抑制、GPx4 抑制或铁过载后发生铁死亡。

鉴于这三种药物对脂质氢过氧化物积累的影响略有不同，可能是由于效力的差异，因此采用了遗传方法来研究铁死亡诱导剂的全部效力。先前获得的 DAOY xCT - /- 细胞（补充图 1A）在与其 WT 对应物相同的培养基中培养，但补充了 NAC。这种阳性选择使 xCT-/- 细胞能够在培养物中生长。然而，从培养基中去除 NAC 6 小时后，细胞开始积累脂质氢过氧化物，其水平与用 RSL3 处理的 WT 细胞相同（图 4）。与药理学抑制类似，从培养基中去除 NAC 诱导 6 小时后 xCT - / - 细胞的特征性冒泡（补充图 1B）。

图 1:髓母细胞瘤细胞的铁死亡表型。 在存在或不存在 2 μM 铁死亡抑制剂 Ferrostatin-1 （Ferro-1） 的情况下，用 1 μM erastin （ERA）、0.3 μM RSL3 或 250 μM 柠檬酸铁铵 （FAC） 处理（或不处理）6 小时的 DAOY WT 细胞的代表性显微照片。白色箭头表示圆形的"冒泡"细胞，表示在光学显微镜下可见的铁死亡表型。放大倍率:20 倍，插入物:40 倍。比例尺:50 μm，插图:10 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

图 2:脂质氢过氧化物是髓母细胞瘤细胞中铁死亡的关键标志物。 在存在或不存在 2 μM 铁死亡抑制剂 Ferrostatin-1 （Ferro-1） 的情况下，用 （A，B） 1 μM erastin （ERA）、（C，D） 0.3 μM RSL3 或 （E，F） 250 μM 柠檬酸铁铵 （FAC） 处理 6 小时的细胞中通过流式细胞术进行脂质氢过氧化物染色的代表性数据。（A、C、E）记录事件的点图;（早、晚、女）脂质氢过氧化物含量的直方图表示。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:通过药理学方法诱导铁细胞死亡。 用 1 μM erastin （ERA）、0.3 μM RSL3 或 250 μM 柠檬酸铁铵 （FAC） 处理 6 小时后，在存在或不存在 2 μM 铁死亡抑制剂 Ferrostatin-1 （Ferro-1） 的情况下，碘化丙啶染色细胞的代表性点图。设门可分离细胞的活 （Q4） 和死细胞群 （Q3）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:通过遗传方法诱导铁死亡。 在存在或不存在 2 μM 铁死亡抑制剂 Ferrostatin-1 （Ferro-1） 的情况下，6 小时后，通过流式细胞术在 DAOY WT 和 xCT-/- 细胞中进行脂质氢过氧化物染色的代表性数据。左侧是脂质氢过氧化物含量的直方图表示。右侧是记录事件的点图。 请单击此处查看此图的较大版本。

表 1:对照细胞和实验细胞的处理细节。

补充图 1:DAOY xCT-/- 细胞的铁死亡细胞。 （A） 补充或未补充 2 μM Ferrostatin-1 的 DMEM 培养基中 DAOY WT 和 xCT-/- 细胞中 xCT 水平的蛋白质印迹分析。（B） 存在（左）和不存在（右）1mM N-乙酰半胱氨酸 6 小时的 DAOY xCT-/- 细胞的代表性显微照片。白色箭头表示圆形的"冒泡"细胞，表示在光学显微镜下可见的铁死亡表型。放大倍率:40 倍。比例尺:10 μm。 请单击此处下载此文件。

我们声明此处提供的研究没有利益冲突。