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保存用于比较人类解剖学研究的猪生物模型

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DOI：

10.3791/66646

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2025年5月30日

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1Departamento de Ciencias Básicas Médicas, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Icesi, 2Departamento de Salud Pública y Medicina Comunitaria, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Icesi, 3Translational Research Laboratory in Critical Care Medicine (TransLab-CCM), Universidad Icesi

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于保存猪生物模型的方案。该方法采用改良的智利溶液，其中甲醛浓度有所降低。保存过程包括通过灌注和浸泡方式将溶液施加于标本，随后使用甘油进行脱甲醛处理和组织软化。

摘要

在医学教育中，人体解剖学的教学面临诸多挑战，亟需为学生提供有效的替代方法，以实践性地探索解剖结构的复杂性。由于猪的解剖结构与人类具有高度相似性，猪源性生物模型成为一种极具前景的解决方案。本文提供了一套详细的猪源性生物模型保存方案，旨在满足比较解剖学研究中对可及性强且高效方法的需求。本方案提出采用改良的智利溶液进行生物模型的保存，通过灌注和浸渍方式实施福尔马林固定。随后，使用不含甲醛的改良智利溶液进行脱福尔马林处理，再经甘油软化处理。鉴于目前关于组织保存技术的文献极为有限，且尚无标准化的操作流程或评估组织保存质量的统一测试方法，我们建议基于组织的抗阻力和弹性指标来评估其保存质量。研究结果表明，本方案所制备的标本在组织保存质量方面达到了较高的水平。此外，这些生物模型目前已成功应用于形态学研究，并用于向医学生讲授人体比较解剖学课程。

引言

医学院的解剖学教学常常面临诸多障碍，例如难以获取用于解剖的人体标本以及缺乏合适的教学设施。这些限制凸显了对有效替代方法的需求，以使学生能够以实践性和真实的方式探索解剖结构的复杂性。在此背景下，由于猪的生物模型在解剖结构上与人类具有高度相似性，已成为一种颇具前景的替代方案，为解剖学的学习与教学提供了便捷且高效的途径1。

解剖学保存技术旨在维持生物组织的完整性，同时尽量减少损伤。这些技术已广泛应用于人体和兽医解剖学的教学、学术研究和科研领域。已有多种物质被用于尽可能长期地保持尸体、器官和组织的自然状态2。然而，解剖标本的保存与维护仍然具有挑战性，特别是对于需要高组织保存质量的形态学研究标本而言尤为如此3。

尽管传统使用的溶液广泛可得，但在日常实践中其局限性显而易见。甲醛是组织保存中最常用的试剂之一，但其存在多种已记录的缺点，包括刺激性气味、高毒性、对操作人员致癌和致突变的风险，以及引起组织感官特性的改变，如组织变硬和变色。这些变化可能在固定后影响对组织生理特性的判断，从而妨碍精确和准确的形态学研究4。研究表明，使用高浓度甲醛固定会导致组织硬度显著增加5。一些替代方法，如Thiel尸体保存技术，已显示出良好效果，能更好地保持组织原有的颜色和柔韧性6。然而，该技术相比其他保存液成本更高7。这些挑战为设计和测试新型、经济实惠且仍能支持高质量解剖学教学的保存技术提供了机遇。

本方案的目的是描述哥伦比亚卡利市伊塞西大学解剖学实验室用于保存猪生物模型的方法，这些模型作为教学工具，用于人体解剖学的比较研究。

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方案

所述技术完全遵循伊塞西大学实验动物护理与使用机构伦理委员会（CIECUAE）的指导方针，并符合1989年第84号法律及校长第847号决议（2012年7月9日）的要求，确保了科学研究的完整性以及实验动物的福利，最大限度地减少了动物的痛苦。本研究使用了3月龄、体重15–20 kg的雄性长白猪。所需试剂和设备列于材料表中。

1. 猪生物模型

  1. 动物处死
    1. 进行常规兽医评估，并将选定的猪样本隔离24小时。若动物在此期间未出现任何症状，则进行安乐死。
  2. 麻醉
    1. 通过肌肉注射给予氯胺酮（Ketamine）、赛拉嗪（Xylazine）和阿托品（Atropine），剂量分别为10 mg/kg、0.5 mg/kg 和 0.04 mg/kg（遵循机构批准的方案）。
      注：确保达到深度麻醉。通过体格检查评估麻醉深度。深度麻醉的指征包括瞳孔散大且居中、眼睑反射消失、角膜反射受抑制，以及呼吸频率、心率和血压降低。
  3. 安乐死
    1. 静脉注射5 mL戊巴比妥钠/苯妥英钠（Sodium Pentobarbital/Diphenylhydantoin）（390/50 mg/mL）。给予安乐死药剂后，听诊Suis Scrofa物种的生理参数：心率（HR）60–90次/分钟；呼吸频率（FR）8–18次/分钟；体温（T°）37–39°C8。
    2. 持续监测心率，直至其逐渐下降并完全停止。观察即时变化，如括约肌松弛、黏膜发绀以及对身体刺激无反应。在连续5分钟听诊未检测到心跳后，判定安乐死已完成。
  4. 储存与运输
    1. 在安乐死后半小时内，将猪生物模型从操作室转移至解剖实验室，以防止组织分解和微生物增殖，从而优化生物模型的保存状态。

基于智利溶液的防腐溶液

  1. 改良智利溶液的配制
    1. 使用含有乙醇、甘油、甲醛、苯扎氯铵、咖啡芳香精华和蒸馏水的改良智利溶液。确保该溶液的 pH 值为 7.0。
    2. 在 50 L 的容器中配制防腐溶液。首先，向容器中加入 10.6 L 蒸馏水，然后依次加入 7.6 L 96% 乙醇、5 L 甘油、0.5 L 50% 苯扎氯铵和 0.1 L 咖啡芳香精华。
      注：配制 25 L 改良智利溶液所需各组分的浓度和体积，请参见表 1。

改良智利防腐液的使用方法

注意：防腐溶液配制完成后，需通过补充和浸渍方式施用。

  1. 通过灌注改良智利保存液进行处理
    注意：进行此操作时需穿戴生物安全防护装备，包括带有A1P2滤芯的可重复使用半面罩、生物安全护目镜、长袖一次性手术服、手术帽、腿套和丁腈手套。
    1. 手术入路
      1. 沿腹白线（使用4号手术刀柄配22号刀片）从剑突至耻骨区域做切口。
      2. 辨认皮下疏松结缔组织及腹直肌的肌纤维。
        注意：切开时应识别紧贴皮肤的少量脂肪组织，即皮下疏松结缔组织，以及位于更深层的腹直肌肌纤维9。
      3. 小心切割以进入腹膜，确保打开腹腔而不损伤肝脏和肠管，后者将立即暴露。
      4. 将肠袢向腹腔右侧牵开。辨认覆盖左肾及肾血管的壁层腹膜。利用这些血管结构定位腹主动脉。
      5. 找到左肾蒂的起始处。剥离肾动脉上方5 cm处覆盖主动脉的腹膜。
      6. 暴露左肾蒂后，游离肠袢并切开覆盖肾门的腹膜。从前向后解剖，首先辨认位置靠前且较粗大的肾静脉。
      7. 在后方定位肾动脉，并沿其走行追踪至起源于腹主动脉处。最后辨认肾盂，即肾门中最靠后的结构9。
      8. 小心解剖主动脉后部。使用0/0丝线在肾动脉水平上方及上方5 cm处各打一个结，结扎主动脉。
      9. 立即在隔离的主动脉节段两端各使用一把Kelly止血钳夹闭。
      10. 用Metzenbaum剪刀尖端切开主动脉壁，在主动脉前壁做约0.3 cm的切口，注意避免穿通血管壁。
      11. 结扎远端后，移除远端Kelly止血钳，将3.2 mm钝头L形针插入动脉腔内。随后移除近端Kelly止血钳，开始灌注改良智利保存液。
    2. 通过灌注法使用改良智利保存液处理主动脉
    3. 继续进行改良智利保存液的灌注。
      注意：使用灌注泵以10磅压力按0.25 L/kg剂量进行灌注。
    4. 灌注结束
      1. 保存液灌注完成后，拔出灌注导管，并用0/0丝线结扎穿刺部位以防止保存液反流。使用0/0丝线缝合腹白线切口以关闭腹腔。
        注意：为评估灌注是否充分，可观察饱和度的急性指标：上下肢伸展、颈胸部充血以及液体从鼻孔流出。平均灌注时间约为2小时。
  2. 浸泡法处理
    注意：进行此操作时需穿戴生物安全防护装备，包括带有A1P2滤芯的可重复使用半面罩、生物安全护目镜、长袖一次性手术服、手术帽、腿套和丁腈手套。
    1. 通过浸泡改良智利保存液进行处理
      1. 将猪标本储存在容量为300 L的储液罐中，罐内盛满步骤2中所述的相同保存液。
        注意：确保生物模型完全浸没于保存液中，约需150 L液体。浸泡后，将生物模型在20 °C条件下储存6个月。保存充分的指标包括无腐败迹象（如组织水肿、肿胀、恶臭、尸斑及组织脆裂）。

基于智利溶液的脱模溶液

  1. 脱甲醛溶液的配制
    1. 使用一种改良的智利溶液，其中包含乙醇、甘油、苯扎氯铵、咖啡芳香精华和蒸馏水。确保该溶液的 pH 值为 7.0。
  2. 在 50 L 的容器中配制脱甲醛溶液。首先加入 11.1 L 蒸馏水，然后依次加入 7.8 L 96% 乙醇、5 L 甘油、1 L 50% 苯扎氯铵和 0.1 L 咖啡芳香精华。
    注：有关配制 25 L 无甲醛改良智利溶液所需各组分的浓度和体积，请参见表 2。

5. 去除甲醛化

注意：本操作需穿戴生物安全防护服，包括带有A1P2滤芯的可重复使用半面罩、生物安全护目镜、长袖一次性手术服、手术帽、腿套和丁腈手套。

  1. 采用不含甲醛的改良智利保存液进行浸泡保存
    1. 在为期6个月的浸泡保存期结束后，将生物模型转移至一个装有不含甲醛的改良智利保存液的300 L容器中。将生物模型储存4周。
      注意：确保使用约150 L保存液完全浸没生物模型。

6. 甘油软化

  1. 脱模过程结束后，立即将生物模型浸入由水配制的、浓度递增的甘油溶液中：50%、70% 和 90% 甘油。每个浓度下均维持一周时间。

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结果

本实验方案的目的是介绍一种有效且可行的技术，用于保存猪生物模型，以服务于比较人体解剖学的教学。目前尚无标准化的方法或测试手段来评估模型的保存效果。因此，在标本完成保存处理后，通过观察保存液的充盈情况以及分解迹象等指标，对模型的整体保存效果进行评估。此外，为了客观评估这些生物模型在教学与科研中的可用性，计划在保存前后对选定解剖结构的组织特性（如抗拉强度和弹性）进行比较。所选的解剖结构包括迷走神经、主动脉和腔静脉。选择这些结构的原因在于神经、动脉和静脉在大体解剖学教学与学习中具有基础性作用。因此，从新鲜未保存的标本中分离出4条迷走神经、4条主动脉和3条腔静脉用于后续分析。

根据本方案，共保存了12具猪体标本。通过充盈度指标对保存后的猪生物模型进行保存效果评估，这些指标包括前肢伸展、血液及固定液从鼻孔流出（图1）、水肿现象，以及胸围和颈围增大（图2 和 图3），此外还包括肝脏出现灰白色斑驳样改变（

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讨论

传统上，解剖学研究依赖于人体尸体标本；然而，获取这些标本存在诸多挑战，促使人们探索替代方法。猪源性生物模型已被证明是研究人类解剖结构的有价值工具，其解剖学上的相似性有助于学习并将结果外推至人类医学应用12,13,14,15。尽管尸体保存技术传统上以定性方式描述，但通过杨氏模量测量保存组织的强度和弹性，可为组织保存程度提供定量证据。寻找生物组织保存的创新方法，旨在满足在真实模型中探索解剖复杂性的需求。因此，本文介绍在 Universidad Icesi 解剖实验室开发并使用的猪源性生物模型保存方案，作为组织保存及后续解剖学研究的一种可行替代方案。

根据经验，在猪生物模型中，通过腹主动脉建立标本灌注循环相比常用于人体尸体的股动脉插管是一种更有效的替代方法16。由于猪股动脉管壁较为脆弱，...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢伊塞西大学基础医学科学系和研究办公室对本研究提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
苯扎氯铵Protécnica IngenieríaPROQUAT BC 50/80CAS 编号. 68424-85-1
乙醇不适用不适用乙醇 96%
甲醛Albor químicos不适用甲醛
甘油不适用不适用甘油
注射泵DisánchezSpecial Injector YA-02注射泵
凯利钳不适用不适用凯利钳
梅茨鲍姆剪不适用不适用梅茨鲍姆剪
针头DisánchezL canuleL canule
手术刀不适用不适用手术刀柄 4 / 手术刀片 22
缝线 丝线不适用不适用丝线缝线 0/0

参考文献

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