检测血小板中超氧阴离子生成的替代方法

摘要

超氧阴离子的产生对于刺激血小板至关重要，如果失调，则对血栓性疾病至关重要。在这里，我们提出了三种用于选择性检测超氧阴离子和研究氧化还原依赖性血小板调节的方案。

摘要

活性氧 （ROS） 是高度不稳定的含氧分子。它们的化学不稳定性使它们具有极强的反应性，并使其能够与重要的生物分子（如蛋白质、核酸和脂质）反应。超氧阴离子是通过分子氧还原（即获得一个电子）还原产生的重要 ROS。尽管它们最初仅涉及衰老、退化和致病过程，但它们参与重要的生理反应最近变得很明显。在血管系统中，超氧阴离子已被证明可调节血管平滑肌细胞的分化和功能、血管生成中血管内皮细胞的增殖和迁移、免疫反应以及止血中血小板的激活。超氧阴离子的作用在血小板失调和与多种疾病相关的心血管并发症中尤为重要，包括癌症、感染、炎症、糖尿病和肥胖。因此，能够有效测量人血小板产生超氧阴离子，了解调节止血和血栓形成之间平衡的氧化还原依赖性机制，并最终确定调节血小板反应的新型药理学工具，从而在心血管研究中变得极其重要血栓形成和心血管并发症。本研究提出了三种成功采用的实验方案，用于检测血小板中超氧阴离子以及研究调节止血和血栓形成的氧化还原依赖性机制:1） 通过流式细胞术进行基于二氢乙锭 （DHE） 的超氧阴离子检测;2） 基于 DHE 的超氧阴离子可视化和单血小板成像分析;3） 通过电子顺磁共振 （EPR） 对血小板中超氧阴离子输出进行基于自旋探针的定量。

引言

超氧阴离子 （O₂^•-） 是血小板中产生的功能最相关的 ROS¹。O₂^•- 是分子氧还原的产物，是许多不同 ROS ² 的前体。O₂^•- 的歧化导致通过水溶液中的自发反应或超氧化物歧化酶 （SOD） 催化的反应产生过氧化氢 （H₂O₂）。尽管已经提出了不同的酶来源（例如，黄嘌呤氧化酶⁴、脂氧合酶⁵、环氧合酶^{6 和一}氧化氮合酶⁷），但线粒体呼吸 ^8,9 和烟酰胺腺嘌二核苷酸磷酸氧化酶 （NOX）¹⁰ 是真核细胞中超氧阴离子的最主要来源。血小板似乎也是如此，其中线粒体呼吸的电子泄漏^11,12 和 NOX 的酶活性^13,14 被描述为超氧阴离子输出的主要贡献者。

尽管有几项研究集中在 O₂^•- 对血小板的调节上，但关于负责的分子机制尚未达成共识。已针对不同的血小板受体提出通过直接氧化和二硫键形成来调节表面受体活性。有人提出 ROS 通过直接氧化半胱氨酸残基对整合素 αIIbβ3 进行正调节 15,16,17。同样，由于血小板对胶原蛋白的反应取决于二硫键依赖性二聚化和随之而来的糖蛋白 VI （GPVI） 二聚化¹⁸，因此有人提出了通过 ROS 依赖性氧化增强受体活性¹⁹，尽管尚未得到实验的充分证明。最后，ROS 诱导的糖蛋白 Ib 巯基 （GPIb） 氧化被证明在炎症期间促进血小板粘附和血小板-白细胞相互作用²⁰。相反，作为巯基氧化和受体激活减少的可能结果，GPVI 和 GPIb 的胞外结构域的脱落会因还原条件而减少²¹。

还提出了独立于血小板表面受体直接氧化的作用模式。ROS，包括 O₂^•-，已被证明通过减弱含有 Src 同源区 2 的蛋白酪氨酸磷酸酶 2 （SHP-2） 的活性来正向调节胶原蛋白受体 GPVI，SHP-2 负向调节该受体的信号级联²²。此外，O₂^•- 可以通过与一氧化氮 （NO） 快速反应生成 ^ONOO-（过氧亚硝酸盐），这通常通过 NO 敏感的鸟苷酸环化酶 （NO-GC） 和负血小板调节因子环状 GMP （cGMP） 的产生来抑制血小板^23,24。由此产生的 NO 水平降低可导致血小板增强。或者，NOX2 产生 O₂^•- 被认为有助于脂质过氧化和异前列腺素形成，这对血小板活化和粘附至关重要²⁵。最后，丝裂原活化蛋白激酶 （MAPK） 细胞外信号调节激酶 5 （ERK5） 是一种蛋白激酶，被提议作为血小板中的氧化还原应激传感器²⁶，被 O₂^•- 激活并在血小板中诱导促凝表型（通过基于流式细胞术的磷脂酰丝氨酸外化测量估计）²⁷。

血小板中 O₂^•- 和其他 ROS 生成的失调与过度的止血反应有关，导致与动脉粥样硬化、糖尿病、高血压、肥胖和癌症相关的血栓性心血管并发症^28,29。在这些病理环境中，血小板的 ROS 输出增加，这导致其粘附和聚集反应的增强。除了对血小板反应的影响外，血小板的自由基输出可能对其他血细胞和血管结构产生影响，这是心血管健康的一个知之甚少且研究不足的领域³⁰。尽管我们对将氧化应激与血栓形成疾病联系起来的分子机制了解有限，但抗氧化剂在预防心血管疾病方面的临床相关性受到了相当大的关注。血浆抗氧化剂水平已被证明与患心血管疾病的风险呈负相关，膳食抗氧化剂已被证明可以预防冠状动脉疾病^31,32。因此，使用膳食抗氧化剂已被倡导为预防心血管疾病的一种有前途的方法 33,34,35。在血小板中 ROS 生成的影响中，细胞凋亡的增加可产生重要的病理生理学影响^36,37。总体而言，检测和量化血小板输出 O₂^•- 的可靠方案在心血管研究中越来越重要。

目前，可用于检测 ROS 的技术在特异性（即检测到的氧化剂分子的化学性质未知）和可靠性（即与生物分子和实验试剂的不必要相互作用导致有偏差的非生理结果）方面存在重要的局限性^38,39。检测血小板中 ROS 的最常用方法是使用二氯二氢荧光素二乙酸酯 （DCFDA），其通过细胞内酯酶转化为二氯二氢荧光素 （DCFH），从而通过细胞氧化剂（包括羟基自由基和过氧化物酶-_{H 2}O₂ 中间体）转化为高荧光二氯荧光素 （DCF）^40,41.尽管它被广泛使用，但人们对这种方法测量细胞内 ROS³⁸ 的可靠性提出了严重质疑。事实上，DCFH 氧化成 DCF 可以由过渡金属离子（例如 Fe²⁺）或含血红素的酶（例如细胞色素）而不是 ROS⁴² 诱导。此外，DCFDA 被细胞过氧化物酶转化为其半醌自由基形式 （DCF^•-），进而通过与分子氧 （O₂） 反应并释放 O₂^•- 而被氧化成 DCF，这导致氧化反应的人为放大 41,43,44.因此，通过 DCFDA 检测细胞内 ROS 有助于获得初步见解，但需要谨慎考虑和广泛的实验控制^38,39。

本研究提出了检测和测量血小板功能关键调节因子 O₂^•-1 的三种替代技术。第一种技术是使用 DHE 和流式细胞术进行检测，与 DCFDA 相比，它具有可靠性和特异性的优势。这里提出的第二种技术也利用 DHE，但检测方法是活血小板荧光成像，它允许以快速动力学和单细胞分辨率研究血小板信号传导上 O₂^•- 的产生。最后，基于在 EPR 共振实验中使用羟胺自旋探针 1-羟基-3-甲氧基羰基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷 （CMH） 的方案提供了量化血小板产生 O₂^•- 的速率并在不同条件下进行比较的可能性。

方案

从同意的志愿者那里采集外周血已获得当地伦理委员会和国家卫生服务卫生研究局的批准（REC 参考:21/SC/0215;IRAS ID:283854）。

1. 方法 1:通过流式细胞术使用 DHE 检测超氧阴离子

1. 预热 （37 °C） 柠檬酸钠溶液 （4% w/v），并在静脉穿刺时以 1:7（最终 0.5% w/v）的比例将其直接添加到血液中，将其用作抗凝剂。
2. 通过肘正中静脉静脉穿刺从健康志愿者中抽取外周人血。
3. 通过初始离心步骤以 200 x g 的速度 20 分钟从全血中获得富血小板血浆 （PRP）。
4. 用可逆血小板抑制剂吲哚美辛 （10 μM） 和 PGE1 （40 ng/mL） 以 500 x g 离心 PRP 10 分钟。
5. 将所得血小板沉淀重悬于改良的 Tyrode 缓冲液（145 mM NaCl、2.9 mM KCl、10 mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸 （HEPES）、1 mM MgCl 2 、5 mM 葡萄糖，pH 7.3） （37 °C） 中，密度为 2 x 10⁸ 个血小板/mL。
6. 分离后，血小板在 37 °C 下静置 30 分钟。
7. 在二甲基亚砜 （DMSO） 中制备 5 mM 储备液的 DHA。
8. 将 DHE 添加到终浓度为 5 μM 的血小板悬液中（将储备溶液稀释 1 至 1,000，终 DMSO 浓度为 0.1% v/v），并在 37 °C 下孵育 15 分钟。
9. 用药物和/或 ROS 清除剂处理血小板 15 分钟，然后用所需的生理刺激和浓度（例如，0.1 单位/mL 凝血酶或 3 μg/mL 胶原蛋白）刺激。
10. 刺激后，在冰冷的改性 HEPES 缓冲液中稀释血小板悬液 1 至 10。
11. 对于流式细胞术，将侧向散射 （SSC） 和前向散射 （FSC） 增益分别设置为 40 mV 和 220 mV，并使用对数刻度散点图来可视化悬浮液中的颗粒群（ 图 1A 中的示例）。
12. （可选）使用抗 CD41 抗体对一份血小板悬液进行免疫染色，以鉴定与血小板相对应的事件群体（图 1B 中的示例）。
13. 使用 405 nm 激发（紫色激光）和 580 nm 波长发射通过流式细胞术分析样品，选择性检测超氧阴离子特异性产物 2-羟基乙锭 （2OH-Et + ）（图 2）。
    注意:不建议用多聚甲醛固定和长期储存样品。

2. 方法 2:使用 DHE 通过单血小板荧光成像检测超氧阴离子

1. 在实验当天，用来自马肌腱的 0.1 mg/mL 原纤维胶原 I（Horm 胶原蛋白）、0.2 mg/mL 纤维蛋白原或 1 mg/mL 聚-L-赖氨酸 （PLL） 在改良的 Tyrode 缓冲液中涂布 8 孔μ玻片，在 37 °C 下涂布 2 小时。
2. 用改良的 Tyrode 缓冲液洗涤两次（每次 10 分钟）。
3. 通过在改良的 Tyrode 缓冲液加 5 mg/mL 牛血清白蛋白 （BSA） 中孵育至少 30 分钟（或直到实验）来淬灭非特异性粘附。
4. 预热 （37 °C） 柠檬酸钠溶液 （4% w/v），并在静脉穿刺时以 1:7（最终 0.5% w/v）的比例将其直接添加到血液中，将其用作抗凝剂。
5. 通过肘正中静脉静脉穿刺从健康志愿者中抽取外周人血。
6. 通过初始离心步骤以 200 x g 的速度 20 分钟从全血中获得富血小板血浆 （PRP）。
7. 用可逆血小板抑制剂吲哚美辛 （10 μM） 和 PGE1 （40 ng/mL） 以 500 x g 离心 PRP 10 分钟。
8. 将所得血小板沉淀重悬于改良的 Tyrode 缓冲液（145 mM NaCl、2.9 mM KCl、10 mM HEPES、1 mM MgCl 2 、5 mM 葡萄糖，pH 7.3）（37 °C）中，密度为 4 x 10⁷ 个血小板/mL。
9. 分离后，血小板在 37 °C 下静置 30 分钟。
10. 在二甲基亚砜 （DMSO） 中制备 10 mM 储备液的 DHA。
11. 向血小板悬液中加入终浓度为 10 μM 的 DHE（将储备溶液稀释 1 至 1,000，终 DMSO 浓度为 0.1% v/v）并孵育 1 分钟 （37 °C）。
12. 与 DHE 孵育 1 分钟后，从所选孔中取出封闭溶液，将 μ 载玻片放在显微镜载物台上准备成像，然后轻轻分配血小板。
13. 通过倒置共聚焦成像监测 DHE 转化为 2OH-Et + 10 分钟 （405/580 nm ex/em），使用 40 倍油浸镜头每 10 秒收集一次图像。
14. （可选）对于涂有 PLL 的孔，通过在血小板分配和荧光图像收集后 10 分钟添加激动剂再添加激动剂 10 分钟，监测响应可溶性激动剂（例如，0.1 单位/mL 凝血酶或 3 μg/mL 胶原蛋白）的超氧阴离子产生，如步骤 2.13 中所述。
15. （可选）如果需要，在时间过程中轻轻分配到孔的一侧，添加超氧阴离子清除剂或选择性抑制剂（例如，NOX 抑制剂），并按照 2.13 中的描述收集荧光图像 10 分钟。
16. 通过选择包含代表性单血小板的 感兴趣区域 （ROI） 并使用成像套件 ImageJ 1.53t 的 测量 工具分析不同帧中的荧光强度来量化单细胞荧光分析。

3. 方法 3:使用电子顺磁共振 （EPR） 检测血小板中的超氧阴离子

1. 预热 （37 °C） 柠檬酸钠溶液 （4% w/v），并在静脉穿刺时以 1:7（最终 0.5% w/v）的比例将其直接添加到血液中，将其用作抗凝剂。
2. 通过肘正中静脉静脉穿刺从健康志愿者中抽取外周人血。
3. 通过初始离心步骤以 200 x g 的速度 20 分钟从全血中获得富血小板血浆 （PRP）。
4. 用可逆血小板抑制剂吲哚美辛 （10 μM） 和 PGE1 （40 ng/mL） 以 500 x g 离心 PRP 10 分钟。
5. 将所得血小板沉淀重悬于改良的 Tyrode 缓冲液（145 mM NaCl、2.9 mM KCl、10 mM HEPES、1 mM MgCl2、5 mM 葡萄糖，pH 7.3）（37 °C）中，密度为 2 x 10⁸ 个血小板/mL。
6. 分离后，血小板在 37 °C 下静置 30 分钟。
7. 向血小板悬液中加入 5 μM 二乙基二硫代氨基甲酸酯 （DETC） 和 25 μM 去铁胺。
8. 在不孵育的情况下，加入 200 μM 1-羟基-3-甲氧基羰基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷 （CMH）。
9. 将样品加载到聚集比色皿（包括 Teflon 涂层的搅拌磁铁）内的聚集仪上。
10. 1 分钟后，添加所需浓度的刺激物（例如，1 单位/mL 凝血酶或 3 μg/mL 胶原蛋白）。孵育 10 分钟。
11. （可选）通过在所需时间进行步骤 3.12，在不同时间点获得超氧阴离子生成。
12. 将血小板悬液从聚集比色皿转移到微量离心管中，并以 6,000 x g 的速度快速旋转 10 秒。
13. 在毛细管微量移液器中加载 50 μL 上清液，并用 EPR 密封蜡密封。
14. 将样品转移到 EPR 扫描仪。
15. 将 EPR 扫描仪设置如下:中心场 3,492.5 G，场扫描 60 G，调制幅度 2 G，扫描时间 10 s，扫描次数 10，微波频率 9.39 GHz，微波功率 20 mW，转换时间 327.68 ms，时间常数 5242.88 ms。
16. 将 CMH 氧化为 CM^● 估计为使用上述参数记录的 EPR 峰的曲线下面积 （AUC）。
17. 构建校准曲线，在 y 轴上绘制如步骤 3.16 中所述测量的 EPR 强度，在 x 轴上绘制市售 CM^● 的浓度（例如，0、0.3、1、3、10 和 30 μM）。
18. 根据样品中的 CM^● 浓度，使用"代表性结果"部分中描述的公式获得样品中血小板产生的超氧阴离子的量。

结果

对于 DHE 荧光的流式细胞术检测，我们显示了静息血小板（图 3A）或用 0.1 单位/mL 凝血酶刺激血小板（图 3B）的代表性结果。O₂^•- 输出量化为血小板平均荧光强度 （MFI），如用 0.1 单位/mL 凝血酶（图 3C）或 3 μg/mL 胶原蛋白相关肽 （CRP） 刺激所示（图 3D）。由于血小板刺激，观察到 DHE 染色增加了 2/3 倍。为了确认测量了 O₂^•- ，我们建议使用细胞渗透性 O₂^•- 清除剂聚乙二醇化超氧化物歧化酶 （PEG-SOD，100 单位/mL），而为了确定 O₂^•- 的来源，我们使用了 NOX 抑制剂 VAS2870 （10 μM）。对于胶原蛋白和凝血酶，PEG-SOD 和 VAS2870 消除了血小板活化引起的 DHE 荧光的增加，证实了测量对 O₂^•- 具有特异性，并且它们在这些条件下的来源是 NOX 酶。

对于 DHE 荧光的成像检测，我们提供了来自评估在粘附到胶原蛋白或纤维蛋白原的那一刻（以及接下来的 10 分钟）产生 O₂^•- 的实验数据（图 4A）或来自旨在评估先前粘附在 PLL 上的血小板的 O₂^•- 产生的实验凝血酶刺激（图 4B）。正如预期的那样，对 PLL 的粘附不会触发 O₂^•- 的稳健产生。很可能是因为这种形式的粘附依赖于静电相互作用，而没有任何信号反应的启动⁴⁵，这使得这种方法适合测量响应可溶性激动剂添加的 O₂^•- 输出。为了确认该方案允许检测 O₂^•-，可以使用清除剂或选择性抑制剂。我们在以前的研究中已经表明，在这些实验中，N-乙酰半胱氨酸 （NAC） 可以清除 O₂^•- 并消除血小板荧光⁴⁶。在这里，我们表明选择性 NOX 抑制剂VAS2870有效且立即减弱粘附在胶原蛋白或纤维蛋白原（图 4A）或对凝血酶有反应的血小板（图 4B）中的荧光。这表明在这些实验条件下，NOX 是 O₂^•- 的来源。响应于粘附于胶原蛋白或纤维蛋白原或凝血酶刺激粘附于 PLL 的血小板的 DHE 荧光（405 nm 激发）的代表性视频分别作为 补充文件 1、 补充文件 2 和 补充文件 3 包括在内。值得注意的是，PEG-SOD 已在其他实验装置中作为 O₂^•- 清除剂成功使用，但在此类实验中无效。我们目前对此没有明确的解释。我们可以假设 PEG-SOD 到达细胞区室，其中 O₂^•- 在基于成像的测定中诱导荧光增加，效率差或动力学缓慢。可能需要进一步的重点调查来澄清这一点。

我们在先前发表的不同研究中应用了 EPR 对血小板中 O₂^•- 的测量 1,13,47,48,49,50。该技术的一个关键步骤是使用市售的 CM^● （即，自旋探针 CMH 和 O₂^•- 之间的反应产物以及 EPR 测量的共振物质）制备校准曲线。CMH 和 O₂^•- 的反应如图 5A 所示，不同浓度的 CM^● 诱导的 EPR 信号的代表性示例如图 5B 所示。来自不同 CM^● 浓度的数据用于构建校准曲线，描述样品中氧化 CMH 量与 EPR 信号强度之间的线性相关性（图 5C）。以下公式描述了 CM^● 浓度和 EPR 信号强度之间的相关性，是计算本研究实验校准曲线的起点（公式 1）:

由于 CM^● 浓度及其相应的 EPR 强度都是通过实验获得的，因此可以计算校准曲线的 斜率 和 Y 轴截距 。在 图 5C 所示的示例中， 斜率 = 1,002,169 和 截距 = 596,383。因此，校准曲线的方程可以改写为:

通过重新排列上述公式，可以根据不同样品的 EPR 强度值计算其 CM^● 浓度（公式 2）:

一旦知道样品中 CM^● 的浓度，就可以使用以下公式计算其每个血小板的生成速率和时间单位（公式 3）:

使用公式 2，公式 3 可以改写为（公式 4）:

在 图 5C 所示的示例中，可以重写为:

CMH 氧化速率将表示为每分钟每个血小板产生的 CM^● 阿托摩尔。该值可用于比较实验和供体之间的 O₂^•- 生成速率，这对于 DHA（或 DCFDA）等荧光探针是不可能的。荧光探针通常只允许估计不同条件对 O₂^•- 产生的影响，即同一实验中荧光强度的变化。对于本文中描述的所有技术，使用 ROS 清除剂（例如 PEG-SOD、NAC）或产生超氧阴离子的酶的选择性抑制剂（例如，抑制 NOX 的 VAS2870）证实了检测的特异性。在这里，我们提供了用凝血酶（图 6A、C、E）或胶原蛋白（图 6B、D、F）刺激血小板（图 6）的数据。对于这两种激动剂，PEG-SOD 用于确认检测到 O₂^•-，而对聚乙二醇化过氧化氢酶 （PEG-Cat.） 没有效果表明该技术无法检测到过氧化氢（分别为图 6C、D）。VAS2870消除了凝血酶 - （图 6E）和胶原蛋白诱导的 （图 6F） EPR 信号，表明 NOX 是血小板 O₂^•- 响应这两种激动剂的主要来源。

图 1:血小板悬液的流式细胞术分析。 （A） 分离血小板的前向 （FSC） 和侧向散射 （SSC） 图的典型表示。（B） 用抗 CD41 抗体对血小板悬液进行免疫染色，证实制剂中 >98% 的颗粒为血小板。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:DHE 与超氧阴离子和其他 ROS 的化学反应及其产物的光谱特性。 DHE及其两种氧化产物2-羟基-乙锭（2OH-Et+）的结构和光谱特性，与超氧阴离子反应生成，乙锭（Et+），与其他类型的ROS（例如羟基自由基和过氧化氢）反应生成。405 nm 处的激发峰（图中蓝色虚线矩形突出显示）对 2OH-Et+ 具有特异性，因此可用于检测/测量 O₂^•-。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:通过 DHE 和流式细胞术检测到凝血酶和胶原依赖性超氧阴离子生成。 （A） 静息血小板和 （B） 凝血酶刺激的血小板 DHE 染色的代表性直方图。该条表示 DHE 染色值低于 500，静息血小板和凝血酶刺激的血小板分别为 70.7% 和 16.1%。该技术用于估计 （C） 0.1 单位/mL 凝血酶和 （D） 3 μg/mL 胶原蛋白刺激的血小板中超氧阴离子的产生。本实验使用 PEG-SOD （100 unit/mL） 确认测量超氧阴离子，而 10 μM VAS2870 用于鉴定 NOX 酶是超氧阴离子的来源。每个数据点计算为 50,000 个血小板的平均荧光强度 （MFI），每个实验独立重复五次 （n = 5），平均 ± SEM 如图所示。通过单因素方差分析和 Tukey 后检验进行成对比较来评估统计显着性 （** = p < 0.01，*** = p < 0.001）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:通过 DHE 荧光成像检测到的胶原蛋白、纤维蛋白原和凝血酶依赖性超氧阴离子生成。 （A） 评估粘附在胶原蛋白或纤维蛋白原上的血小板的超氧阴离子生成动力学。成像开始后 1 分钟将血小板分配到包被的 μ 载玻片上，同时在图像收集开始后 5 分钟加入 10 μM VAS2870。（B） 凝血酶刺激后血小板的超氧阴离子生成动力学。在图像收集开始前，让血小板粘附在 PLL 包被的 μ 载玻片上 10 分钟。2 分钟后，加入 0.1 单位/mL 凝血酶，再过 5 分钟后，加入 10 μM VAS2870（即成像开始后 7 分钟）。实验方案显示在面板的顶部，而 0 分钟、1 分钟、3 分钟、6 分钟和 9 分钟的代表性图像显示在面板中间。单血小板 DHE 荧光定量显示在面板底部，并使用 ImageJ 通过荧光强度分析获得。数据是 4 个独立实验中每个条件 8-12 个血小板的 SEM 平均值±。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5:校准曲线和 CMH 氧化速率计算。（A） CMH 和 CM^●的化学结构和 EPR 特性。（B） 不同浓度 CM^● （100 nM 至 10 μM）的 EPR 数据代表性示例。（C） EPR 强度与 CM^● 浓度的校准曲线。请单击此处查看此图的较大版本。

图 6:血小板在凝血酶或胶原蛋白刺激下产生的超氧阴离子的检测。使用 （A） 0.1 单位/mL 凝血酶或 （B） 3 μg/mL 胶原蛋白刺激的血小板中，使用自旋探针 CMH 通过 EPR 测量超氧阴离子输出量。（C、D）在两种激动剂的测试条件中，包括浓度为 100 单位/mL 的超氧阴离子清除剂 PEG-SOD 或 100 单位/mL 的过氧化氢清除剂聚乙二醇化过氧化氢酶 （PEG-Cat.） 的浓度。通过与 NOX 抑制剂 VAS2870 （10 μM） 共孵育来研究超氧阴离子的来源。（E） 凝血酶和 （F） 胶原蛋白都依赖于 NOX 活性来产生超氧阴离子。在整个图中，CMH/超氧阴离子反应速率是根据 EPR 迹线计算的，如手稿中所述（公式 4）。数据是来自 5 （C，D） 和 4 个独立实验 （E，F） 的 SEM 均值±。通过单因素方差分析和 Tukey 后检验进行成对比较来评估统计显着性 （** = p < 0.01，*** = p < 0.001）。请单击此处查看此图的较大版本。

补充文件 1: 响应胶原粘附的 DHE 荧光（405 nm 激发）的代表性影片。 请点击此处下载此文件。

补充文件 2: 响应粘附纤维蛋白原的 DHE 荧光（405 nm 激发）的代表性影片。 请点击此处下载此文件。

补充文件 3: DHE 荧光（405 nm 激发）响应凝血酶刺激粘附在 PLL 上的血小板的代表性电影。 请点击此处下载此文件。

讨论

在这份手稿中，我们提出了三种不同的技术，这些技术有可能通过选择性检测 O₂^•- 来提高研究血小板功能的氧化还原依赖性调节的能力。前两种方法是对现有技术的改进，因为使用了氧化还原探针（DHE 而不是更常见但不太可靠的 DCFDA）。因此，这些技术很容易获得，大多数实验室无需特殊设备或培训费用即可有效采用它们。第三种技术基于使用专用设备通过 EPR 分析自旋探针 CMH 的氧化。这项技术需要购买专门的设备和试剂，并对实验室用户进行专门的培训。因此，它似乎适用于专门研究血小板（或其他细胞）中氧化还原依赖性事件的实验室。

对于利用 DHE 的技术，激发波长的选择对于获得 O₂^•- 的特异性检测至关重要。DHE与O₂^•-反应生成的2-羟基乙锭（2OH-Et + ）在405 nm处激发，而DHE与ROS（例如羟基自由基和过氧化氢）的一般反应生成的乙锭（Et + ）在520 nm附近具有激发峰，但在405 nm处没有激发（图1）⁵¹。使用 DHE 代替 DCFDA 可以防止该探针与细胞成分（如过氧化物酶、其他含血红素的酶和金属离子还原剂）的直接反应引起的伪影 42,43,44。DHE 被认为是细胞氧化还原研究的更安全工具^38,39。在这里，我们建议将 DHE 与两种不同的读出技术一起使用:1） 流式细胞术和 2） 荧光成像。

流式细胞术通常是一种允许同时处理多个样品的技术，通量为中低通量⁵²。不幸的是，本研究中使用的方法不允许样品固定。尽管用冰冷的改性 Tyrode 缓冲液稀释样品可稳定样品中的荧光长达 30 分钟，但所有样品的分析都需要在此时间范围内进行。这大大限制了每个实验的样本数量。可以在同一天内进行多次内部对照实验运行并使用相同的血小板制备，但结果应归一化为对照，而不是被视为独立实验。本手稿的作者使用该技术来强调氧化还原依赖性血小板调节在对不同激动剂和调节剂的反应中的作用^46,50。该方法可以通过采用化学修饰的 DHE 版本来修改，该 DHE 允许靶向线粒体（即 Mitosox）⁵³，该版本已用于专注于 NOX2 的血小板研究⁵⁴。这是一个有趣的机会，我们的实验室还没有抓住机会。

这里提出的使用 DHE 的荧光成像技术的优点是可以确定粘附（激动剂在成像孔表面吸收）或刺激（悬浮激动剂）时血小板中 O₂^•- 产生的时间进程。这允许解释血小板活化过程不同阶段的相互作用，并评估不同 O₂^•- 来源（例如，不同的 ROS 生成酶，例如 NOX）的贡献。没有现有的技术允许这种类型的调查。这是以分析通量为代价的，每个测试条件需要 30 分钟（包括μ玻片设置、聚焦和视野选择、成像和数据保存）。因此，该技术允许在每个工作日（即 10 个以下）测试少量条件。尽管此处显示的数据使用了共聚焦显微镜，但我们已经证实，使用具有 405 nm 激发能力的落射荧光显微镜也可以获得同样好的结果。这减少了对昂贵的共聚焦显微镜设置的要求，并使该技术更实惠。

EPR 方案是根据先前对不同细胞类型的研究开发的⁵⁵。该技术被广泛认为是研究 ROS 生成和研究细胞中氧化还原依赖性事件的最可靠工具³⁸。由于羟胺自旋探针与氧自由基反应的特异性^56，EPR 与其他技术相比具有卓越的可靠性，还允许量化 O₂^•- 生成速率及其在不同个体和实验之间的比较。这通过基于荧光的技术是不可能的，它只允许我们在单个实验和血小板制备中估计所选条件对荧光强度的影响。尽管该 EPR 方案是作为一种与血小板聚集相结合的技术开发的，用于血小板活化和 O₂^•- 第¹ 代的平行监测，但这些实验可以在没有聚集平行分析的情况下进行。即使没有血小板聚集的平行分析，我们也建议在聚集仪中进行孵育，以保证有效的血小板刺激，这需要连续搅拌提供的剪切应力。如果需要在 1.5 mL 微量离心管中进行实验而不搅拌，则 O₂^•- 的产生水平会显著降低。因此，如果选择这种实验方法，我们建议在旋转轮上进行 CMH 孵育，并使用更密集的血小板（即 1 x 10⁹/mL），这会产生足够强的信号，以便 EPR 波谱仪检测到。

总之，我们在这里提出了三种经过验证的检测血小板中 O₂^•- 的技术。它们具有不同的优势，可以根据实验目标和优先级进行选择。第一种基于流式细胞术使用 DHE 的技术最省力和最耗时，因此可以选择作为入门级分析。第二种技术基于荧光显微镜使用 DHE，可以了解 O₂^•- 生成的快速动力学，并研究不同的信号级联如何影响秒级时间尺度上的氧化反应（而其他技术仅允许终点调查刺激后几分钟内发生的事件）。最后，EPR 允许量化 O₂^•- 生成速率及其在实验和个体之间的比较。因此，后一种技术对于旨在表征来自不同个体的血小板氧化反应的临床研究特别有用（例如，患者或患者 与 健康对照者的比较）。总体而言，与现有方法相比，这三种技术具有显着优势，代表了我们可用于研究血小板中氧化还原依赖性事件的实验工具的重大进步。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-羟基-3-甲氧基羰基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷 （CMH）	Noxygen Science trasfer and diagnostics GmbH	NOX-02.1-50mg	EPR 试剂（自旋探针）
BD FACSAria III	BD Biosciences	NA	流式细胞仪
血清白蛋白	Merck/Sigma	A7030	用于 &μ;-slide 涂层
Bruker E-scan M （Noxyscan）	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-E.11-BES	EPR 波谱仪
过氧化氢酶–聚乙二醇 （PEG-Cat.）	Merck/Sigma	C4963	过氧化氢清除剂（特异性控制）
ChronoLog Model 490+4	Labmedics/Chronolog	NA	凝集仪
CM 自由基	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-20.1-100mg	EPR 试剂（校准对照）
去铁胺	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-09.1-100mg	EPR 试剂
二乙基二硫代氨基甲酸酯 （DETC）	Noxygen Science 交易和诊断有限公司	NOX-10.1-1g	EPR 试剂
二氢乙锭	Thermo Fisher Scientifics	D11347	超氧阴离子探针
二甲基亚砜	Merck/Sigma	34869	用于储备液制备
EPR 密封蜡板	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-A.3-VPM	EPR
级水	Noxygen Science trasfer and diagnostics GmbH	NOX-07.7.1-0.5L	EPR 试剂
来自人血浆的纤维蛋白原	Merck/Sigma	F4883	用于 &μ;-slide 涂层
FITC 抗人 CD41 抗体	BioLegend	303704	用于流式细胞术的血小板特异性染色
玻璃比色皿	Labmedics/Chronolog	P/N 312	用于凝聚器中孵育的消耗品
Horm 胶原蛋白	Labmedics/Chronolog	P/N 385	用于血小板刺激
ImageJ	美国国立卫生研究院 （NIH）	NA	ImageJ 1.53t （Wayne Rasband）
吲哚美辛	Merck/Sigma	I7378	用于血小板分离
微量移液器 DURAN 50µl	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-G.6.1-50µL	EPR
聚-L-赖氨酸盐酸盐	Merck/Sigma	P2658	用于 μ-slide 包衣
前列腺素 E1 （PGE1）	Merck/Sigma	P5515	用于血小板分离
柠檬酸钠（4% w/v 溶液）	Merck/Sigma	S5770	用于血小板分离
搅拌棒（特氟龙涂层）	Labmedics/Chronolog	P/N 313	用于在聚集仪中孵育的消耗品
超氧化物歧化酶–聚乙二醇 （PEG-SOD）	Merck/Sigma	S9549	超氧阴离子清除剂（特异性控制）
来自人血浆的凝血酶	Merck/Sigma	T6884	用于血小板刺激和 &μ;-slide 涂层
VAS2870	Enzo Life Science	BML-EI395	NOX 抑制剂
Zeiss 510 LSM 共聚焦显微镜	Zeiss	NA	共聚焦显微镜