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方法文章

血小板中超氧阴离子生成的替代检测方法

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⸱

DOI：

10.3791/66647

⸱

2024年3月29日

 ,  ,  , 
1Medicines and Healthcare Regulatory Agency, South Mimms laboratories, 2Hull York Medical School, University of Hull

本文内容

摘要

超氧阴离子的生成对于血小板的活化至关重要，若调控失常，则在血栓性疾病中具有关键作用。本文介绍了三种选择性检测超氧阴离子及研究氧化还原依赖性血小板调控的方法。

摘要

活性氧（ROS）是一类高度不稳定的含氧分子。其化学不稳定性使其具有极强的反应活性，能够与蛋白质、核酸和脂质等重要的生物分子发生反应。超氧阴离子是通过分子氧还原（即获得一个电子）产生的重要活性氧。尽管最初认为其仅参与衰老、退行性疾病和致病过程，但近年来发现其在多种重要生理反应中也发挥着作用。在血管系统中，超氧阴离子已被证实可调节血管平滑肌细胞的分化与功能、血管内皮细胞在血管生成过程中的增殖与迁移、免疫反应以及止血过程中血小板的活化。超氧阴离子在血小板功能失调及多种疾病状态（包括癌症、感染、炎症、糖尿病和肥胖）相关的心血管并发症中具有尤为重要的作用。因此，在心血管研究中，能够有效检测人血小板中 超氧阴离子的生成 ，理解调控止血与血栓形成之间平衡的氧化还原依赖性机制，并最终 发现可用于调节血小板反应、预防血栓形成及心血管并发症的新型药理学工具，已成为极为重要的研究方向。本研究介绍了三种已成功用于检测血小板中超氧阴离子以及研究调控止血与血栓形成的氧化还原依赖性机制的实验方案：1）基于二氢乙啶（DHE）的流式细胞术检测超氧阴离子；2）基于DHE的单个血小板成像对超氧阴离子进行可视化观察与分析；3）基于自旋探针的电子顺磁共振（EPR）法对血小板中超氧阴离子产量进行定量测定。

引言

超氧阴离子（O2•-）是血小板中产生的最具功能相关性的活性氧（ROS）1。O2•- 是分子氧还原的产物，也是多种不同活性氧的前体2。O2•- 的歧化反应可通过水溶液中的自发反应或超氧化物歧化酶（SODs3）催化的反应生成过氧化氢（H2O2）。尽管已有研究提示多种酶促来源（如黄嘌呤氧化酶4、脂氧合酶5、环氧化酶6, 和一氧化氮合酶7），但线粒体呼吸8,9 和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOXs10）是真核细胞中超氧阴离子最主要的来源。在血小板中似乎也是如此，已有研究指出线粒体呼吸过程中电子泄漏11,12 以及 NOXs 的酶活性13,14 是超氧阴离子生成的主要贡献因素。

尽管已有若干研究聚焦于超氧阴离子（O2•-）对血小板的调控作用，但其分子机制尚无定论。已有研究提出，可通过直接氧化和二硫键形成来调节多种血小板表面受体的活性。活性氧（ROS）可通过直接氧化半胱氨酸残基从而正向调控整合素αIIbβ3的功能15,16,17。类似地，由于血小板对胶原的反应依赖于二硫键依赖性的糖蛋白VI（GPVI）二聚化18，因此也提出了ROS依赖性氧化增强受体活性的机制19，但该机制尚未在实验中完全证实。最后，有研究表明，活性氧诱导的糖蛋白Ib（GPIb）巯基氧化可促进炎症过程中的血小板黏附及血小板-白细胞相互作用20。相反，还原性条件可能通过减少巯基氧化及受体激活，导致GPVI和GPIb胞外域的脱落减少 21。

也有研究提出，活性氧（ROS）可通过不直接氧化血小板表面受体的其他作用机制发挥作用。例如，超氧阴离子（O2•-）已被证明可通过抑制含 Src 同源性 2 区域的蛋白酪氨酸磷酸酶 2（SHP-2）的活性，从而正向调节胶原受体 GPVI，而 SHP-2 通常对该受体的信号级联起负向调控作用22。此外，O2•- 可通过与一氧化氮（NO）快速反应生成过氧亚硝酸根（ONOO- ，即过氧亚硝酸盐），而 NO 通常通过 NO 敏感性鸟苷酸环化酶（NO-GC）产生环磷酸鸟苷（cGMP）这一负性血小板调节因子，从而抑制血小板活性23,24。因此，NO 水平的降低可能导致血小板功能增强。另一种机制是，由 NOX2 产生的 O2•- 可能促进脂质过氧化和异前列腺素的形成，这对血小板的活化与黏附至关重要25。最后，细胞外信号调节激酶 5（ERK5），即丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的一员，被认为是一种血小板内氧化还原应激感受器26，可被 O2•- 激活，并诱导血小板呈现促凝表型（通过基于流式细胞术检测磷脂酰丝氨酸外翻程度进行评估）27。

血小板中O2•-及其他活性氧（ROS）生成的失调与过度的止血反应相关，进而导致动脉粥样硬化、糖尿病、高血压、肥胖和癌症等疾病中血栓性心血管并发症的发生28,29。在这些病理状态下，血小板产生的ROS增加，从而增强其黏附和聚集反应。除了对血小板自身功能的影响外，血小板释放的自由基还可能影响其他血细胞和血管结构，这一领域在心血管健康研究中尚缺乏充分认识和深入探索30。尽管目前对氧化应激与血栓性疾病之间分子机制的理解仍有限，但抗氧化剂在预防心血管疾病方面的临床意义已受到广泛关注。研究表明，血浆抗氧化剂水平与心血管疾病发病风险呈负相关，膳食抗氧化剂的摄入可对冠状动脉疾病起到保护作用31,32 。因此，膳食抗氧化剂的使用被认为是一种有前景的心血管疾病预防策略33,34,35。在ROS对血小板产生的多种效应中，细胞凋亡的增加可能具有重要的病理生理学意义36,37。总体而言，可靠检测和定量血小板O2•-生成的方法在心血管研究中正变得日益重要。

目前，用于检测活性氧（ROS）的技术在特异性和可靠性方面均存在重要局限性：特异性方面，所检测氧化剂分子的化学性质不明确；可靠性方面，与生物分子及实验试剂的非预期相互作用会导致偏离生理状态的偏差结果38,39。在血小板中检测ROS最常用的方法基于使用二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFDA），该物质被细胞内酯酶转化为二氯二氢荧光素（DCFH），随后被包括羟基自由基和过氧化物酶-H2O2中间体在内的细胞氧化剂进一步氧化为高度荧光的二氯荧光素（DCF）40,41。尽管该方法被广泛使用，但其在检测细胞内ROS时的可靠性已受到严重质疑38。事实上，DCFH向DCF的氧化反应可由过渡金属离子（如Fe2+）或含血红素的酶（如细胞色素）引发，而非ROS所致42。此外，DCFDA可被细胞过氧化物酶转化为其半醌自由基形式（DCF•-），后者通过与分子氧（O2）反应被进一步氧化为DCF，同时释放超氧阴离子（O2•-），从而人为放大氧化应答信号41,43,44。因此，使用DCFDA检测细胞内ROS虽有助于获得初步信息，但需谨慎解读结果，并辅以充分的实验对照38,39。

本研究介绍了三种用于检测和测定血小板功能关键调控因子O2•-1的替代技术。第一种技术是利用DHE和流式细胞术进行检测，相较于DCFDA，该方法具有更高的可靠性和特异性。第二种技术同样使用DHE，但检测方法为活血小板荧光成像，可对血小板信号转导过程中快速动力学和单细胞分辨率下的O2•- 生成进行研究。最后，基于在电子顺磁共振（EPR）实验中使用羟胺自旋探针1-羟基-3-甲氧羰基-2,2,5,5-四甲基吡咯啉（CMH）的实验方案，可定量测定血小板生成O2•-的速率，并在不同条件下进行比较。

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方案

采集经知情同意的志愿者外周血样本已获得当地伦理委员会和英国国家医疗服务体系健康研究管理局的批准（伦理审查委员会编号：21/SC/0215；IRAS编号：283854）。

方法1：使用DHE通过流式细胞术检测超氧阴离子

  1. 将柠檬酸钠溶液（4% w/v）预热至 37 °C，并在静脉穿刺采血时以 1:7 的比例直接加入血液中作为抗凝剂（终浓度为 0.5% w/v）。
  2. 通过肘正中静脉穿刺从健康志愿者采集外周人血。
  3. 通过初始离心步骤（200 × g，20 分钟）从全血中获取富血小板血浆（PRP）。
  4. 在可逆性血小板抑制剂吲哚美辛（10 µM）和 PGE1（40 ng/mL）存在下，将 PRP 以 500 × g 离心 10 分钟。
  5. 将所得血小板沉淀重悬于改良 Tyrode 缓冲液（145 mM NaCl，2.9 mM KCl，10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）， 1 mM MgCl2，5 mM 葡萄糖，pH 7.3）中，于 37 °C 下调整血小板密度至 2 × 108 个/mL。
  6. 分离后，在 37 °C 下静置血小板 30 分钟。
  7. 用二甲基亚砜（DMSO）配制 DHE 储存液，浓度为 5 mM。
  8. 将 DHE 加入血小板悬液中，使其终浓度为 5 µM（将储存液稀释 1000 倍，终浓度 DMSO 为 0.1% v/v），37 °C 孵育 15 分钟。
  9. 在使用特定生理刺激物（如 0.1 单位/mL 凝血酶或 3 µg/mL 胶原蛋白）刺激前，先用药物处理剂和/或活性氧清除剂处理血小板 15 分钟。
  10. 刺激后，用预冷的改良 HEPES 缓冲液将血小板悬液稀释 10 倍。
  11. 进行流式细胞术检测时，将侧向散射（SSC）和前向散射（FSC）增益分别设为 40 mV 和 220 mV，使用对数尺度散点图观察悬液中颗粒群体（示例见图 1A）。
  12. （可选）使用抗 CD41 抗体对一份血小板悬液进行免疫染色，以鉴定对应于血小板的事件群（示例见图 1B）。
  13. 采用 405 nm（紫色激光）激发、580 nm 发射波长进行流式细胞术分析，特异性检测超氧阴离子特异性产物 2-羟基乙锭（2OH-Et+）（图 2）。
    注意：不建议使用多聚甲醛固定或长期储存样品。

2. 方法2：利用DHE通过单血小板荧光成像检测超氧阴离子

  1. 在实验当天，用来自马肌腱的0.1 mg/mL纤维状I型胶原（Horm胶原）、0.2 mg/mL纤维蛋白原或1 mg/mL聚-L-赖氨酸（PLL）溶于改良Tyrode缓冲液中，在37 °C条件下孵育2小时，包被8孔µ载片。
  2. 用改良Tyrode缓冲液洗涤两次（每次10分钟）。
  3. 通过在含5 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）的改良Tyrode缓冲液中孵育至少30分钟（或直至实验开始），封闭非特异性黏附。
  4. 预先将柠檬酸钠溶液（4% w/v）在37 °C温育，并在静脉穿刺采血时以1:7的比例直接加入血液中作为抗凝剂（终浓度为0.5% w/v）。
  5. 通过肘正中静脉穿刺采集健康志愿者的外周人血。
  6. 将全血在200 x g离心20分钟，初步获得富血小板血浆（PRP）。
  7. 在可逆性血小板抑制剂吲哚美辛（10 µM）和PGE1（40 ng/mL）存在下，将PRP在500 x g离心10分钟。
  8. 将所得血小板沉淀重悬于改良Tyrode 缓冲液（145 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM葡萄糖, pH 7.3）中，调整至37 °C，血小板密度为4 x 107 个/mL。
  9. 分离后，在37 °C静置血小板30分钟。
  10. 将DHE溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成10 mM的储存液。
  11. 向血小板悬液中加入DHE至终浓度10 µM（将储存液稀释1000倍，终浓度DMSO为0.1% v/v），37 °C孵育1分钟。
  12. 与DHE孵育1分钟后，移除选定孔中的封闭液，将µ载片置于显微镜载物台上准备成像，并轻柔地加入血小板悬液。
  13. 使用倒置共聚焦显微镜监测DHE转化为2OH-Et+的过程，激发/发射波长为405/580 nm，持续成像10分钟，每10秒采集一次图像，使用40倍油镜。
  14. （可选）对于PLL包被的孔，在加入血小板10分钟后，加入可溶性激动剂（如0.1单位/mL凝血酶或3 µg/mL胶原），继续荧光成像10分钟，监测超氧阴离子的生成，具体操作如步骤2.13所述。
  15. （可选）如需，可在实验过程中轻柔地将超氧阴离子清除剂或选择性抑制剂（如NOX抑制剂）加入孔的侧壁，随后继续按步骤2.13所述采集荧光图像10分钟。
  16. 通过在图像分析软件ImageJ 1.53t中选择包含代表性单个血小板的感兴趣区域（ROI），并使用测量工具分析不同帧中的荧光强度，进行单细胞荧光定量分析。

3. 方法三：使用电子顺磁共振（EPR）检测血小板中的超氧阴离子

  1. 将柠檬酸钠溶液（4% w/v）预热至 37 °C，并在静脉穿刺时以 1:7 的比例（终浓度为 0.5% w/v）直接加入血液中作为抗凝剂。
  2. 通过肘正中静脉穿刺采集健康志愿者的外周人血。
  3. 通过初始离心步骤（200 × g，20 分钟）从全血中获取富血小板血浆（PRP）。
  4. 在可逆性血小板抑制剂吲哚美辛（10 µM）和前列腺素 E1（PGE1，40 ng/mL）存在下，将 PRP 以 500 × g 离心 10 分钟。
  5. 将所得血小板沉淀重悬于改良 Tyrode's 缓冲液（145 mM NaCl、2.9 mM KCl、10 mM HEPES、1 mM MgCl2、5 mM 葡萄糖，pH 7.3）中，调整温度至 37 °C，血小板密度为 2 × 108 个/mL。
  6. 分离后，在 37 °C 下静置血小板 30 分钟。
  7. 向血小板悬液中加入 5 µM 二乙基二硫代氨基甲酸盐（DETC）和 25 µM 去铁胺。
  8. 无需孵育，立即加入 200 µM 1-羟基-3-甲氧羰基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷（CMH）。
  9. 将样品装入聚集仪的比浊杯中（包括涂有聚四氟乙烯的搅拌磁珠）。
  10. 1 分钟后，加入所需浓度的刺激物（例如 1 单位/mL 凝血酶或 3 µg/mL 胶原蛋白），孵育 10 分钟。
  11. （可选）在所需时间点，进行步骤 3.12 以测定不同时间点的超氧阴离子生成量。
  12. 将血小板悬液从聚集比浊杯转移至微量离心管中，迅速以 6,000 × g 离心 10 秒。
  13. 取 50 µL 上清液加入毛细管微量移液管中，并用 EPR 封蜡密封。
  14. 将样品转移至 EPR 扫描仪中。
  15. 设置 EPR 扫描仪参数如下：中心磁场 3,492.5 G，扫描范围 60 G，调制幅度 2 G，扫描时间 10 秒，扫描次数 10 次，微波频率 9.39 GHz，微波功率 20 mW，转换时间 327.68 ms，时间常数 5242.88 ms。
  16. 根据上述参数记录的 EPR 峰值曲线下的面积（AUC），估算 CMH 氧化为 CM● 的程度。
  17. 绘制标准曲线：以步骤 3.16 中测得的 EPR 强度为纵坐标，以市售 CM● 的浓度为横坐标（例如 0、0.3、1、3、10 和 30 µM） 。
  18. 根据样品中 CM● 的浓度，利用“代表性结果”部分所述公式计算血小板在样品中生成的超氧阴离子量。

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结果

在使用流式细胞术检测DHE荧光时，我们展示了静息状态（图3A）或经0.1单位/mL凝血酶刺激后（图3B）血小板的代表性结果。超氧阴离子（O2•-）的生成量以血小板平均荧光强度（MFI）进行量化，如经0.1单位/mL凝血酶刺激（图3C）或3 µg/mL胶原相关肽（CRP）刺激后所示（图3D）。血小板经刺激后，DHE染色信号增强了两至三倍。为确认检测的是O2•-，我们建议使用细胞通透性的O2•-清除剂聚乙二醇化超氧化物歧化酶（PEG-SOD，100单位/mL）；为鉴定O2•-的来源，我们使用了NOX抑制剂VAS2870（10 µM）。对于胶原和凝...

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讨论

在本文中，我们介绍了三种不同的技术，这些技术有望通过选择性检测超氧阴离子（O2•-）来提升研究血小板功能中氧化还原依赖性调控的能力。前两种方法在现有技术基础上有所改进，主要体现在所使用的氧化还原探针上（采用DHE而非更常用但可靠性较低的DCFDA）。因此，这些方法具有较高的可及性，大多数实验室无需额外的设备投入或专门培训即可有效采用。第三种技术则基于电子顺磁共振（EPR）分析自旋探针CMH的氧化过程，需要配备专用仪器和试剂，并对实验人员进行专门培训。因此，该技术更适合专门致力于研究血小板（或其他细胞）中氧化还原相关事件的实验室使用。

对于使用DHE的技术，激发波长的选择至关重要，以实现对O2•-的特异性检测。DHE与O2•-反应生成的2-羟基乙锭（2OH-Et+）在405 nm处被激发，而DHE与活性氧（如羟基自由基和过氧化氢）发生非特异性反应生成的乙锭（Et+）在约520 nm处有激发...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由英国心脏基金会（PG/15/40/31522）、阿尔茨海默病研究英国分会（ARUK-PG2017A-3）以及欧洲研究理事会（#10102507）向 G. Pula 提供的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-羟基-3-甲氧羰基-2,2,5,5-四甲基吡咯啉（CMH）Noxygen Science Transfer and Diagnostics GmbHNOX-02.1-50mgEPR（自旋探针）试剂
BD FACSAria IIIBD Biosciences NA流式细胞仪
牛血清白蛋白默克/西格玛A7030对于 μ- 载玻片包被
布鲁克 E-scan M（Noxyscan）Noxygen Science Transfer and Diagnostics GmbH NOX-E.11-BES EPR波谱仪
过氧化氢酶–聚乙二醇（PEG-Cat.）默克/西格玛C4963过氧化氢清除剂（特异性对照）
ChronoLog Model 490+4Labmedics/ChronologNA血小板聚集仪
CM自由基Noxygen Science Transfer and Diagnostics GmbHNOX-20.1-100mg EPR 试剂（校准对照）
去铁胺 Noxygen Science Transfer and Diagnostics GmbHNOX-09.1-100mg EPR试剂
二乙基二硫代氨基甲酸盐（DETC） Noxygen Science Transfer and Diagnostics GmbHNOX-10.1-1g EPR试剂
二氢乙啶赛默飞世尔科技D11347超氧阴离子探针
二甲基亚砜默克/西格玛34869用于储备液的配制 
EPR 密封蜡板Noxygen Science Transfer and Diagnostics GmbHNOX-A.3-VPMEPR 耗材
EPR级水Noxygen Science Transfer and Diagnostics GmbHNOX-07.7.1-0.5L EPR试剂
人血浆纤维蛋白原默克/西格玛F4883对于 μ- 载玻片包被
FITC 抗人 CD41 抗体BioLegend303704血小板特异性染色用于流式细胞术
玻璃比色皿 Labmedics/ChronologP/N 312血小板聚集仪孵育用耗材
激素胶原蛋白Labmedics/ChronologP/N 385用于血小板刺激
ImageJ 美国国立卫生研究院（NIH）NAImageJ 1.53t（Wayne Rasband）
吲哚美辛默克/西格玛I7378用于血小板分离
DURAN 50 微量移液器µlNoxygen Science Transfer and Diagnostics GmbHNOX-G.6.1-50µLEPR 耗材
聚-L-赖氨酸盐酸盐默克/西格玛P2658对于 μ-载玻片包被
前列腺素E1（PGE1）默克/西格玛P5515用于血小板分离
柠檬酸钠（4% w/v 溶液）默克/西格玛S5770用于血小板分离
搅拌子（聚四氟乙烯涂层）Labmedics/ChronologP/N 313血小板聚集仪孵育用耗材
超氧化物歧化酶–聚乙二醇（PEG-SOD）默克/西格玛S9549超氧阴离子清除剂（特异性对照）
人血浆凝血酶默克/西格玛T6884用于血小板刺激和 μ- 载玻片涂覆
VAS2870Enzo Life ScienceBML-EI395NOX抑制剂
蔡司510 LSM共聚焦显微镜ZeissNA共聚焦显微镜

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