本文介绍了一种在成年墨西哥钝口螈中使用内固定钢板进行股骨截骨术的实验方案。该手术方法可用于开展关于水生两栖动物肢体再生与骨折愈合的比较研究。
本文内容
摘要
摘要
墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）因其能够再生缺失或受损的器官（包括四肢、脑、心脏、尾部等）而成为再生医学领域极具前景的模式生物。对墨西哥钝口螈的研究揭示了控制祖细胞激活及损伤后组织修复的细胞与分子通路。这些知识可用于促进不具备再生能力的损伤（如骨不连）的愈合。本方案描述了使用内置钢板固定系统对股骨截骨术进行稳定的手术方法。该操作已针对水生动物（墨西哥钝口螈，Ambystoma mexicanum）进行了优化。实验选用吻端至尾尖长度≥20 cm、股骨完全骨化且大小与小鼠相近的个体，并特别关注钢板的定位与固定以及术后护理。该外科技术可实现标准化且稳定的骨骼固定，有助于与墨西哥钝口螈肢体再生进行直接比较，并可用于两栖类与哺乳类之间骨愈合研究的类比分析。
引言
墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）是研究器官再生的重要模型，其可再生的器官包括尾、脊髓、脑、心脏、鳃和四肢1,2,3,4,5。对墨西哥钝口螈肢体再生的深入研究揭示了细胞去分化机制以及在截肢部位形成干细胞池——即芽基（blastema）的过程。由于芽基细胞能够重建所有缺失的肢体部分，包括具有特定模式的骨骼结构6,7，墨西哥钝口螈成为研究骨愈合的理想模式生物。近年来，多项研究更加关注墨西哥钝口螈的骨生物学，描述了其骨骼形态、细胞组成及骨化动态。
在哺乳动物中发现，长骨的骨愈合过程发生 通过 软骨内成骨，包括多个阶段：血肿形成、 granulation tissue（肉芽组织）形成、软性骨痂形成、骨痂骨化形成硬性骨痂和编织骨，以及骨重建8最近一项研究表明，在墨西哥钝口螈的骨愈合过程中也可观察到类似的阶段。9.
迄今为止，墨西哥钝口螈的骨折研究均在非稳定系统中进行，即仅使用虹膜剪简单切断骨骼。在前肢或后肢的中段（中轴骨）制造大段骨折，其中对一根骨骼进行截骨，而另一根骨骼则作为支撑10,11。相比之下，在哺乳动物（包括大鼠和小鼠）中，通常采用可靠的固定系统（如髓内针和骨对位钢板）来研究骨折，以控制骨折的大小并确保骨骼的正确对位。
因此，该方法旨在确保在截骨前对墨西哥钝口螈股骨进行稳定且均匀的固定。为了使墨西哥钝口螈的研究更易于与哺乳动物（包括小鼠和人类）进行比较，曾考虑采用髓内针12、外固定板13,14,和内固定骨对接板15,16,17 固定方式。其中，内固定骨对接板被证明可实现良好的骨固定，并可通过使用特定直径的Gigly锯进行一次或两次切割，形成特定尺寸的骨缺损间隙。由于墨西哥钝口螈是Ambystoma mexicanum的水生幼体，使用外固定装置可能因开放性伤口与水接触而引发术后并发症。此外，墨西哥钝口螈即使在发育后期（20岁18）也不会形成次级骨化中心，因此在小鼠中常用的标准化髓内钉可能无法避免穿透骨骺。基于上述原因，决定对大型墨西哥钝口螈采用内固定钢板方法。在大型个体中，其股骨大小和骨化程度与成年小鼠相似，因此可实施骨干中段截骨并使用钛板进行固定1。
骨折间隙的大小在很大程度上决定了愈合的动力学过程和最终结果。例如，在小鼠中，0.25 mm的稳定骨折由于间隙小且固定 rigid，主要通过膜内 成骨方式愈合；而0.7 mm的骨折则通过软骨内成骨方式愈合，并在骨折周围形成软骨性骨痂；较大的缺损（如3.5 mm的临界尺寸缺损）则无法完全愈合，因此常被用于模拟骨骨折不愈合模型16。本研究建立了在截骨前对蝾螈股骨进行钢板固定的实验方案，以0.7 mm骨折间隙为例，最终目标是将蝾螈的骨愈合过程与小鼠进行比较9。
截骨术后，骨折部位经历了软骨内成骨过程，尽管其速度比小鼠慢，这可能与墨西哥钝口螈的水生生活方式及较慢的细胞分裂速率有关。本文所展示的方法采用0.7 mm间隙截骨并结合刚性接骨板固定；然而，其他间隙尺寸、半柔性固定装置以及不同材料的接骨板也具有应用潜力。总体而言，本文所述方法可用于标准化的骨固定，有助于比较墨西哥钝口螈肢体再生与骨愈合的研究，或在不同条件下研究墨西哥钝口螈骨愈合过程，以确保骨折固定的标准化。
方案
以下操作已获得维也纳市行政主管部门批准（文件编号：MA 58-65248-2021-26）。使用5至8岁、吻端至尾尖长度≥20 cm的墨西哥钝口螈（axolotls）Ambystoma mexicanum用于骨折手术和截肢手术的墨西哥钝口螈包括雄性和雌性个体。实验所用个体均于分子病理学研究所设施内繁育。通过使用适当的镇痛剂和抗生素来控制疼痛及感染风险，以确保手术成功。本研究中所用试剂与设备列于下文 材料表.
1. 动物准备
- 将动物置于0.03%苯佐卡因溶液中浸泡约15–20分钟，直至完全镇静，用镊子触碰肢体时无反射性运动。
- 将动物腹侧朝下放置在浸有0.03%苯佐卡因溶液的湿纸巾上，并用含苯佐卡因的湿纸巾覆盖其身体。水生动物（如墨西哥钝口螈）的皮肤易干燥，因此必须覆盖体表以防止脱水，并确保皮肤呼吸正常进行。
- 使用环形镊子将待手术的后肢拉直。请勿使用乙醇等消毒剂，因为墨西哥钝口螈的皮肤对化学物质敏感，容易受到刺激。建议使用含50 U/mL青霉素和20 µg/mL链霉素的0.7倍磷酸盐缓冲液（A-PBS）清洗肢体，并在锯骨过程中用于骨组织的冲洗。
注意：墨西哥钝口螈手术通常无需过度担心感染问题。但由于这些动物生活在水中，且缝线位于皮肤表面，我们建议使用抗生素以预防手术部位可能的污染。
2. 手术
注意：所有手术器械均需灭菌。常用的灭菌方法包括干热灭菌、高压蒸汽灭菌，以及用70%乙醇清洗后彻底去除残留酒精，这些方法均适用于本操作。若对多个动物进行手术，可在使用间隙通过高温珠灭菌器或70%乙醇对器械进行灭菌。
- 在后肢大腿上部的股骨上方，用手术刀做一个横向纵向切口（1.5–2 cm），切口应跨越整个大腿。操作前需先触诊骨组织以定位，再切开皮肤。
- 小心地将肌肉和神经从手术部位移开，避免切割。使用弯头镊子以提高操作效率。
- 用弯钳轻轻置于股骨下方，以暴露手术部位。
- 将一块刚性7.75 mm四孔固定板沿股骨干放置，避免接触关节，并用镊子将其固定在对齐的位置。
- 使用四枚2 mm的钛合金螺钉将骨骼固定在接骨板上。
注意：本方案中使用的螺钉结构复杂，由4个部分组成：主体部分（将拧入骨内）、螺钉头部（可使用方形扳手拆卸螺钉和接骨板）、较细的颈部（在螺钉拧紧入骨后作为断裂点）以及螺钉手柄（用于连接螺丝刀和锯导引装置）。 - 螺钉安装顺序至关重要。首先安装内侧螺钉，然后安装两个外侧螺钉，以确保接骨板与骨轴对齐。使用手动钻在骨上钻出第一个孔，以便螺钉顺利插入，随后进行1st 螺钉置入。在骨周径的中点进行钻孔，以避免一侧骨质过薄，导致自发性骨折。钻孔时使用0.7× PBS + 1% 青霉素/链霉素进行灌注。切勿折断1st （可选：1st 和 2nd) 螺丝。
- 将锯导引装置放置于1上st （可选：1st 和 2nd ）螺钉并将其与骨骼和接骨板对齐。
注意：本方案中使用的接骨板、螺钉、锯导引装置和锯片均由同一制造商提供，且经过优化设计以确保相互匹配。锯导引装置有多种规格，可适配不同型号的接骨板和锯片尺寸。 - 使用锯导装置钻孔并插入其余螺钉。确保接骨板与骨骼对齐。折断螺钉的手柄。
- 在股骨下方放置一片经70%乙醇擦拭后高压灭菌或干热灭菌（140 °C，4小时）的塑料薄膜（6–7 mm × 4–5 cm），以防止截骨过程中软组织受损。
注意：可用于此目的的材料包括一段塑料膜，可取自用于热力灭菌的包装袋。 - 将Gigly线锯置于骨骼与保护膜之间。
- 使用0.66 mm的Gigly线锯在股骨上进行切割，形成一条0.7 mm的切口。切割过程中持续用0.7× PBS + 1%青霉素/链霉素冲洗，以最大限度减少组织损伤和摩擦。
- 移除锯子和锯导板，并使用螺丝刀将螺丝的手柄从螺丝上折下。
- 移除保护膜，并用0.7倍PBS + 1%青霉素/链霉素冲洗手术部位。
- 用无菌骨蜡覆盖骨板和螺钉的顶部，以保护皮肤和肌肉免受螺钉边缘的刺激。
- 将肌肉和皮肤放置在骨蜡上。
- 使用7.0合成聚丙烯/聚乙烯缝线，采用单纯间断缝合法关闭切口。使用合成缝线可最大限度减少水源性细菌和真菌的污染。
3. 术后管理
- 为使动物复苏，将其放入含有新鲜人工池水的容器中，并补充50 U/mL青霉素、20 µg/mL链霉素以及镇痛剂布托啡诺（0.5 mg/L水）。
- 观察动物是否开始活动鳃部、产生步态动作并开始游动——通常在手术后1小时内出现。
- 手术后将动物在含50 U/mL青霉素和20 µg/mL链霉素的人工池水中饲养3天，然后再移回饲养缸。为确保镇痛效果，需添加布托啡诺（0.5 mg/L水）。
- 确保缝线保持原位，并观察伤口是否正常愈合。
结果
此处描述的手术过程（图1）持续20至30分钟，需要一名外科医生和一名助手。可选择使用双目解剖显微镜或放大镜系统。
图1手术操作示意图与实验装置示意图。 (A通过解剖皮肤并牵开手术区域的肌肉来暴露股骨。B将一块钛板与股骨对齐。C) 1st 使用手动钻头钻出内孔。 (D) 将一颗螺钉置入 1st 孔。 (E) 将锯导板和钻导板插入并固定到1号手柄上st 螺丝。F其余的螺钉按所示顺序安装。G) 小心移除锯导板和钻导板，由于骨组织相较于螺钉颈部具有更高的刚度，在旋转螺丝刀时螺钉的手柄会随之折断。H将安全箔和Gigly锯置于骨下。I在持续冲洗切割部位的条件下进行截骨术。J) 在用缝线缝合肌肉和皮肤之前，螺钉头部应先用无菌骨蜡覆盖。D,E,F：数字表示钻孔和放置螺钉的顺序。 请点击此处以查看此图的放大版本。
需特别注意钢板与骨的对位及钢板固定步骤（图2）。蝾螈年龄的差异导致股骨在大小、形状和骨化程度上存在轻微差异。因此，在某些情况下，难以找到合适的钢板位置，以确保螺钉固定有足够的空间。总体而言，23.5% 的动物出现了固定失败，这可能是由于较年轻的动物骨骼较窄或骨化程度较低所致。图3）。固定失败导致截骨部位的骨骼错位。可通过观察到螺钉脱落、骨碎片移位以及偏离骨骼轴线的错位现象来识别。 >20°，或明显的侧向移位。前者在取样时即可观察到，而后者可能在进行显微CT分析之前并不明显。在对位良好的肢体中，术后3周骨折间隙内可见肉芽组织；而在对位不良的样本中，肉芽组织明显更大，可能是机体试图稳定骨骼的表现。
图 2：手术过程概览及左后肢截骨术后动物状态。（A）手术主要步骤展示：暴露股骨、正确对齐钛板、使用锯导板并通过手动钻头在骨上钻孔并拧入螺钉、使用保护膜和锯导板（黄色箭头）进行截骨、造成0.7 mm的股骨骨折（白色箭头）、用无菌骨蜡覆盖螺钉头部（紫色箭头），以及最终闭合肢体的结果。（B）术后动物状态。箭头指示接受截骨手术的左后肢。请点击此处查看该图的放大版本。
在缝合皮肤前使用无菌骨蜡（图2）可减少术后固定板上方皮肤的重新裂开。肢体功能得以保留，在麻醉解除后不久即可用于站立和行走。
图3：墨西哥钝口螈钢板固定骨切开术的代表性结果。（A）完整及骨折股骨的显微CT扫描图像。注意骨折后3周骨组织存在间隙。23.5%的肢体出现固定失败，导致骨错位。在成功固定的样本中，骨折后6至9个月可见硬性骨痂形成。（B）完整及骨折股骨的藏红O/亮绿染色图像。注意骨折后3周骨组织间隙中存在肉芽组织。骨折后6个月，硬性骨痂由编织骨和软骨组成。比例尺：1 mm。请点击此处查看该图的放大版本。
显微CT和组织学分析（番红O/固绿染色）可显示骨碎片的位置、骨折间隙大小以及骨愈合状态。显微CT数据采用商用标本扫描仪以10.05 µm的标称分辨率获取，并使用配套软件（见材料表）进行分析，方法参照Polikarpova等人的描述9。与哺乳动物不同，在哺乳动物中相同尺寸（0.7 mm）的骨折术后3–5周即可由软骨性和骨性骨痂封闭，而在墨西哥钝口螈中，术后3周未观察到骨痂形成。通常，软骨性骨痂在术后3个月可见9，而骨化后的骨性骨痂则在术后6个月出现（图3）。
讨论
目前描述的股骨钢板固定与截骨方法可应用于水生动物，例如Ambystoma mexicanum（墨西哥钝口螈）。该手术方法最近被用于比较墨西哥钝口螈骨折愈合与肢体再生过程与小鼠骨折愈合的差异9。与小鼠类似，可使用自断裂螺钉将四孔固定钢板连接至骨骼，并可用Gigly锯制造尺寸均一的骨折15。钢板固定有助于维持骨折间隙大小，并确保骨碎片的正确对位。镇痛方法也通过采用丁丙诺啡浸泡法进行了优化，因其侵入性较小（相较于丁丙诺啡注射），且据报告不会影响骨愈合过程（与卡洛芬不同）。然而，由于目前对两栖类动物总体及术后疼痛管理的认识仍十分有限，建议采用预先镇痛处理作为该手术方案的进一步优化措施。在此方面，可参考其他两栖动物物种中已使用的相关操作规程19。为了更客观地评估动物术后健康状况，建议制定并应用特定评分表，以明确干预措施和人道终点的判定标准。
与小鼠实验方法16不同，在截骨前需使用塑料薄膜保护深层组织。此外，由于蝾螈为水生动物且四肢肌肉不发达，需要在植入板和螺钉上方加用蜂蜡保护贴片，并特别注意使用合成皮肤缝线，因为可吸收缝线（基于聚乙醇酸910）上易形成生物膜。术后治疗中使用青霉素-链霉素以防止伤口和缝线污染。
该方法针对5至8岁、吻端到尾尖长度≥20 cm的墨西哥钝口螈进行了优化，因此仅适用于体型较大且年龄较老的个体。这可能也是导致骨愈合速度慢于哺乳动物的原因，因为这些较老个体的细胞总体增殖速率较低。然而，如果需要解析骨愈合过程中的更精细步骤，这一特点可能具有优势20。该方法的另一个重要特征是实验方案中使用的主要耗材（固定板、螺钉和Gigly锯）均为商业化产品。由于这些器械之间具有优化的兼容性，因此能够制造出大小可靠且距骨端距离恒定的骨缺损。本方案中描述了在墨西哥钝口螈骨骼上应用钛金属板的方法。对于小鼠，已开发出聚醚醚酮（PEEK）塑料板，以方便样品的显微CT成像17。在墨西哥钝口螈中也测试了PEEK板，结果相似；但由于塑料固定板体积略大于金属板，因此只能应用于体型更大的动物。
本研究中使用了5至8岁的动物，在所有手术中观察到23.5%的固定失败率，且较年轻的动物失败率更高。因此，建议使用骨骼骨化程度更高的年长动物。失败率与性别无关，故雌雄动物均适用。在样本量规划时，应预计约20%的样本因不良结果而损失。具体动物数量取决于实验设计及需分析的条件数量；然而，每组建议的最低动物数量应为5只加上20%，即6只动物。
总体而言，该方法相较于先前使用的未固定或邻近骨骼固定的手术方式具有显著改进。此外，利用该方法可以研究体型较大的蝾螈，其骨骼在大小和成熟度上与小鼠研究中使用的骨骼相似。这一点非常重要，因为只有在骨骼骨化程度较高的大型蝾螈中才能进行显微CT成像。
该方法是该领域的一项重要进展，因为它能够实现墨西哥钝口螈肢体再生与骨折愈合的直接比较，并可控制骨缺损大小，实现良好的骨对位（在所进行的手术中，76.5% 达到理想对位）。此外，使用 PEEK 塑料固定板后，可应用显微 CT 和 X 射线对骨愈合过程进行评估。最后，本文所述手术方法可适用于其他水生两栖动物，如蝾螈和青蛙，从而进一步推动骨骨折愈合的跨物种研究。
披露
作者声明无竞争利益。
致谢
作者感谢Sabine Stumpp提供的出色技术支持，以及Lidia Grösser在手术中的协助。本研究由奥地利科学基金（Hertha Firnberg奖学金项目编号T-1219）、欧洲研究委员会（ERC高级资助项目742046 RegGeneMems）和德国研究基金会（DFG CRC 1444）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.66 mm Gigly 金刚石线锯 | RISystem | RIS.590.120 | |
| 7.0 Optilene 缝合线 | 布劳恩 | C3090538 | |
| 苯佐卡因 | Sigma-Aldrich | E1501 | 稀释至0.03% 使用之前 |
| 布托啡诺（Butomidor 10 mg/mL） | Richter Pharma AG | - | 稀释至 0.5 mg/L 使用之前 |
| 0.30 mm 钻头 | RISystem | RIS.590.200 | |
| Dumont #5 镊子 - 标准型/不锈钢 | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 手钻 | RISystem | RIS.390.130 | 最好至少准备3个样本 |
| 微型CT数据分析师 | Bruker，美国马萨诸塞州比勒里卡 | SkyScan NRecon 软件 | |
| 微型CT样本扫描仪 | Bruker，美国马萨诸塞州比勒里卡 | SkyScan 1172 | |
| Moria MC31b 眼科镊 - 光滑，弯曲，10 cm | Fine Science Tools | 11373-12FST | 2 件 |
| MouseFix 钻孔器&Saw 指南 1.75 mm，刚性 | RISystem | RIS.301.102 | |
| MouseFix 四孔刚性板 | RISystem | RIS.401.110 | |
| MouseFix 螺钉，L = 2.00 mm | RISystem | RIS.401.100 | 每根骨需要4个 |
| 窄型镊子 | VWR | FSCI11002-12 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 环形钳 | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| 15号手术刀 | B Braun，赛默飞世尔科技 | 5518032 | |
| 方头扳手 0.50 mm | RISystem | RIS.590.111 | |
| 无菌骨蜡，2.5 g | Ethicon, Johnson &安普和约翰逊 | W810 | |
| 学生用精细剪刀 - 直头/11.5厘米 | Fine Science Tools | 91460-11 |
参考文献
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