本文介绍了一种核转染系统，旨在提高从成年小鼠脑室下区分离获得的扩增神经干细胞（NSCs）的基因递送效率。研究结果表明，该方法显著改善了神经干细胞的基因调控效果，优于传统转染方案，并提高了细胞存活率。
本文内容
摘要
摘要
可以从成年小鼠脑的脑室下区（SVZ）中分离并扩增神经干细胞（NSCs），在添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）作为有丝分裂原的培养基中培养，可形成称为神经球的克隆性细胞聚集体。这种体外（in vitro）系统是研究神经干细胞潜能的重要工具。通过转染携带在质粒中的siRNA或基因，可诱导基因表达的扰动，从而研究神经干细胞的生物学特性。然而，由于中枢神经系统（CNS）细胞的转染效率较低，将外源核酸递送至神经干细胞培养物中具有挑战性。本文介绍一种改进的核转染系统，可在来自成年小鼠SVZ的扩增神经干细胞中实现高效的基因递送。我们证明，这种相对简单的方法显著提高了成年神经干细胞中的基因扰动效率，其细胞存活率超过80%，优于传统的转染方案。此外，该方法也可应用于原代分离的神经干细胞，为通过基因敲低或过表达手段在神经球培养体系中操控基因表达以研究基因功能提供了关键性进展。
引言
神经干细胞（NSCs）是存在于大脑中的多能干细胞。这些细胞具有自我更新的能力，并可分化为三种神经谱系：星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元1。因此，NSCs在哺乳动物的成年神经发生过程中发挥着关键作用，该过程是指在大脑中生成新的神经元2。NSCs主要存在于成年大脑的两个区域，称为神经发生微环境：位于侧脑室壁附近的脑室下区（SVZ）以及海马齿状回内的颗粒下区（SGZ）3,4。在成年小鼠最活跃的神经发生微环境SVZ中，NSCs（也称为B细胞）能够自我更新，并产生过渡性扩增前体细胞（TAPs或C细胞），后者进一步分化为成神经细胞（A细胞）。这些成神经细胞通过吻侧迁移流（RMS）迁移到嗅球（OB），并在那里完全分化为中间神经元，整合到已有的神经环路中3,4,5,6。
理解调控神经干细胞（NSCs）在这些微环境中复杂分子信号与分子提示的相互作用，对于发挥其治疗应用潜力至关重要。为此，已开发出多种方法用于研究该细胞群体，包括神经干细胞的选择性原代培养以及利用表面标志物进行细胞筛选。7,8,9,10本文详细描述了SVZ神经干细胞的分离与培养方法。 体外 使用含有两种有丝分裂原——碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）的无血清选择性培养基。该培养基可促进细胞增殖，并维持从小鼠成年脑室下区（SVZ）获得的神经干细胞的干性 正在形成的大脑 体外 克隆性、三维、非黏附性聚集体，称为神经球9神经球培养为操控和研究影响神经干细胞增殖、自我更新、分化和存活的分子机制及相关因素提供了可控的实验平台。11值得注意的是，培养中形成的一级神经球数量可用于估算侧脑室下区（SVZ）中神经干细胞（NSCs）的数量 体内，使其成为研究不同条件对成年神经干细胞池影响的有力工具12,13此外，一旦原代培养建立，在增殖条件下通过传代培养，神经干细胞（NSCs）可通过对称分裂形成新的细胞团（继代神经球）。14因此，可通过低密度接种二级神经球细胞（克隆形成实验）来评估这些培养物的自我更新能力。4,15,16,17.
尽管神经球在揭示调控神经干细胞机制方面具有潜力，但一些研究者对其有效性提出了质疑 体外 研究结果，认为细胞生长的人工环境可能无法真实模拟复杂的 体内 神经发生微环境18,19,20,21,22另一个有争议的点涉及神经球中观察到的异质性。然而，这种变异性被认为反映了神经干细胞（NSCs）自然发生的对称与不对称分裂。 体内23,24此外，近期的验证研究支持利用神经干细胞（NSC）培养体系来预测脑室下区（SVZ）神经发生微环境中存在的作用机制。 体内 并且多项研究已证明，培养的NSCs 体外 准确维持所观察到的转录组谱型 体内11,25.
因此，神经球培养不仅可用于研究神经干细胞（NSC）的增殖和分化能力，还为研究调控NSC生物学行为的基因功能提供了有效体系。研究NSC中基因功能的关键技术之一是基因表达干扰。通过质粒递送siRNA或基因，可转染至细胞培养物中，从而实现靶基因的表达下调或上调。与利用条件性基因敲除小鼠建立培养体系相比，该方法具有显著缩短实验周期和降低成本的优势，为揭示神经发生过程的遗传机制以及探索潜在治疗策略提供了有力途径。在NSC中改变特定基因的表达，可调控其细胞行为，影响增殖、分化和迁移等关键生物学过程。然而，对NSC（尤其是小鼠神经球中的NSC）进行转染仍面临显著挑战。神经球的三维结构限制了转染效率，常导致外源核酸递送成功率较低，从而制约了遗传操作的范围26,27。此外，转染过程可能对细胞活力和功能产生不利影响27。在此背景下，本文提出采用核转染（nucleofection）系统作为减轻细胞损伤的方法，可在基因递送实验中实现较高的细胞存活率，并确保对NSC培养物进行遗传干扰时具有更高的转染效率。
本手稿旨在阐述从成年个体侧脑室下区（SVZ）神经发生微环境中分离、扩增神经干细胞（NSCs），并通过神经球培养系统对这些细胞进行核转染以干扰目的基因的操作流程。该方法优于传统的转染方案，在靶细胞中表现出显著更高的存活率和更优的基因递送效率。
方案
所有涉及动物的实验均事先获得西班牙巴伦西亚大学伦理委员会批准，并由巴伦西亚自治区农业、畜牧业和渔业部授权。
1. 神经球的原代培养
- 试剂的准备
- 用去离子水配制杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's Phosphate Saline Buffer, DPBS）缓冲溶液，并通过高压灭菌进行灭菌。或者，通过加入137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4, 和 1.8 mM KH2PO4 去离子水中的溶液。
- 用预冷的DPBS填充两块12孔板，并置于冰上：一块用于在解剖前保存完整脑组织，另一块用于保存解剖后至组织处理前的SVZ组织。
- 按如下所述配制含木瓜蛋白酶的酶混合液。
- 在Earl's平衡盐溶液（EBSS）中配制EDTA/L-半胱氨酸解离溶液，终浓度均为0.2 mg/mL。为确保完全溶解，将离心管置于37 °C水浴中孵育。
- 将 12 U/mL 的木瓜蛋白酶溶解于 EDTA/L-半胱氨酸溶液中。每份脑组织使用 500 µL 酶解液。
- 将木瓜蛋白酶溶液置于37 °C水浴中约20分钟，直至酶完全溶解。
- 使用注射器和0.22 µm孔径滤器对酶混合液进行过滤除菌，并于4 °C保存备用。
注意：木瓜蛋白酶在 37 °C 下孵育 30 分钟后被激活，可在 4 °C 下保存 12 小时。
- 按照激素混合溶液的说明制备对照培养基 表1 使用硝酸纤维素0.22 µm孔径滤器过滤除菌。将培养基保存在4 °C，使用前在37 °C水浴中预热。
- 在使用前，通过向对照培养基中添加EGF和bFGF来制备完全培养基，具体操作如下所述 表1不要过滤全部培养基，因为过滤可能导致有丝分裂原丢失。
- 大脑提取与脑室下区解剖
注意：小鼠在实施安乐死前可自由获取食物和饮水。实验使用8至16周龄的C57BL/6小鼠，雌雄均使用，且在制备过程中未观察到性别间明显差异。- 手术前通过高压灭菌对解剖工具进行灭菌。随后将手术刀、镊子、剪刀和刮匙浸入盛有70%乙醇的烧杯中。用70%乙醇彻底清洁所有工作表面。
- 通过 CO 处死小鼠2 过量麻醉后通过颈椎脱位法处死动物。用70%乙醇喷洒头部，以尽量减少脑组织污染的可能性。
- 用剪刀将小鼠头部与身体其余部分分离。沿头尾轴方向，用小剪刀剪开头顶皮肤，直至颅骨完全暴露。
- 用小剪刀沿矢状缝剪开颅骨，暴露脑组织，然后用精细镊子去除颅骨。此步骤中需小心操作，避免损伤颅骨下方的脑组织。
- 使用解剖刀小心地将脑组织从颅骨中取出，并置于含有冷DPBS的12孔板中。将12孔板置于冰上，直至完成解剖。
- 将整个大脑转移至用于解剖的硅胶垫上，并在大脑表面滴加数滴冷的DPBS图1A).
- 使用解剖刀切除位于脑前部的嗅球以及位于后部的小脑，保留包含两侧侧脑室的脑中央部分图1B).
- 沿正中纵裂将大脑分为两个半球，然后分别对两个半球进行解剖图1C).
- 使用一侧半脑，重新调整其方向，使内侧区域朝上。沿胼胝体切开脑组织，将皮层和纹状体与海马、隔区及间脑分离，从而暴露侧脑室。图1D).
注意：侧脑室下区（SVZ）位于脑室腔与纹状体之间，因此后续步骤旨在尽可能准确地从周围组织中分离出SVZ。 - 按照脑室的腹侧边界切除海马、隔区和间脑（图1E，F），SVZ头端和尾端以外的组织（图1G)，以及沿胼胝体分布的皮层图1H，I).
- 将组织倾斜，使SVZ面向侧面（图1J)，从而允许去除位于室下区（SVZ）下方的纹状体组织（图1K) 以获得含有神经干细胞（NSCs）的薄层组织（图1L).
- 将同一只小鼠的两个解剖获得的SVZ组织置于含冷的无菌DPBS的12孔板中储存，直至开始组织处理。
注意：从一个脑组织中分离双侧脑室下区（SVZ）的操作应在10分钟内完成。操作时间过长可能影响细胞活力。若需要提高培养细胞的产量，可合并来自相同年龄、性别、遗传背景和基因型的多只小鼠的SVZ组织。
- 神经干细胞的分离与接种
- 将每个SVZ切成4-5个小块，以促进组织的分散。
注意：从这一步开始，整个操作必须在超净工作台内的无菌条件下进行。 - 使用无菌塑料巴斯德吸管将切碎的SVZ组织转移至15 mL离心管中，确保培养板内无残留组织碎片。
- 让组织沉降到管底，然后移除剩余的DPBS。
- 每脑（2个SVZ）加入500 µL含木瓜蛋白酶的过滤酶混合液，将试管置于37 °C水浴中孵育30分钟。
- 孵育后，向每个样品中加入5 mL预热至37 °C的对照培养基。
- 将样品在300 x g 5 分钟后，使用微量移液器或真空泵小心吸去上清液。
- 加入1 mL对照培养基，使用经火焰抛光的巴斯德玻璃移液管，轻轻反复吹打10至20次，将沉淀物充分机械分离，直至获得均匀的细胞悬液。
注意：此步骤是本实验方案中最关键的步骤之一，因为消化过度或不足均会对接种培养物的得率产生不利影响。 - 加入4 mL对照培养基，通过倒置混匀以洗涤细胞。在300 x g条件下离心 g 5 分钟后，移除上清液。
- 加入1 mL完全培养基，用移液器上下吹打10次，重悬细胞沉淀，使细胞悬液均匀。
- 使用血细胞计数板在显微镜下计数细胞悬液，计数前将细胞悬液等体积与台盼蓝稀释；或使用自动细胞计数仪进行计数。确保细胞培养物已充分解离至单细胞水平。
- 细胞悬液制备完成后，将获得的细胞均匀接种至48孔板的8个孔中，每孔终体积为500 µL完全培养基。
注意：我们通常从两个SVZ中获得20,000个细胞，最终接种密度约为2,500个细胞/mL，以在培养中达到最大产量。
- 将每个SVZ切成4-5个小块，以促进组织的分散。
- 神经球形成
- 孵育细胞5至7天 体外 （DIV）在37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中培养2在此条件下，分化细胞死亡，而神经干细胞（NSCs）和前体细胞在有丝分裂刺激下增殖，形成被称为原代神经球的克隆性聚集物。
注意：可使用 EGF 或 bFGF 任一因子诱导神经球形成。然而，这两种生长因子并非完全可相互替代。 - 使用倒置显微镜连接的相机检查神经球的大小，当神经球达到50至100 µm的尺寸范围时，在10倍放大倍数下计数孔中形成的所有原代神经球。所形成的原代神经球总数可作为侧脑室下区（SVZ）生态位中神经干细胞（NSCs）数量的估算指标。
- 经过10天培养后，收集每孔的培养基以开始传代。在5天后进行后续传代 至7天，但需注意，原代球体可能需要稍长时间才能达到传代所需的理想大小（约100 µm）。
- 孵育细胞5至7天 体外 （DIV）在37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中培养2在此条件下，分化细胞死亡，而神经干细胞（NSCs）和前体细胞在有丝分裂刺激下增殖，形成被称为原代神经球的克隆性聚集物。
表1：培养基溶液。 本文描述了对照培养基的配方。需配制一种预混合的激素混合溶液。如文中所示，可预先配制各激素的储备液，并于-20 °C保存。在进行细胞培养前，向对照培养基中添加EGF和bFGF，以制备完全培养基。表中列出了各组分的储存条件、储备液浓度及工作浓度。请点击此处下载该表格。
2. 神经球培养物的扩增
- 神经球传代
- 从多孔板中收集含有神经球的培养基，并转移至15 mL离心管中。通过用数毫升DPBS冲洗孔板 ，确保尽可能多地回收细胞。
- 以300 × g离心神经球5分钟，随后弃去上清液。
- 向沉淀中加入200 µL酶解液（参见材料表），轻轻敲击管底以松动沉淀。在室温下孵育10分钟，以促进神经球解离。
- 加入1 mL对照培养基以终止酶反应，并使用P1000移液器上下吹打10至20次，通过机械方式解离神经球。
- 再加入4 mL对照培养基，通过反复颠倒混匀以洗涤细胞。
- 以300 × g离心细胞5分钟，随后弃去上清液。
- 加入1 mL完全培养基，通过上下吹打10次重悬沉淀，使细胞悬液均匀混合。
注：若原始神经球数量和体积过大，可加入更多完全培养基稀释细胞悬液，以确保细胞计数的准确性。 - 取部分细胞悬液与台盼蓝按1:2比例稀释后，使用血细胞计数板（Neubauer计数室）进行细胞计数，或使用自动细胞计数仪完成计数。
- 为扩增细胞培养，将细胞以10,000个细胞/cm2的密度接种至合适的培养板或培养瓶中，并加入完全培养基（参见表2）。
- 将细胞置于37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中孵育5至7天，每次传代均如此。
注：神经球培养物可通过反复传代持续扩增和传代，传代次数不超过10代，且不改变其增殖能力。培养时可单独使用EGF或bFGF；但只有在EGF存在条件下，才能实现长期扩增。
- 自我更新能力检测
- 神经球培养物传代后，将1,000个单细胞接种至96孔板中，用完全培养基补足至终体积200 µL，使培养物终浓度达到5个细胞/µL。
注：接种的细胞数量应尽可能准确。必要时，可制备中间稀释液，以确保接种前细胞悬液体积可靠。此外，建议每种条件设置4至5个重复，以减少技术误差。 - 将细胞置于37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中孵育5天，或直至神经球达到合适大小（60至100 µm）。避免移动或震荡多孔板，以防神经球聚集。
- 神经球形成后，使用配备相机的倒置相差显微镜计数每孔中形成的神经球数量。自我更新能力检测可分别使用EGF或bFGF进行。
- 神经球培养物传代后，将1,000个单细胞接种至96孔板中，用完全培养基补足至终体积200 µL，使培养物终浓度达到5个细胞/µL。
- 神经干细胞（NSC）培养物的冷冻保存
注：神经球培养物可冷冻保存以备将来使用，从而减少所需实验小鼠数量。建议在不超过第10代时进行冻存。- 为进行细胞冻存，将1 mL含完全培养基的细胞悬液转移至标记妥当的冻存管中。
- 向细胞悬液中加入二甲基亚砜（DMSO），使其终浓度为10%，并通过反复颠倒轻柔混匀。
注：DMSO作为冷冻保护剂，但对细胞具有毒性，因此该步骤应迅速完成。 - 将冻存管放入-80 °C冰箱中，使用可实现每分钟降低1 °C的程序降温盒。这种逐步降温过程可防止冷冻过程中冰晶形成导致的细胞损伤。长期储存时，应将冻存管置于-196 °C液氮罐中。
- 神经干细胞（NSC）培养物的复苏
注：需要时可将冻存细胞复苏，并重新扩增用于实验。- 从液氮储存罐中取出含有冻存NSCs的冻存管，立即放入37 °C水浴中，直至完全融化，约需5分钟。
警告：必须尽量缩短水浴时间，因为DMSO具有毒性，可能影响细胞活力。 - 迅速将解冻后的细胞转移至含有5 mL预热对照培养基的15 mL离心管中。
- 以300 × g离心5分钟，弃去上清液。加入1 mL完全培养基，通过轻柔吹打10次重悬沉淀，使细胞悬液均匀混合后再进行接种。
注：复苏过程可能影响细胞活力，因此建议在用于新实验前至少传代一次。
- 从液氮储存罐中取出含有冻存NSCs的冻存管，立即放入37 °C水浴中，直至完全融化，约需5分钟。
- 支原体检测
注：支原体污染会影响细胞健康，改变细胞生长速率。因此，支原体检测对于确保实验的完整性和可靠性至关重要。- DNA提取
- 收集至少100 µL细胞培养物用于DNA提取。上清液和细胞沉淀 均可用于DNA提取。提取前将样品保存于-20 °C。
- 穿刺管盖，在金属浴中于99 °C煮沸15分钟。
注：穿刺管盖可防止高温煮沸时管盖爆开。 - 以16,900 × g离心5分钟。将含有DNA的上清液转移至新管中。DNA样品保存于-20 °C，直至进行PCR检测。
- 支原体检测PCR
- 配制PCR反应体系：无核酸酶水8.9 µL、5×反应缓冲液3 µL、25 mM MgCl2 1.2 µL、2.5 mM dNTPs 0.25 µL、Taq DNA聚合酶0.15 µL，以及每种支原体特异性引物（10 µM）各0.25 µL（正向引物Fw：5'GATGTTTAGCCGGGTCGAGAG3'，反向引物Rv：5'GATGTCAAGAGTGGGTAAGGTT3'）。
- 加入1 µL基因组提取DNA。在超净台中配制PCR体系，以防止DNA污染。
- 在PCR仪中进行扩增反应：95 °C预变性5分钟；随后进行35个循环：95 °C变性30秒，53 °C退火1分钟，72 °C延伸30秒；最后72 °C终延伸5分钟。
- 为确定扩增条带大小（约500 bp），取15 µL PCR产物与3 µL 6×上样缓冲液混合，加载至2%琼脂糖凝胶中，在100 V电压下电泳40至50分钟。
- DNA提取
表2：培养中使用的培养板和培养瓶。 提供了最常用的接种培养板和培养瓶的尺寸与体积。该表列出了每种容器的直径、生长面积和培养基体积，并举例说明了在扩增条件下接种的神经干细胞数量（10,000 个细胞/cm2）。请点击此处下载该表格。
3. 神经球培养物的核转染
- 试剂准备
- DNA 制备
- 在 1.5 mL 离心管中准备 25 µL 感受态 E. coli DH5α 细胞用于转化。
- 向细胞中加入 1 µL 目的质粒（浓度为 100 至 200 ng/µL），并在 42 °C 下进行 45 秒的热激处理。此处使用的质粒包含一段用于沉默 Snrpn 表达的短发夹（sh）RNA，以及一个对照质粒 shSCRAMBLE。
注意：整个操作过程中应将感受态细胞保持在冰上，以维持其转化效率。 - 将转化后的细胞涂布于含有适当抗生素的 LB 琼脂平板上，并在 37 °C 下培养 18 小时。将培养皿倒置，防止因冷凝形成液滴而影响细菌菌落生长。
注意：在 LB 培养基中添加适当的抗生素，以确保仅转化成功的细菌能够生长。 - 使用无菌移液枪头挑取单个细菌菌落，转移至先前装有 250 mL LB 培养基的锥形瓶中，以启动液体培养。避免挑取位于较大目标菌落周围的小型卫星菌落，因其可能未成功携带目标质粒。
- 将锥形瓶置于摇床中，在 37 °C 下剧烈振荡过夜培养。
- 使用无内毒素大提试剂盒，按照制造商说明书从细菌培养物中提取高纯度质粒 DNA。用适量的无内毒素水重悬 DNA，获得 1 至 2 µg/µL 的质粒浓度。
注意：大提产量取决于菌体生长情况。通常将质粒 DNA 沉淀重悬于 200 µL 体积中即可达到所需浓度。 - 将含有质粒 DNA 的离心管储存于 -20 °C 待用。另准备一个 1.5 mL 离心管，其中加入最终体积为 5 µL、含 2 至 6 µg 用于核转染的质粒 DNA。
- 材料准备
- 配制核转染溶液。若使用推荐试剂盒（见材料表），则为每次核转染在 1.5 mL 离心管中准备 95 µL 核转染液。移液器和比色杯通常随试剂盒提供。每种核转染条件各准备一套。
- 为每种实验条件准备一个装有 4 mL 预热完全培养基的 T25 培养瓶，并将其置于培养箱中备用。
- DNA 制备
- 神经干细胞（NSCs）的核转染
- 每种实验条件使用 1 至 2 × 106 个单细胞进行检测。将细胞在 300 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。
- 加入 1 mL DPBS，通过上下吹打 10 次重悬细胞沉淀，确保形成均匀的细胞悬液。
- 重复离心（步骤 2.1.6）进行第二次洗涤，最后将细胞沉淀重悬于 95 µL 核转染液中。
注意：洗涤步骤至关重要，可去除对照培养基中的抗生素，确保核转染效率。 - 将 95 µL 细胞悬液与预先混合的 5 µL 质粒溶液（共 2 µg）混合，用于核转染。
- 使用 P200 微量移液器将上述混合液转移至比色杯中，并将其放入核转染仪设备内。
- 使用核转染系统优化的 NSC 程序对细胞进行核转染。
- 电穿孔完成后，使用试剂盒提供的巴斯德吸管小心向比色杯中加入预热的完全培养基。随后将比色杯内容物转移至预先准备好的、含有预热完全培养基的 T25 培养瓶中。电穿孔后可能出现细胞死亡、DNA 沉淀及黏稠聚集体的形成。应避免将这些物质转移至 T25 培养瓶，以免降低细胞存活率。
注意：此步骤至关重要，应尽快完成，以确保较高的核转染效率和后续培养的细胞存活。 - 将核转染后的细胞置于 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中培养 3 至 5 天。
- 核转染细胞的筛选
- 策略 A：基于荧光激活细胞分选（FACS）的流式细胞术筛选
- 核转染后 3 至 5 天，按照步骤 2.1 传代培养核转染细胞，并收集所有获得的单细胞悬液。
- 通过 40 µm 细胞筛过滤样品以去除细胞聚集体，并使用流式细胞仪进行分析。
注意：为获得可比较的结果，每种实验条件必须分选相同数量的细胞。 - 利用流式细胞仪软件，根据两个参数对活细胞设门：前向散射光（FSC-A）反映细胞大小，侧向散射光（SSC-A）反映细胞内部复杂性。选择具有高 FSC-A 和高 SSC-A 特征的活细胞群体。
注意：可选步骤，在分选前向细胞悬液中加入 0.1 µg/mL 的 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），以便在设门时排除死细胞和凋亡小体。 - 通过绘制 FSC-A 与 FSC-H 参数图排除细胞双联体和三联体。选择位于图中对角线上的事件，代表单个细胞。
注意：当细胞通过激光时，流式细胞仪会检测随时间变化的电压信号。FSC-A 表示信号面积，FSC-H 表示信号峰值高度。单个细胞的 FSC-A 与 FSC-H 呈比例关系（位于图中对角线上），而细胞聚集体由于信号持续时间更长，其 FSC-A 相对于 FSC-H 更大。 - 根据所用质粒编码的报告基因的荧光强度筛选核转染细胞。例如，当使用 GFP+ 细胞时，可根据 FITC-A 荧光信号与 SSC-A 的散点图进行分选。
- 分离每种条件下所需数量的目标细胞，并直接收集至装有 完全培养基的收集管中。
- 以 10,000 个细胞/cm2 的密度接种核转染的 NSCs。将分选后的细胞培养物置于 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中培养。
- 策略 B：利用质粒编码的抗生素抗性进行筛选
- 核转染 48 小时后，加入适当浓度的抗生素以筛选抗性细胞。
注意：在开始前，建议在未核转染的细胞中测试多种抗生素浓度。最佳浓度应为能够完全清除所有非抗性细胞的最低浓度。例如，我们确定 NSC 培养物中抗生素杀稻瘟菌素（blasticidin）的最佳浓度为 4 µg/mL。 - 将细胞置于 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中培养 48 小时。
- 抗生素处理 48 小时后，按照步骤 2.1 对核转染细胞进行传代培养。若神经球仍较小，可通过在 300 × g 条件下离心 5 分钟去除培养基中的抗生素。重悬细胞后，仅使用完全培养基在培养瓶中继续培养。将细胞置于 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中培养，直至可按步骤 2.1 进行扩增。
- 核转染 48 小时后，加入适当浓度的抗生素以筛选抗性细胞。
- 策略 A：基于荧光激活细胞分选（FACS）的流式细胞术筛选
结果
最佳培养条件可实现成年SVZ来源的NSC的分离与扩增 体外
源自成年SVZ的NSC培养物已被用作一种有价值的 体外 研究调控神经干细胞（NSCs）在其特定微环境中的分子机制和生态位信号的方法。本论文所述的神经球实验用于检测成年小鼠侧脑室下区（SVZ）中的NSC数量。分离3月龄小鼠脑组织中的SVZ组织，进行解离后，在添加EGF和bFGF或单独添加任一因子的完全NSC培养基中进行培养。培养10天后 体外 （体外培养天数），采用相差显微镜对这三种不同培养条件下形成的一级球体总数进行定量分析图2A，B）。值得注意的是，我们的研究结果表明，EGF的存在可促进初级球体形成达到最大量，这一点从仅添加bFGF的培养体系中初级球体数量减少的现象中得以明显体现图2A，B）。为了评估不同培养基条件下神经干细胞（NSCs）的自我更新能力，将细胞进行传代并以低密度接种（5个细胞/µL) 在添加了上述有丝分裂原组合的培养基中。继发性神经球定量结果显示，SVZ 神经干细胞需要至少 EGF 才能有效进行自我更新，而 EGF 与 bFGF 联合使用可增强细胞的自我更新能力（图2B此外，为了详细分析在不同培养基条件下细胞的生长动态，记录了连续7次传代过程中接种和获得的细胞数量。在不同培养基条件下获得的生长曲线证实，添加EGF或EGF与bFGF联合添加的培养体系，其细胞生长动态优于仅添加bFGF的培养体系。图 2C). 综上所述，这些发现证实了同时使用 EGF 和 bFGF 可提高神经干细胞培养的产量 体外
为了研究不同出生后年龄段侧脑室下区（SVZ）中神经干细胞（NSC）的数量，并评估小鼠衰老对神经球培养效率的影响，我们分离了从1个月至12个月龄小鼠的SVZ组织。值得注意的是，研究结果表明，随着年龄增长，初级神经球的数量显著下降，在2至4个月龄时神经球数量达到最高，培养效率最优（图2D）。此外，为了评估NSC在连续传代过程中的自我更新能力，我们对2至4个月龄小鼠来源的NSC进行了传代培养，并在完全培养基中以克隆密度（5个细胞/µL）接种。对后续传代中次级神经球数量的定量分析显示，随着传代次数增加，培养效率显著降低（图2E）。基于上述所有观察结果，建议在早期传代阶段进行自我更新能力检测，以进一步优化NSC的培养条件。
核转染是一种在成体神经干细胞中高效调控基因表达的技术
鉴于神经干细胞（NSCs）不易转染，为了调控基因表达，本文介绍了一种核转染方案，该方法具有较高的基因递送成功率，且无需使用病毒转导。在分离并培养2至4月龄小鼠的单个侧脑室下区（SVZ）后，按照所述方法，将携带GFP的质粒核转染至NSCs中图 3A) 转染后2天检测GFP阳性细胞，结果显示转染效率在30%至50%之间，与先前文献报道一致28为特异性分离成功转染的NSCs，根据核转染后3至5天的GFP荧光强度，通过FACS对细胞进行分选。图3A-C）。约40%的FACS前分析细胞表现出高水平的GFP荧光，随后通过分选被选出。图3C). 分选后GFP的重新接种+ NSCs 显示所有细胞均为 GFP 阳性，验证了基于核转染的细胞分离方法（图3D值得注意的是，经过核转染的神经干细胞在后续传代中仍保持了活力，证实了成体神经干细胞进行核转染的可行性。这些结果强调了结合核转染与荧光激活细胞分选技术建立纯化修饰神经干细胞培养体系的有效性。
以成年神经干细胞（NSC）中的基因调控为例，本研究采用短发夹（sh）RNA核转染技术实现基因表达抑制。具体而言，将靶向小核核糖核蛋白多肽N（Small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N, Snrpn）基因并携带CAG-GFP报告系统的shRNA（shSNRPN）核转染至来源于2月龄小鼠的NSC培养物中。qPCR和免疫细胞化学检测证实，与对照组shSCRAMBLE质粒相比，转染shSNRPN质粒的细胞中Snrpn表达显著下调（图3E、F）29。为阐明Snrpn下调对NSC自我更新能力的影响，在核转染细胞中进行了低密度培养实验（图3F、G）。对核转染培养物中继代神经球的定量分析显示，Snrpn表达下调可增强神经球形成能力（图3G）。该实验不仅验证了核转染技术在成年NSC中调控基因表达的有效性，更进一步明确了Snrpn在维持成年NSC干性中的关键作用。
图1：SVZ解剖的详细说明。（A）取出小鼠脑组织后，将整个脑组织用DPBS转移至硅胶垫上进行解剖。（B）使用解剖刀切除嗅球和小脑。（C）将脑组织分为两个半球，以便分别进行解剖。（D）沿胼胝体切开脑组织，使皮层和纹状体与海马、隔区及间脑分离，从而暴露侧脑室。（E-F）沿脑室腹侧边界切除海马、隔区和间脑。（G-I）沿胼胝体切除SVZ头端和尾端以外以及皮层的组织。（J-K）将组织倾斜，使SVZ朝向侧面，以便去除SVZ下方的纹状体组织。（L）获得一块含有SVZ的薄层组织。黑色虚线表示切割位置，黑色点线表示每一步中SVZ的位置。缩写：OB = olfactory bulb；CB = cerebellum。A-H图中的比例尺：5 mm；I-L图中的比例尺：3 mm。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）均是神经干细胞体外培养与扩增所需的有丝分裂原 体外. (A) 在添加 EGF 和 bFGF 或单独添加每种有丝分裂原的 NSC 培养基中，原代和继代神经球培养物的相差显微镜图像。 (B) 每只小鼠及每孔中根据培养基中促有丝分裂原成分获得的原代球体数量：无促有丝分裂原（灰色，n=9）、EGF+bFGF（蓝色，n=33）、仅EGF（绿色，n=20）或仅bFGF（粉色，n=19；左图）。低密度（5个细胞/μL) 每孔，依据培养基中的有丝分裂原成分：无有丝分裂原（灰色，n=11）、bFGF（粉色，n=18）、EGF（绿色，n=18）或 EGF+bFGF（蓝色，n=37；右图）。采用Kruskal-Wallis检验结合Dunn事后分析。C) 生长曲线显示在含有不同有丝分裂原的培养基中，经过8次传代后各个神经球培养物形成的总细胞数：bFGF（粉红色，n=5）、EGF（绿色，n=5）或EGF+bFGF（蓝色，n=10）。采用线性回归分析. (D) 来自不同出生后发育阶段小鼠的原代神经球数量，这些神经球由单只小鼠解剖并解离获得。采用线性回归分析。n 值见括号内。E) 低密度（5个细胞/µL通过后续传代 体外 以评估其自我更新能力。采用Kruskal-Wallis检验，p值已标出：*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001；****：p<0.0001。n.s：无显著性差异。误差线表示标准误（SEM）。A 中的比例尺为 100 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图3核转染过程及基于FACS的核转染细胞分选示意图。 (A) 核转染过程及基于FACS的核转染细胞筛选流程概述。1) 将质粒DNA溶液与核转染溶液混合后加入细胞中，将此混合液转移至电转杯进行核转染。2) 将含有DNA和细胞的电转游戏副本插入核转染仪中，施加电击。对于从成年SVZ分离的神经球培养物，推荐使用A-031 NSC程序。3) 核转染后，将细胞转移至含有添加EGF和bFGF的完全培养基的培养瓶中。4) 通过FACS根据质粒DNA中携带的报告基因表达情况对细胞进行分选。5) 分选后的细胞进行进一步培养，用于后续实验。(B基于FACS的转染后NSCs筛选策略与设门方法。首先，根据较高的FSC-A和较高的SSC-A选择活细胞（左图），然后通过分析FSC-A与FSC-H参数排除细胞双联体和三联体（右图）。C基于GFP表达对核转染细胞进行FACS设门（SSC-A 对 FITC-A 荧光）。D相差显微镜与GFP荧光图像显示核转染前（n=3）和核转染后经FACS筛选（n=4）的NSCs（左图）。核转染后GFP阳性细胞的百分比+ 细胞在FACS分选前后的状态如右侧面板所示。采用t检验进行分析。E) 定量PCR（qPCR）分析 Snrpn 增殖的NSCs经核转染后的表达 Snrpn特异性shRNA（n=4）。以使用SCRAMBLE shRNA进行核转染作为对照（n=4）。采用t检验进行分析。F) 免疫细胞化学图像显示NSCs在shRNA核转染7天后SNRPN的表达（红色，外侧图板）。使用DAPI对DNA进行复染。代表性图像显示由shSNRPN和shSCRAMBLE条件下NSCs衍生的神经球（中间图板）。G) 对转染shSNRPN（n=8）或shSCRAMBLE（n=8）后神经干细胞培养中形成的神经球数量进行定量分析。采用t检验，p值如下：*: p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001；****：p<0.0001。n.s：无显著性差异。误差线表示标准误（SEM）。D中的比例尺， 10 µm；在 F 中， 100 µm （F 中的高倍图像， 7 µm). 请点击此处以查看此图的放大版本。
讨论
由于缺乏明确的标志物来鉴定神经干细胞群体 体内，对神经干细胞的分析主要基于观察从神经发生微环境中分离出的细胞的行为 离体 条件下。Reynolds 和 Weiss 的开创性工作通过建立精确的培养条件，奠定了研究基础，使得能够在无黏附条件下从年轻成年（2月龄）小鼠侧脑室下区（SVZ）组织中分离并扩增单个细胞。这些细胞通常在含有 EGF 和 bFGF 的无血清培养基中传代培养，该培养条件可完全抑制其向神经元和胶质细胞分化，同时促进细胞增殖。事实上，在这些培养条件下9，大多数细胞在培养的最初几天内死亡，但有一小部分细胞开始分裂并主要形成漂浮的神经球9酶解消化和传代培养这些细胞聚集体有助于细胞培养物的扩增，表明这些培养物具有自我更新能力。
值得注意的是，仅添加EGF的神经球培养物表现出扩增潜能，而仅在含有bFGF的培养基中培养的NSC则未表现出长期的细胞增殖30两项证据均表明EGF是神经干细胞自我更新的主要有丝分裂原。然而，培养基中同时存在EGF和bFGF可增强神经干细胞的自我更新能力31，以及有助于平衡向星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的分化潜能32,33,34,35此外，使用明确配比的激素和因子混合物替代商业添加剂来补充培养基，可确保神经干细胞（NSC）培养的高质量和可重复性。在这些条件下，小鼠NSC培养物可作为稳定细胞系长期维持，而无需经历永生化过程。然而，神经球培养中的一个担忧是增殖性细胞群体可能发生遗传转化，绕过细胞周期调控机制，从而导致永生化表型的出现。因此，尽管神经球培养具有高度扩增潜力，但培养代次超过10代后 体外 传代细胞通常不用于研究，因为它们可能发生复制性衰老，并出现染色体含量异常或生长动力学不规则的细胞。此外，长期建立的神经球培养物必须持续监测。神经球培养还可在受控环境中考察其特性和潜能，提供比体内更精确、可调节的实验条件，且该体系更易于调控和准确监测。 体内通过克隆形成或群体分析 体外可以定量评估这些细胞的自我更新和增殖能力，从而有助于揭示调控这些特性的潜在机制。
然而，尽管使用NSCs具有诸多优势 体外然而，该培养方案的特性以及神经干细胞（NSCs）的敏感性为该领域带来了一定挑战。例如，在典型解剖过程中产生的原代神经球数量会因实验人员的技术熟练程度和操作精度而存在显著差异。来自2月龄小鼠侧脑室下区（SVZ）的原代神经球实验结果表明，所获得的原代神经球数量可在500至3000个之间波动。多种因素可能导致这种变异性：首先，精确的解剖操作可最大限度减少非目标实质组织的混入，而这些组织会抑制原代神经球的形成；其次，将SVZ组织切成较小碎片有助于实现高效的酶消化和吹打重悬，从而减少细胞损失。这凸显了在建立神经球培养体系时，充分练习解剖方案并精细优化组织处理流程的必要性。
这些培养方法的另一个局限性在于，神经球可能同时包含神经干细胞（NSCs）和前体细胞，使得在原代培养物中难以区分这两个细胞群体。尽管已有报道称GFAP、Nestin、Musashi和SOX2等多种标志物在NSCs中表达8，但这些标志物均未被证实为NSCs所特有。近年来基于细胞表面抗原表达的流式细胞分选（FACS）技术发展，使得NSCs及其子代细胞的分离成为可能。这些研究显示，过渡性扩增前体细胞在传代后无法形成神经球25,36。因此，尽管室管膜下区（SVZ）细胞与神经球起始细胞之间的关系仍需进一步明确18,19,20,21,22,23，但神经球能够在长期培养中连续传代的能力，可能反映了培养物中存在NSCs。
这种神经球培养系统已成为研究信号通路和基因表达在体外维持神经干细胞（NSC）自我更新能力方面作用的可靠模型in vitro15,29。探索这些方面的其中一种方法是转染神经干细胞，以实现特定基因的过表达或敲低。该过程可通过多种技术实现，包括病毒和非病毒方法。尽管病毒载体通常具有较高的基因转导效率，但其存在重要局限性，例如对安全性要求高且载体构建耗时26。相比之下，传统的转染方法（如脂质体转染和电穿孔）转染效率极低，难以适用于难转染细胞。核转染技术通过将细胞类型特异性的核转染溶液与每种细胞类型独特的电参数相结合，提供了一种操作简便的方法37,38。该技术可将DNA直接导入细胞核39，实现不依赖于细胞周期的DNA整合。因此，核转染成为转染诸如小鼠神经干细胞等难转染细胞的一种可行技术28,40。
该方法的一个局限性是，每次核转染建议且至少需要 2 × 106 个细胞，尽管在理想条件下，单次核转染可使用较少数量的细胞（例如，5 × 105 个细胞）。该方法的另一个缺点是，用于核转染的 DNA 质量和浓度会显著影响基因转导效率。强烈建议使用无内毒素制备的 DNA，以避免因内毒素存在而导致细胞死亡率升高。此外，核转染时使用的总 DNA 量超过 6 µg 会显著降低基因转导效率和细胞存活率。最后，电脉冲的施加对于核转染后细胞的存活也至关重要。
在本研究中，我们示范了对 Snrpn 通过使用附加体质粒下调基因表达的策略来研究基因表达。这些质粒不会整合到细胞基因组中，且随着神经干细胞持续增殖 体外，引入的DNA会随着细胞分裂而逐渐被稀释，从而失去遗传操作的效果。因此，该策略适用于研究短期内急性改变的影响，或用于标记细胞的生成时间 体外评估基因扰动更持久效应的一些替代方法是可用的。例如，可使用基于转座子的piggyBAC整合系统。该系统包括将含有目的编码序列的质粒（其两侧带有可转座序列）导入细胞，同时与含有转座酶编码序列的质粒共进行核转染。41或者，也可使用转座子或CRISPR/Cas系统.
转染技术的进一步发展将是实现高通量检测以评估不同基因在成体神经干细胞生理功能中作用的重要一步。结合日益精细的纯化与扩增方法，这些研究将有助于深入理解 体外 成体神经干细胞的生物学特性及悬浮神经球与神经干细胞之间生物学差异的比较 体内.
披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本工作获得了来自Ministerio的资助 由西班牙科学与创新部及国家研究局（MCIN/AEI）（项目编号：PID2019-110045GB-I00；PID2022-142734OB-I00 和 EUR2023-143479）资助 SRF。EJV（FPU20/00795）和 DSL（FPU22/03797）由西班牙教育部门 FPU 项目资助。́n de Profesorado Universitario 项目（FPU）资助。LLC（PRE2020-094137）和 JDM（PREP2022-000680）由西班牙 Formación de个人研究人员（FPI）奖学金项目资助。CMM（CIACIF/2022/366）由巴伦西亚自治区政府资助。MIL（CPI-22-481）由INVESTIGO奖学金项目（下一代欧盟）资助。开放获取出版费用由科学与创新部提供。́n.
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 μm 孔径滤膜瓶 (250 mL) | VWR | 514-0330P | |
| 0.22 μm 孔径滤膜瓶 (500 mL) | VWR | 514-0332P | |
| 12 孔板 | LabClinics | PLC30012 | |
| 15 mL 离心管 | Fisher | 10738771 | |
| 24 孔板 | LabClinics | PLC30024 | |
| 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 (HEPES) | BioWest | L0180-100 | |
| 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| 48 孔板 | ThermoFisher | 150687 | |
| 6 孔板 | LabClinics | PLC30006 | |
| 96 孔板 | Labclinics | PLC30096 | |
| Accutase 溶液 | Sigma | A6964-100ML | 亦称为酶解溶液 |
| Amaxa 小鼠神经干细胞核转染试剂盒 | Lonza | VPG-1004 | |
| Amaxa Nucleofector Iib | Lonza | 10700807 | |
| 抗生素/抗有丝分裂剂 (A/A) | Sigma | A5955 | |
| 去铁转铁蛋白 (Apo-t-Transferrine) | Sigma | T2252-1G | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) | Sigma | F0291 | |
| 杀稻瘟菌素 (Blasticidin) | Sigma | 203350 | |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Sigma | B4287-25MG | |
| 40 μm 细胞滤筛 | LabClinics | PLC93040 | |
| 脱氧核苷三磷酸 (dNTPs) | NZYTech | MB08701 | |
| 二甲基亚砜 (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 (DPBS) | Gibco | 14080-055 | |
| Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) F12 1:1 | Gibco | 11320-074 | |
| E. coli DH5α 感受态细胞 | ThermoFisher | EC0112 | |
| Earle's 平衡盐溶液 (EBSS) | Gibco | 24010-043 | |
| 表皮生长因子—人重组 (EGF) | Gibco | 53003-018 | |
| 乙二胺四乙酸 (EDTA) | Sigma | E-6511 | |
| 精细镊子 | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| 精细锐利剪刀 | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| 葡萄糖 | Sigma | G-7021 | |
| GoTaq G2 Flexi DNA 聚合酶 | Promega | M7805 | 试剂盒包含 PCR 所需试剂 |
| 肝素 | Sigma | H-3149 | |
| 胰岛素 (Insuline) | Sigma | I6634 | |
| LB 琼脂 (Lennox) | LabKem | AGLB-00P-500 | |
| LB 肉汤 (Lennox) | LabKem | LBBR-00P-500 | |
| L-半胱氨酸 | Sigma | C-8277 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030-024 | |
| 血球计数板 (Neubauer) | Blaubrand | BR718620 | |
| 无核酸酶水 | Labbox | WATR-00A-10K | |
| NZYMaxiprep 内毒素去除试剂盒 | NZYTech | MB39901 | |
| 冻干木瓜蛋白酶 (Papain) | Worthington | LS003119 | |
| 孕酮 | Sigma | P-6149 | |
| 腐胺 (Putrescine) | Sigma | P-7505 | |
| 手术刀 | Fine Science Tools | 10316-14 | |
| shSCRAMBLE | Mission (Sigma) | SHC003 | |
| shSNRPN | Mission (Sigma) | TRCN0000109285 | |
| 亚硒酸钠 | Sigma | S-9133 | |
| 刮勺 | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| 无菌 PES 注射器滤器 (0.22 μm 孔径滤膜) | Epica | SFPE-22E-050 | |
| T12.5 cm2 培养瓶 | Biofil | TCF012025 | |
| T25 cm2 培养瓶 | LabClinics | PLC70025 | |
| T75 cm2 培养瓶 | LabClinics | PLC70075 | |
| 镊子 | Fine Science Tools | 91150-20 |
参考文献
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