此处使用裂殖酵母作为异源宿主，表达与GFP构成融合蛋白的细菌细胞骨架蛋白（如FtsZ和MreB），以观察其聚合行为。同时，通过荧光显微镜成像鉴定影响这些蛋白聚合的化合物。
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摘要
摘要
细菌细胞骨架蛋白（如 FtsZ 和 MreB）执行细胞分裂和维持细胞形态等重要功能。此外，FtsZ 和 MreB 已成为新型抗菌药物研发的重要靶点。目前已开发出多种检测方法，用于筛选靶向这些细胞骨架蛋白的核苷酸结合与聚合过程的化合物，其中主要集中在 FtsZ。然而，许多检测方法操作繁琐或成本较高，且确定药物在细胞内的作用靶点通常需要多种技术手段。最后，药物对真核细胞的毒性也是一个突出问题。本文介绍一种单步细胞水平检测方法，用于发现靶向细菌细胞骨架的新分子，并减少对真核细胞可能具有毒性的假阳性结果。裂殖酵母适用于基于显微镜的高通量筛选，通过直观的形态观察可轻松识别任何影响 FtsZ 或 MreB 聚合的分子。本检测方法采用标准的 96 孔板，依赖于细菌细胞骨架蛋白在裂殖酵母等真核细胞中聚合的能力。尽管本文所述方案以裂殖酵母为系统，并使用金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的 FtsZ 和大肠杆菌（Escherichia coli）的 MreB，但该方法可轻松拓展至其他能在真核表达宿主中形成聚合物的细菌细胞骨架蛋白。本文所述方法将有助于进一步推动靶向细菌细胞骨架蛋白的新型抗菌药物的发现。
引言
目前用于治疗细菌感染的几乎所有抗生素都出现了广泛耐药性，这迫切需要开发新型抗生素。2019年的一份报告指出，耐药菌感染直接导致127万人死亡，在计入耐药菌感染并发症的情况下，相关死亡总数高达495万人1。尽管现有抗生素在临床实践中仍有效，但其作用靶点主要集中于细胞壁、DNA和蛋白质合成等有限的细胞过程。在过去半个世纪中，仅有不到30种蛋白质被商业化用作新型抗菌药物的靶点2,3。这种可用靶点的局限性极大地限制了新型抗生素或其衍生物的研发，以应对耐药细菌的挑战。因此，为克服日益严重的抗生素耐药问题，亟需开发具有新作用靶点和新作用机制的抗生素。
理想的抗菌靶点应是细菌细胞生长所必需的组分，在系统发育上多样化的物种中具有保守性，与真核生物的同源性最低，并且能够被抗生素所靶向4。自发现参与细菌细胞分裂和细胞形态维持的细胞骨架蛋白以来，这些蛋白已成为开发抗菌化合物的有前景的关键靶点5。这些蛋白对细菌的存活至关重要，在维持细胞形态（MreB、CreS）、细胞分裂（FtsZ、FtsA）以及DNA分离（ParM、TubZ、PhuZ、AlfA）等方面发挥关键作用，类似于真核细胞中的细胞骨架。其中，FtsZ在多种原核生物中表现出高度保守性，而MreB几乎存在于所有杆状细菌中。这类蛋白分布广泛且对细胞存活至关重要，使其成为抗生素研究中极具吸引力的靶标5,6,7。
必须采用多管齐下的方法，结合体内观察、体外相互作用和酶学实验，以充分验证细菌细胞骨架蛋白是否为潜在抑制剂的主要作用靶点7。目前许多可用于此目的的检测方法程序繁琐或成本较高，显著限制了其在筛选可能影响细菌细胞骨架的先导化合物中的广泛应用。在这些方法中，显微镜技术因其能够通过直接观察细胞形态变化来评估化合物的有效性，而成为一种极为高效且快速的方法。然而，靶蛋白与其他细胞骨架复合物的异源结合、脱靶结合引起的间接效应、膜电位的变化、化合物难以有效穿透细胞膜，以及外排泵（尤其在革兰氏阴性菌中）的存在，共同导致了细菌细胞形变的确切原因难以明确界定8,9,10。
裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） 或称裂殖酵母，是一种杆状的单细胞真核生物。由于裂殖酵母在细胞周期与分裂、细胞结构组织以及染色体复制等细胞过程方面与包括人类在内的高等真核生物具有高度保守性，因此被广泛用作细胞生物学和分子生物学研究中的模式生物。11,12此外，Errington 及其同事在裂殖酵母中表达了定位于细胞极区的细菌细胞骨架蛋白 DivIVA，以证明 DivIVA 会富集于负曲率表面13再次，Balasubramanian 及其团队首次将裂殖酵母确立为一种细胞模型系统，以深入揭示机制、组装过程及动态特性 E. coli 肌动蛋白细胞骨架蛋白 MreB14 微管蛋白同源物FtsZ15他们还通过表观荧光显微镜证明了A22在酵母中表达时能有效抑制MreB的聚合。14此后，其他研究团队也成功利用裂殖酵母研究叶绿体FtsZ1和FtsZ2蛋白的组装特性。16最近，我们通过全面评估三种已知的FtsZ抑制剂——血根碱、小檗碱和PC190723——对两种致病菌来源的FtsZ蛋白的影响，初步验证了利用裂殖酵母作为细胞平台特异性筛选细菌细胞骨架抑制剂的可行性。 金黄色葡萄球菌 和 幽门螺杆菌17此外，这种单步细胞实验对于降低识别可能对真核细胞具有毒性的化合物的风险具有重要作用。
本报告中，利用裂殖酵母系统，我们提出了一种基于标准96孔板的系统性工作流程，用于对靶向金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）FtsZ蛋白和大肠杆菌（Escherichia coli）MreB蛋白的小分子抑制剂效应进行半自动化筛选与定量分析。本文中，我们建立并优化了该半自动化工作流程，使用已知的特异性靶向FtsZ和MreB的抑制剂PC190723与A22作为模型化合物。该工作流程采用配备电动高精度载物台的标准96孔板，并结合落射荧光显微镜进行自动图像采集，从而提升现有实验的标准化程度。因此，该方法可适用于合成化学文库的中通量及高通量筛选，并克服了上述部分技术挑战。
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方案
1. 在 S. pombe 中表达GFP标记的细菌细胞骨架蛋白
注意：有关本研究中使用的所有质粒和菌株的信息，请参见表1。有关所有培养基成分的信息，请参见表2。
- 进行克隆 E. coli 带有N端GFP融合的MreB（GFP-MreB）以及 S. aureus 携带C端GFP的FtsZ（SaFtsZ-GFP）进入 S. pombe 表达载体，pREP42，带有中等强度的硫胺素抑制型启动子 nmt4118,19 如前所述14,15. 从细胞中维持、扩增并分离质粒 E. coli 菌株（DH10β），如文中所述20,21.
注意：其他 E. coli 诸如DH5α、XL1Blue、TOP10等菌株，或其他常用于分子克隆的市售感受态细胞也可使用。 - 将质粒 pREP42-GFP-EcMreB 和 pREP42-SaFtsZ-GFP 转化入 S. pombe
- 将质粒 pCCD3 (pREP42-GFP-EcMreB) 和 pCCD713 (pREP42-SaFtsZ-GFP) 转化入 S. pombe 菌株（h-leu1-32 ura4-18天）采用乙酸锂法22，如下述步骤所述。
- 第1天 - 原代培养：接种一环新鲜划线培养的菌体 S. pombe 在3 mL灭菌的酵母提取物及补充剂（YES）液体培养基中培养，于30 °C在摇床中过夜（O/N）孵育。
- 第2天：
- 继代培养：将约500 µL的初代培养物加入30 mL经高压灭菌的YES液体培养基中，于30 °C振荡培养3–4 h，直至OD600 达到 0.4 - 0.6。
注意：每次转化使用 30 mL。 - 将30 mL培养液在2,500 x g下离心成团 g 室温下孵育6-8分钟。弃去上清液，用50 mL无菌蒸馏水（D/W）洗涤细胞。再次离心收集沉淀，弃去上清液。将细胞重悬于1 mL无菌蒸馏水（D/W）中，转移至2 mL离心管中。 离心同上，弃去上清液。
- 加入1 mL 0.1 M醋酸锂-Tris-EDTA（LiAc-TE）溶液，按上述方法离心。弃去上清液，用1 mL 0.1 M LiAc-TE溶液重悬沉淀。再次离心后弃去上清液，保留约100 µL溶液。
- 加入10 - 20 µg载体DNA（鲑鱼精子DNA；变性后在冰上快速冷却）和2 - 3 µg需要转化的质粒DNA，轻轻混匀。室温孵育10分钟。
- 加入 260 µL 40% PEG/LiAc-TE；轻轻混匀。在 30 °C 摇床或恒温混匀仪中孵育 60 分钟，轻柔混匀。加入 43 µL DMSO；轻轻混匀。
- 42 °C 热激 10 分钟，使用恒温混匀仪。2,500 x g 离心收集沉淀 g 6-8 分钟，弃去上清液。用 1 mL 无菌去离子水重悬沉淀物，洗涤 1 次。
- 离心，弃上清液，将沉淀重悬于200 µL无菌D/W中。取100 µL涂布于含5 µg/mL硫胺素（以抑制）的爱丁堡最小培养基（EMM）平板上 nmt41 启动子）以及氨基酸补充剂腺嘌呤（0.225 mg/mL）、组氨酸（0.225 mg/mL）和亮氨酸（0.225 mg/mL），但不含尿嘧啶（pREP42质粒的筛选标记）。
注意：也可将70 µL和130 µL分别接种至两个不同的培养皿中。由于转化效率在不同实验间可能存在差异，通过接种两种不同体积（70 µL和130 µL），可确保至少其中一个培养皿上获得单菌落。 - 在30 °C下培养平板2-3天，直至菌落出现。挑取单个菌落与100 µL无菌去离子水混合，按上述方法涂布于含硫胺但不含尿嘧啶的新鲜EMM平板上。
- 在30 °C下孵育2-3天，直至形成完整的菌苔。用接种环刮取生长的菌苔，并将其重悬于含有30%甘油的1 mL YES培养基中，置于冻存管内。
- 将冻存管在液氮中快速冷冻，随后于 -80 °C 保存，以维持酵母菌种的冷冻状态。
- 继代培养：将约500 µL的初代培养物加入30 mL经高压灭菌的YES液体培养基中，于30 °C振荡培养3–4 h，直至OD600 达到 0.4 - 0.6。
- 裂殖酵母中细菌细胞骨架蛋白的表达
- 无菌条件下，用接种环从甘油菌种中取一环，划线接种于新鲜的酵母专用平板上，以获得足量培养物用于后续实验。
注意：对于pREP42，我们使用含有腺嘌呤、组氨酸和亮氨酸的EMM琼脂平板（最小培养基），因为使用 S. pombe 菌株（h- leu1-32 ura4-D18）在无尿嘧啶培养基中培养（尿嘧啶作为筛选标记存在于pREP42中）。我们在琼脂平板中添加15–20 µM硫胺素（因pREP42含有硫胺素可抑制元件） nmt41 启动子）在平板上培养时抑制目的基因的表达。 - 用接种环取少量划线区域的接种物，接种于5 mL缺乏硫胺素的酵母专用EMM培养基中，于30 °C振荡培养10 - 12小时。
注意：在不同物种中表达 FtsZ 和 MreB 时 nmt41 启动子在 S. pombe 可能有所不同，通常为16至30小时。GFP-EcMreB和SaFtsZ-GFP蛋白表达的最佳时间 S. pombe 分别为20 - 24 h和16 - 20 h（30 °C，无硫胺素）。
- 无菌条件下，用接种环从甘油菌种中取一环，划线接种于新鲜的酵母专用平板上，以获得足量培养物用于后续实验。
表达GFP标记的细菌细胞骨架蛋白的粟酒裂殖酵母（S. pombe）培养物的处理
注意：在96孔板中，对过夜培养的酵母菌液测试多种不同的药物分子。
- 使用半自动化的96孔多通道移液仪，将50 µL过夜培养物转移至含有150 µL新鲜酵母EMM培养基的96孔板各孔中，接种新鲜培养物。
- 使用半自动化的96孔多通道移液器反复吹打以充分混匀的同时，缓慢向正在生长的培养物中加入不同且逐步增加浓度的药物，每种浓度设置三个重复，示意图见图1。
- 以已知药物作为阳性对照，分别为PC190723（针对S. aureus FtsZ）和A22（针对E. coli MreB），每种设置两个重复。
注意：如先前报道，PC190723和A22的使用浓度分别为56.2 µM17和72.6 µM14,17。同时，A22处理SaFtsZ和PC190723处理EcMreB分别作为阴性对照。 - 根据药物的最低和最高浓度，使用DMSO作为溶剂对照，设置三种不同浓度。
注意：药物所溶解的溶剂用作溶剂对照。 - 将对照组和处理组的培养物在30 °C下孵育6–10小时（直至细胞显示出细菌荧光蛋白的表达），然后使用落射荧光显微镜进行成像。
3. 聚合物的可视化
- 在光学透明底96孔板（荧光成像用黑色孔壁）的每孔中加入20 µL浓度为1 mg/mL的刀豆球蛋白A，室温孵育20分钟。吸去液体，室温晾干10分钟。
- 将 20 µL 细胞从培养板转移至相应的孔中，静置 10 分钟。用无菌 EMM 培养基洗涤细胞 3 至 4 次。
- 使用待用的物镜（见步骤 3.6），在图像采集面板的导航模式下进行图像采集 用于96孔板对齐和孔位覆盖的软件。在导航器中对齐孔的边缘。
- 接下来，选择孔内覆盖参数，包括对孔内感兴趣区域进行多位置选择，并使用按需模式的自适应自动对焦控制，以在成像过程中保持样本聚焦。
- 使用微分干涉差（DIC）和荧光成像。设置激发滤光片为475/28 nm，发射滤光片为525/48 nm，以观察酵母中表达的GFP标记细菌蛋白。以0.2 µm的步长获取贯穿酵母细胞厚度（5 µm）的Z轴层扫图像。
- 使用配备100倍、1.4数值孔径油浸物镜和2,000 × 2,000像素sCMOS相机（像素尺寸6.5 µm × 6.5 µm）的倒置落射荧光显微镜采集图像。采用LED照明系统激发荧光染料。
注意：任何配备可自动定位96孔板的电动载物台且具有精确多点定位功能的落射荧光显微镜系统均适用。对对照组和药物处理组的细胞图像，应采用相同的曝光时间（通常为0.3–0.5秒）、1×1 binning模式以及15%–20%的照明强度进行采集，以最小化实验变量并保持一致性。
4. 使用 ImageJ 对图像进行定量分析
- 处理细胞图像，并测量 FtsZ17 每个细胞的斑点数量及密度。对于 MreB，测量其密度和各向异性23，并使用 Fiji（v2.0.0-rc-69/1.52p）24 比较对照组与处理组细胞之间的差异。
- 利用明场差分干涉（DIC）通道的图像，首先使用自由手绘工具勾勒单个酵母细胞轮廓，并在 ROI 管理器中保存为感兴趣区域（ROI）。此步骤目前尚未实现自动化，但近期开发的基于机器学习的工具25,26 可在未来尝试并整合应用。
- 按照文献27所述方法，将细胞外部区域进行掩膜处理并填充为黑色。
- 使用 Fiji 内置的 OPS 阈值 IJ1 分析宏（analyse macro）来统计斑点数量24。
- 采用 Otsu 方法进行自动阈值分割，并对分割出的颗粒进行掩膜处理。通过宏运行“分析颗粒”（analyse particles）插件。
- 在测量聚合物密度（即单位面积细胞内细胞骨架的含量）时，按所述方法处理图像，包括掩膜和骨架化步骤27,28。使用 lpx 插件中的 Lpx 2Dfilter 对图像进行骨架化处理。
- 具体细节请参考最近发表的研究17。EcMreB 聚合体的定量分析方法如前文所述23，使用 FibrilTool29 通过各向异性量化空间组织结构，方法同前23。
注意：这些分析方法可用于定量其他经药物处理或未处理的细菌细胞骨架蛋白。
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结果
设置用于药物筛选的96孔板
使用 S. pombe 表达C末端GFP标签融合蛋白 S. aureus 来自含有中等强度硫胺素可阻遏启动子的载体（pREP42）的 FtsZ nmt41此前已建立17 同样地， E. coli N端GFP标记的MreB也在其中表达 S. pombe14我们还证明了PC190723（一种特异性SaFtsZ抑制剂）和A22（一种MreB抑制剂）在酵母中表达时，能够特异性地作用于相应的细菌细胞骨架蛋白。14,17.
本文提出利用酵母表达系统，建立针对细菌细胞骨架蛋白的抗菌药物中、高通量筛选方法。配备电动载物台的落射荧光显微镜可实现对96孔板的自动化成像，且市售药物文库也普遍以96孔板形式提供。因此，我们倾向于采用96孔...
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讨论
抗菌耐药性（AMR）是一项严重的全球健康威胁，迫切需要研发具有新作用靶点的新型抗生素。细菌细胞骨架已成为开发新型抗生素的有吸引力的靶点，针对细胞分裂蛋白FtsZ的小分子抑制剂（如TXA709）目前已进入I期临床试验30。已有多种方法被开发用于鉴定抑制FtsZ聚合的化合物7,31。我们近期利用真核裂殖酵母建立了一种基于细胞的检测方法，证明FtsZ稳定药物PC190723能够靶向HpFtsZ17。此外，我们还发现，尽管小檗碱和血根碱等药物可影响FtsZ的聚合，但它们也会影响酵母细胞的形态17。受这些研究和观察结果的启发，我们着手开发一种单步、基于细胞的检测方法，利用裂殖酵母表达平台筛选细菌细胞骨架的小分子调节剂。由于该筛选依赖于抑制GFP标记的细胞骨架蛋白的组装，因此具有类似荧光团特性的化合物可能产生假阳性结果。避免使用长通滤光片并选择窄带通滤光片，有助于减少由荧光小分子引起的假阳性...
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披露
所有作者均声明无利益冲突。
致谢
SMP、SR 和 AKS 感谢印度原子能部国家科学教育与研究中心提供的博士后资助。RS 感谢印度原子能部提供的内部经费支持，本研究还获得了印度生物技术部（DBT）向 RS 提供的研究资助（项目编号：BT/PR42977/MED/29/1603/2022）。作者们还感谢 V Badireenath Konkimalla 在本实验方案开发过程中提出的评论、建议和讨论。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔CC2光学CVG无菌板，带盖，黑色 | Thermo Scientific™ | 160376 | |
| 96孔板 | 康宁 | CLS3370 | |
| A22 盐酸盐 | Sigma | SML0471 | 溶于DMSO |
| 腺嘌呤 | FormediumTM | DOC0229 | 225 mg/L 培养基 |
| 刀豆蛋白A | Sigma | C5275-5MG | |
| DMSO | Sigma | 317275 | |
| 爱丁堡最低培养基（EMM 琼脂或 EMM 肉汤） | FormediumTM | PMD0210 | 参见下文以了解成分 |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| epMotion® 96孔板配2位置滑块 | Eppendorf | 5069000101 | |
| 组氨酸 | FormediumTM | DOC0144 | 225 mg/L 培养基 |
| Leica DMi8 倒置荧光显微镜 | 徕卡显微系统 | 德国公司 | |
| 亮氨酸 | FormediumTM | DOC0157 | 225 mg/L 培养基 |
| 乙酸锂 | Sigma | 517992-100G | |
| PC190723 | 默克 | 344580 | 溶于DMSO |
| 聚乙二醇（PEG） | Sigma | 202398 | |
| 硫胺素 | Sigma | T4625 | 过滤除菌 |
| Tris-盐酸盐 | MP | 194855 | |
| 尿嘧啶 | FormediumTM | DOC0214 | 225 mg/L 培养基，储存溶液于 36°C |
| YES（酵母提取物+补充剂）琼脂 | FormediumTM | PCM0410 | 见下文以了解成分 |
| YES（酵母提取物加补充剂）肉汤 | FormediumTM | PCM0310 | 请参见下文以了解成分组成 |
| 酵母（S. pombe) 培养基 | |||
| 酵母提取物 + 补充物（YES） | |||
| 成分 | g/L | ||
| 酵母提取物 | 5 | ||
| 葡萄糖 | 30 | ||
| 琼脂 | 17 | ||
| 腺嘌呤 | 0.05 | ||
| L-组氨酸 | 0.05 | ||
| L-亮氨酸 | 0.05 | ||
| L-赖氨酸盐酸盐 | 0.05 | ||
| 尿嘧啶 | 0.05 | ||
| 爱丁堡最低培养基（EMM） | |||
| 成分 | 克/升 | 浓度 | |
| 邻苯二甲酸氢钾 | 3 | 14.7 mM | |
| Na2HPO4 | 2.2 | 15.5 mM | |
| NH4Cl | 5 | 93.5 mM | |
| 葡萄糖 | 2% (w/v) 或 20 g/L | 111 mM | |
| 盐溶液（50倍浓缩储备液） | 20 mL/L（v/v） | ||
| 维生素（储存液 ×1000） | 1 mL/L（v/v） | ||
| 矿物质（储存液 ×10,000） | 0.1 mL/L（v/v） | ||
| 盐溶液 × 50 | 52.5 克/升 MgCl₂·6H₂O（0.26 M） | 52.5 | 0.26 M |
| 0.735 mg/L CaCl₂·2H₂O（4.99 mM） | 0.000735 | 4.99 mM | |
| 50 g/l KCl（0.67 M） | 50 | 0.67 M | |
| 2 g/l Na₂SO₄（14.1 mM） | 2 | 14.1 mM | |
| 维生素 × 1000 | 1 g/l 泛酸 | 1 | 4.20 mM |
| 10 g/l 烟酸 | 10 | 81.2 mM | |
| 10 g/l 肌醇 | 10 | 55.5 mM | |
| 10 mg/l 生物素 | 0.01 | 40.8 µM | |
| 矿物质 × 10,000 | 硼酸 | 5 | 80.9 mM |
| MnSO4 | 4 | 23.7 mM | |
| ZnSO₄·7H₂O | 4 | 13.9 mM | |
| FeCl₂·6H₂O | 2 | 7.40 mM | |
| 钼酸 | 0.4 | 2.47 mM | |
| KI | 1 | 6.02 mM | |
| CuSO₄·5H₂O | 0.4 | 1.60 mM | |
| 柠檬酸 | 10 | 47.6 mM | |
| 菌株/质粒 | |||
| 菌株 | 描述 | 参考文献 | |
| CCD190 | 大肠杆菌 DH10β | Invitrogen | |
| CCDY4 | MBY3532；CCDY346/pREP42-GFP-EcMreB | Srinivasan 等，2007 | |
| CCDY340 | CCDY346/pREP42-SaFtsZ-GFP | Sharma 等，2023 | |
| CCDY346 | MBY192 裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） [ura4-D18, leu1-32, h-] | Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR) | |
| 质粒 | |||
| pCCD3 | pREP42-GFP-EcMreB | Srinivasan 等，2007 | |
| pCCD713 | pREP42-SaFtsZ-GFP | Sharma 等，2023 |
参考文献
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