大鼠眼内注射技术：低不良反应风险

摘要

本方案描述了一种通过中央角膜切口和长隧道进入前房的大鼠前房注射技术。该注射方法可最大限度地降低意外组织损伤的风险，从而提高操作的精确性和可重复性。

摘要

前房注射是眼科领域的一种标准给药方式。由于啮齿类动物眼部结构尺寸有限，包括房水体积小、晶状体曲率及晶状体厚度等因素，将其应用于科研中的前房注射操作具有挑战性。前房注射过程中可能造成的眼部损伤会引发不良反应并增加实验变异性。本方案介绍了一种在大鼠中实施前房注射的操作流程，可实现高精度和可重复性。

Sprague-Dawley大鼠被用作实验模型。由于大鼠晶状体位置突入前房，若采用与人类相同的方式从周边部注射，则操作不利。因此，使用31号0.8 mm尖刀在角膜中央区域制作切口，形成可自封闭的隧道通向前房。在角膜中央区域制作切口 接近平角的角度可形成较长的隧道，从而最大限度减少房水丢失和前房变浅。将34G纳米针插入隧道内进行注射，可实现低摩擦阻力穿透，并避免接触晶状体。注入台盼蓝可 可视化 通过裂隙灯显微镜观察前房内染料的存在，并排除渗漏。通过注射Hoechst染料显示角膜内皮层的生物可利用性，染料注射后可对角膜内皮细胞核进行染色。

综上所述，本方案建立了一种在大鼠眼前房内进行精确注射的操作流程。该方法可用于在实验性大鼠模型中向眼前房递送多种药物和化合物，从而提高眼科研究的效率与可重复性。

引言

局部给药至眼表的化合物生物利用度通常极为有限 <5%¹滴眼液给药的化合物主要通过引流、刺激性泪液分泌、泪液更新以及结膜吸收等方式被清除。此外，角膜-结膜屏障极大地限制了化合物透过眼表的渗透。^1,2,3角膜由三层主要结构组成：最外层的上皮层、中间的基质层和最内层的内皮层。表层角膜上皮细胞之间通过紧密连接相互连接，形成较高的细胞旁通路电阻，构成物质通透的主要屏障。多层上皮结构进一步限制了亲水性及大分子物质通过角膜上皮细胞间隙的渗透。紧接上皮层之后的基质层由胶原纤维构成，并含有水性孔隙。与角膜上皮不同，基质层允许亲水性药物通过；然而，其对脂溶性化合物则具有显著的低通透性。^1,2,3角膜上皮层和基质层共同构成了限制药物吸收的主要组织屏障。角膜内皮层通常不被视为限制药物转运的因素。

除角膜给药途径外，结膜途径也是一种选择。结膜是一种多层上皮组织，覆盖于眼睑内侧表面及巩膜前部。与角膜上皮相比，结膜的紧密连接较少，因而对亲水性药物具有更高的通透性。然而，结膜具有血管化特征，....

方案

本方案中的实验已获得国家动物科学许可委员会批准，并符合ARVO关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明。本研究使用8至10周龄的雌性Sprague-Dawley大鼠，动物处于12小时光照/12小时黑暗的循环环境中。实验动物购自商业来源（见材料表）。

1. 动物准备

1. 配制氯胺酮（80 mg/kg 体重，0.8 mL）和赛拉嗪（4 mg/kg 体重，0.2 mL）的麻醉混合液，并通过单次腹腔注射对大鼠进行麻醉。
2. 通过单次腹腔注射给予镇痛剂丁丙诺啡（0.03 mg/kg）。
3. 将0.4%奥布卡因局部眼用麻醉剂滴于双眼。

2. 创建自密封角膜隧道

1. 使用眼科手术镊夹住角膜缘旁垂直中线处的上方巩膜，以固定眼球。
2. 在手术显微镜下，将无菌的0.8 mm、31 G刀头的柳叶刀置于中央角膜区的垂直中线上（瞳孔中心上方），刀片保持平放，角度尽可能接近水平（图2）。
3. 在此位置刺穿角膜，制作切口并形成一个长隧道（2–3 mm），直至进入前房中央区域。避免接触晶状体（图2）。
   注意：成功....

结果

根据上述方案，向Sprague Dawley大鼠前房内注射5 µL台盼蓝。注射后立即进行裂隙灯检查，结果显示前房被台盼蓝染色，表明注射物质已到达前房（图3）。此外，前房深度保持正常，提示注射未导致房水外漏或前房变浅。

图3：前房内注射后完整的眼前房结构。将台盼蓝注入大鼠眼前房。裂隙显微镜检查显示台盼蓝存在于前房内，无渗漏或前房变浅现象。比例尺 = 1 mm。

讨论

临床前研究模型应提供一个受控且可重复的环境，以确保研究结果的可靠性和适用性。在眼科研究中，眼内注射模型常用于多种研究领域，包括建立疾病模型、测试新疗法以及评估组织反应和潜在不良反应。

前房注射是实验眼科学中常用的技术，可通过绕过角膜外组织屏障，将化合物直接递送至房水中⁵。这种通过前房注射实现的靶向给药方式，可确保药物以最佳浓度到达预定作用部位，如晶状体、小梁网或角膜内皮细胞，从而最大化治疗效果。

在小型啮齿类动物中进行前房注射存在多项技术挑战，可能影响实验的可重复性与成功率。首先，啮齿类动物眼球尺寸较小，难以在不损伤眼内结构的前提下实现有效进入和操作。在此方面，大鼠因其眼球较大，相较于小鼠具有一定优势。其次，晶状体位于空间受限的前房内，可能阻碍通往注射部位的路径。与其他哺乳动物（包括人类）相比，大鼠的晶状体较为突出或显著，这与其相对于眼球的较大尺寸有关（图1）。此外，大鼠晶状体缺乏人类晶状体所具有的弹性。因此，必须谨慎操.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
茜素红	Alpha Aesar	042040.5
丁丙诺啡	Richter pharma	102047
地塞米松 0.1%	Fisher Pharmaceutical	393102-0413
Hamilton 玻璃注射器 10 μL	Hamilton Co.	721711
Hoechst	Merck	B2261
氯胺酮	Bremer pharma GMBH (medimarket)	17889
0.3% 氧氟沙星滴眼液	Allergan	E92170
盐酸奥布卡因 0.4%	Fisher Pharmaceutical	N/A
戊巴比妥钠 200 mg/mL	CTS	N/A
裂隙显微镜	Haag-streit bern	b-90019115
Sprague-Dawley 大鼠	Envigo	N/A
Stiletto 刀片 31G 0.8 mm	Tecfen medical (skymed)	QKN2808
手术显微镜	Zeiss	OPMI-6 CFC
台盼蓝	Sartorius	03-102-1B
赛拉嗪	Eurovet Animal Health	615648