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基础记录：一种分析味觉神经元反应的技术 果蝇

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DOI：

10.3791/66665

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2024年3月1日

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, Yale University, 2Department of Entomology, The Connecticut Agricultural Experiment Station

本文内容

摘要

一种很少使用但具有独特优势的电生理记录方法——基部记录法，能够分析味觉编码的某些特征，而这些特征是传统记录方法无法检测的。基部记录法还能够分析对疏水性刺激物的味觉反应，而这类刺激物无法通过传统的电生理学方法进行研究。

摘要

昆虫通过其末端具有孔隙的味觉毛或称感器来感知外界环境。当感器接触到潜在的食物来源时，食物中的化合物会经由孔隙进入并激活内部的神经元。50多年来，这些神经反应一直通过一种称为“尖端记录”的技术进行测量。然而，该方法存在重大局限性，包括无法在刺激物接触前后测量神经活动，以及要求味觉物质必须可溶于水溶液。本文介绍一种我们称之为“基部记录”的技术，可克服上述局限。基部记录能够在刺激物接触前、接触期间及接触后测量味觉神经元的活动，从而实现对味觉刺激结束后出现的“关闭反应”进行深入分析。该技术还可用于研究疏水性化合物，例如在水中溶解度极低的长链信息素。总之，基部记录兼具单感器电生理学技术的优势——能够以高空间和时间分辨率测量神经元活动，且无需依赖遗传工具，同时克服了传统尖端记录技术的关键局限。

引言

包括果蝇科昆虫在内的昆虫拥有复杂的味觉系统，使其能够从周围环境中获取复杂的化学信息。该系统使它们能够分辨不同物质的化学成分，区分有营养的物质和有害物质1，2。

该系统的核心是被称为味觉毛或感觉器的特化结构，它们分布在身体的多个部位。在果蝇科昆虫中，这些感觉器位于唇瓣上，唇瓣是果蝇头部主要的味觉器官1,2,3,4，同时也分布于腿部和翅膀上1,2,5,6。唇瓣位于喙的末端，包含两个叶状结构4,7,8。每个叶状结构上覆盖有31个味觉感觉器，根据形态分为短型、长型和中间型4,7,8。每个感觉器内含有2–4个味觉神经元1,2,9,10。这些味觉神经元表达至少四个不同基因家族的成员，即Gustatory receptor (Gr)（味觉受体）、Ionotropic receptor (Ir)（离子型受体）、Pickpocket (Ppk) 和 Transient receptor potential (Trp) 基因1,2,11,12,13。这些受体和通道的多样性使昆虫能够识别多种化学物质，包括非挥发性和挥发性化学信号1,2,14。

50 多年来，科学家一直使用一种称为尖端记录的技术来量化味觉神经元及其受体的反应3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35。然而，该方法存在重大局限性。首先，只能在刺激物接触期间测量神经活动，而无法在接触前或接触后进行测量。这一限制排除了对自发性放电活动的测量，并阻碍了对刺激移除后反应（OFF 反应）的测量。其次，仅能测试可溶于水溶液的呈味物质。

这些局限性可以通过一种很少使用的替代性电生理技术——“"基部记录"——加以克服。本文介绍了该技术，我们对该方法的改进源自Marion-Poll及其同事所使用的一种方法24，并展示了该技术目前可便捷测量的关键味觉编码特征14。

方案

以下方案符合耶鲁大学的所有动物护理指南。

1. 果蝇

  1. 将10-15只新羽化的果蝇放入新鲜的标准培养瓶中，在25 °C、60%相对湿度、12:12小时光暗循环条件下培养。
  2. 使用3-7日龄的果蝇进行实验。

2. 化学感受刺激

  1. 获取尽可能高纯度的化学感受刺激物。按照供应商的建议保存至使用。
  2. 将化学感受刺激物溶解，并用水或另一种所需且无毒的溶剂（如石蜡油）稀释至所需浓度。对于溶解的固体化合物，制备的溶液需至少搅拌1小时。

3. 玻璃刺激毛细管

  1. 使用拉针仪将硼硅酸盐玻璃毛细管（100 mm 长，1 mm 外径，0.58 mm 内径）拉制成用于盛装刺激物的玻璃毛细管，尖端直径应控制在 3 µm 至 10 µm 之间。
  2. 使用微量移液器吸头将选定的刺激溶液注入玻璃毛细管中。注意避免产生气泡，如有气泡可通过轻弹管壁去除。
  3. 若刺激物在尖端结晶，应清洁或更换玻璃刺激毛细管。

4. 参考电极和记录电极

  1. 使用钨丝（直径 127 µm，长度 76.2 mm）制备参考电极和记录电极。将参考电极和记录电极的尖端反复浸入 10% KNO3（约 1 M）溶液或 10% KOH（1.8 M）溶液中数秒，使其尖端直径磨至约 1 µm（这些电极的形状见 Delventhal 等.36 的图示）。
    注意：该过程需施加电流（0.3–3 mA）以促进反应。

5. 准备果蝇以进行基础记录

  1. 从试剂瓶中用吸虫器吸取一只果蝇。抽出吸虫器，并用手指堵住末端以困住果蝇。
  2. 将果蝇吹入一个 200 µL 的塑料移液枪头中。保持吸虫器末端位于枪头内部，利用其推动果蝇向前，使其头部朝向枪头的狭窄端。
  3. 使用剃刀片在枪头两端（即果蝇的前部和后部）进行修剪。
  4. 使用黏土或一小块棉花进一步推动果蝇向前，直至其头部一半露出于修剪后的枪头末端。用镊子轻轻推动，使头部前端的唇瓣暴露出来。
  5. 用黏土将修剪后的枪头固定在玻璃显微镜载玻片上（图 1）。
  6. 在体视显微镜下，将唇瓣侧向放置于盖玻片上，使其中一个叶及其31个味觉感器暴露出来（图 1）。盖玻片可固定唇瓣位置。

6. 电生理设备

  1. 选择一个温度和相对湿度稳定（<70%）且远离冰箱、离心机等电噪声和机械噪声源的房间用于设备安装。
  2. 将显微镜放置在防震台的中心位置。
  3. 将手动微操纵器固定在防震台上（图2）。
  4. 将固定钨参考电极的不锈钢轴连接至手动微操纵器（图2）。
  5. 使用支架将两个电动操纵器连接到同一台面上：一个配备记录电极探针的夹持器，另一个配备连接至不锈钢轴的玻璃刺激毛细管夹持器（图2）。
  6. 将记录电极探针连接至智能数据采集控制器（IDAC）系统或其他放大器/数字化系统。
  7. 将该IDAC系统连接至工作站的计算机。
  8. 将手动和电动操纵器共同接地至设备系统的同一接地点。
  9. 在计算机上安装适用于IDAC系统的数据采集软件，并确保数字采集驱动程序与计算机操作系统（例如 Windows XP-7、-8 或 -10）兼容。

7. 味觉感受器的记录

  1. 将制备好的载玻片置于显微镜载物台上，使用低倍物镜（例如 10x）。移动载物台，使唇瓣在低倍和高倍（例如50x）物镜下均位于视野中央并清晰对焦。
  2. 使用低倍物镜将参考电极插入果蝇眼部。插入参考电极时，应选择与记录电极所在侧相对的一侧眼睛；例如，若记录电极从右侧接近，则将参考电极插入左侧眼睛。使用手动显微操作器进行精确插入。
  3. 使用电动显微操作器将玻璃刺激毛细管的尖端移至低倍和高倍物镜视野中央并对焦（图3）。
  4. 在低倍镜下，使用第二个电动显微操作器将记录电极移近唇瓣。
  5. 在高倍镜下，使用电动显微操作器将记录电极插入味觉感器基部，直至听到IDAC系统音频输出中出现神经元放电的声音。
  6. 一旦获得稳定信号，即使用IDAC系统配套软件开始记录信号（图4A-D）。点击开始记录按钮以启动记录。
  7. 使用电动操作器将刺激用玻璃毛细管尖端移至味觉感器顶端，使其覆盖感器尖端。
  8. 结束刺激时，使用电动操作器将玻璃刺激毛细管从感器上移开。
  9. 使用脚踏开关手动标记刺激的开始和结束。脚踏开关连接至IDAC，通过IDAC与软件通信，以标记刺激的起始和终止时间点。

8. 分析

  1. 使用 IDAC 系统配套软件的不同功能，按振幅（在可能的情况下）对峰电位群体进行分类，并分析其响应动力学。
    1. 为计数峰电位，左键单击感兴趣的记录，弹出可供选择的窗口。选择 转为峰电位，将启动另一个名为将波形转换为峰电位的窗口。在 新建 字段中输入 名称，然后点击 确定 按钮。
    2. 在步骤 8.1.1 的 新建 字段中输入名称后，将进入 振幅直方图 视图。选择要计数的 振幅，然后关闭此视图。左键单击以添加计数器。
    3. 手动检查峰电位，以确认基于软件分析所得出的结论。
      注意：该软件还支持以不同格式导出数据，以便进一步分析。

结果

图4A 显示了来自一个感器的自发性动作电位。这些动作电位可根据幅度分为两类，其中幅度较大的电位来自对苦味化合物敏感的神经元，而幅度较小的电位则来自响应糖类的神经元。动作电位幅度与功能特异性之间的关系已通过遗传学实验得到证实4,14,37,38,39。

图4B 显示了S5感受器中对苦味敏感的神经元对避蚊胺（DEET）气味的反应；该反应发生在避蚊胺溶液与感受器无任何直接接触的情况下。其中一个峰电位的幅度呈中等，可能是由两个较小峰电位叠加所致，分别来自糖敏感神经元和机械感受神经元。

图4C 显示了苦味刺激与I1感受器接触后产生的ON反应，以及接触终止后出现的OFF反应。注意，以每秒脉冲数（spikes/s）衡量的OFF反应幅度大于ON反应。

图4D 显示了另一种果蝇 Drosophila virilis 的 I1 感觉毛对苦味化合物小檗碱产生的 ON 和 OFF 反应。该技术的一个优势在于，它可应用于其他物种（包括蚊子），而无需向这些生物中引入任何转基因成分。

图4E 展示了记录过程中可能出现的两个问题。首先，如果唇瓣未被妥善固定，其移动可能会引发感器中机械感受神经元的放电尖峰。其次，记录电极可能会从感器中脱出，这种情况通常由唇瓣的移动引起。此时电极会失去接触，必须重新插入才能记录到放电尖峰。

用于唇瓣研究的果蝇微操作装置，包含移液器、盖玻片和黏土。
图1：用于基础记录的果蝇制备。 一个经过修剪的移液器尖端内含一只雌性果蝇，其唇瓣牢固地放置在玻璃盖玻片上。(A) 移液器尖端和盖玻片均被固定在黏土堆上。(B) 唇瓣置于盖玻片上的高倍放大图像。 请点击此处查看该图的放大版本。

用于电极定位的带显微操作器的膜片钳电生理装置示意图
图 2：电生理实验装置示意图。（A）整体示意图，显示用于参考电极的手动显微操作器、用于玻璃刺激毛细管的电动显微操作器，以及用于记录电极的电动显微操作器的位置。（B）显示参考电极、玻璃刺激毛细管和记录电极固定装置的总体布局。请点击此处查看此图的放大版本。

记录电极和玻璃毛细管置于昆虫感受器上的电生理实验装置示意图。
图3：唇瓣及感受器。（A）倒置显微镜下的唇瓣。唇瓣局部放大图，显示唇瓣一个叶上的味觉感受器。图中还显示刺激用玻璃毛细管靠近一种称为L2（Large type 2，大型2型）的大感受器，以及记录电极插入该感受器基部的位置。（B）唇瓣感受器的可及性。图示在常规制备条件下易于进行基部记录的感受器，以及因位置关系而较难接近的感受器。缩写：A = 前部；M = 中部；P = 后部；L = 侧部。请点击此处查看该图的放大版本。

昆虫感受器对化学刺激的电生理记录、图谱分析、神经元活动。
图 4：自发性放电、苦味神经元反应及次优记录的示例轨迹。 （A）自发性放电的示例轨迹。放电来自I1感受器中的苦味敏感神经元（红点）和糖敏感神经元（绿点）。在感受器示意图中，苦味、糖和机械感受神经元分别以红色、绿色和黑色表示。（B）S5感受器中苦味神经元（红点）对1 mM DEET蒸气反应的示例轨迹。注意，小幅度放电来自糖神经元和机械感受神经元，在此示例轨迹中难以通过幅度区分。缩写：DEET = N,N-二乙基-间甲苯甲酰胺。（C）I1感受器中苦味神经元对1 mM苯甲地那铵的ON和OFF反应示例轨迹。在接触刺激前（自发性放电）、接触期间（ON反应）和接触后（OFF反应）均观察到放电。缩写：DEN = 苯甲地那铵。（D）D. virilis I1感受器中苦味神经元对0.5 mM盐酸小檗碱的ON和OFF反应示例轨迹。在接触前、接触期间和接触后均观察到放电。缩写：BER = 盐酸小檗碱。（E）次优记录的示例轨迹。由于唇瓣移动，实验中途接触丢失。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

在某些类型感器的记录中，区分不同神经元的峰电位可能具有挑战性。例如，S型和I型感器中的糖敏感神经元和机械感受神经元产生的峰电位幅度相似，难以将其区分开来4,14我们发现，使用非常尖锐的钨记录电极可以减少机械感受神经元的放电，记录电极的合理放置也能起到同样作用。将记录电极插入感受器窝的套环部位（即 进入基部但不深入）通常会导致机械感觉刺激减弱。此外，我们发现，如果记录到机械感觉神经元的放电水平较高，撤回记录电极并将其相对于感受器置于不同位置，往往会使放电水平降低。

在整个实验过程中确保记录电极的稳定性是另一个关键问题（见图4E）。机械干扰或电极位置的移动可能会对记录质量产生不利影响。投入时间和精力进行充分准备（如上述方案中所述），是避免因唇瓣移动而导致挫败感的关键。

我们注意到，某些化合物会引起I-a类I型感器产生ON和OFF两种反应，而这类化合物还存在另一个问题14。有时，再次施加刺激后仅能引发OFF反应，而无法引发ON反应。目前尚不清楚导致ON反应减弱的原因。

在基础记录过程中遇到的另一个挑战是，并非所有感受器都易于进行记录，这是由于它们在唇瓣上的位置所致。在31个唇瓣感受器中，仅有26个便于记录，这构成了该技术的一项局限性，如图3B所示。然而，原则上，通过旋转奥林巴斯显微镜的机械XY载物台，可以使这些感受器（I8、I9、I10、L9和S10）变得可及。

最后，我们强调投入精力进行果蝇制备的重要性。制备良好的果蝇在实验过程中更有可能获得可靠且高质量的记录结果。此外，可使用蔗糖作为阳性对照以确保记录质量；蔗糖能够引发唇瓣所有感受器的反应。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢 Zina Berman 提供的支持，Lisa Baik 对稿件的评论，以及 Carlson 实验室其他成员的讨论。本研究得到了 NIH 资助 K01 DC020145（授予 H.K.M.D）；以及 NIH 资助 R01 DC02174、R01 DC04729 和 R01 DC011697（授予 J.R.C）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
显微镜奥林巴斯BX51WI配备50倍物镜（LMPLFLN 50X，Olympus）和10倍目镜。 
防振台TMC63-7590E
电动显微操作器哈佛仪器公司与Märzhä用户显微操作仪PM 10 压电微操作器
手动显微操作器Märzhä用户显微操作仪MM33 微操作仪
磁力架ENCO型号 #625-0930
参考文献  和记录电极架Ockenfels Syntech GmbH
刺激玻璃毛细管夹持器Ockenfels Syntech GmbH
通用单端探针Ockenfels Syntech GmbH
4通道USB交流采集控制器，IDAC-4Ockenfels Syntech GmbH
刺激控制器Ockenfels Syntech GmbH刺激控制器 CS 55
个人计算机戴尔Vostro检查与数字采集系统和软件的兼容性
钨棒A-M Systems货号#716000
铝箔和/或法拉第笼电磁噪声屏蔽
硼硅酸盐玻璃毛细管世界精密仪器公司1B100F-4
拉针仪Sutter Instrument CompanyModel P-97 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪
体视显微镜OlympusVMZ 1x-4x果蝇准备
p200 移液器吸头通用
微量移液器吸头 EppendorfE5242956003
1 ml 注射器通用型
鳄鱼夹
电力变压器STACO 能源产品STACO 3PN221B由 P1000 移液器吸头、柔性塑料管和网状材料组装而成
油泥通用型
镊子通用型
塑料管圣戈班Tygon S3™ E-3603
标准培养瓶Archon Scientific窄口1盎司聚苯乙烯小瓶，每个含10 mL葡萄糖培养基，并预装醋酸纤维素塞
盐酸小檗碱（BER）Sigma-Aldrich货号 Y0001149
苯甲地那铵（DEN）Sigma-Aldrich货号 D5765
N,N-二乙基-间甲苯甲酰胺（DEET）Sigma-Aldrich货号 36542

参考文献

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