更正：人血小板组织因子表达的流式细胞术分析

摘要

已发布更正： 人血小板中组织因子表达的流式细胞术分析。已更新方案部分。

摘要

本文更正了 文章 10.3791/67356-v

方案

已发布更正：  人血小板中组织因子表达的流式细胞术分析。原协议部分来自：

4. 静息和活化血小板中细胞表面相关组织因子表达的流式细胞术分析的样本制备

注意：检测细胞表面相关组织因子（TF）时，使用未标记的αCD142/HTF1单克隆抗体（1 mg/mL），并以Alexa Fluor 633标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗进行信号检测。采用腺苷5'-二磷酸（ADP）作为血小板激动剂，以诱导TF在细胞表面暴露。使用PE标记抗体作为血小板群体标记物，以最小化荧光信号溢出，该溢出将通过信号补偿进行校正。

1. 组织因子（TF）染色
   1. 将αCD142/HTF1单克隆抗体（mAb）用不含Ca⁺⁺ 和Mg⁺⁺、pH 7.4的1×PBS按1:100稀释，得到工作浓度为10 µg/mL的溶液。将Alexa Fluor 633标记的山羊抗小鼠IgG按1:10用不含Ca⁺⁺ 和Mg⁺⁺、pH 7.4的1×PBS稀释。
   2. 准备三个样本管，并按照 表3所示加入不含Ca⁺⁺ 和Mg⁺⁺、pH 7.4的1×PBS。
   3. 向每管中加入7.5 µL稀释后的αCD142/HTF1 mAb，并加入5 µL ADP（200 µM）。轻轻倒置枸橼酸盐真空采血管5次，使血液与抗凝剂充分混匀，然后向每管中加入5 µL全血。轻柔混匀各样本。
   4. 将样本在室温下孵育20分钟。
2. 样本固定
   1. 向每个样本中加入300 µL 1%多聚甲醛（PFA）进行固定，并在室温下孵育1小时。
      注意：使用1% PFA固定的标记样本在4 °C保存可稳定长达4天。
   2. 向每管中加入300 µL不含Ca⁺⁺ 和Mg⁺⁺、pH 7.4的1×PBS，在室温下以1500 × g 离心5分钟（开启刹车）。
   3. 吸除上清液，用移液器轻柔吹打，将沉淀重悬于90 µL不含Ca⁺⁺ 和Mg⁺⁺、pH 7.4的1×PBS中。
3. 二抗染色
   1. 向每管中加入5 µL稀释后的Alexa Fluor 633标记IgG和5 µL αCD41-PE（见 表4）。将样本在室温下避光孵育15分钟。
   2. 向每管中加入300 µL不含Ca⁺⁺ 和Mg⁺⁺、pH 7.4的1×PBS，并混匀。
   3. 将染色后的样本避光保存，直至进行流式细胞术分析（见步骤6）。
      注意：为计算补偿矩阵，需根据步骤4.1–4.3以及 表5 和 表6中所述方案制备样本。

至：

4. 静息和活化血小板中细胞表面相关组织因子表达的流式细胞术分析样本制备

注意：检测细胞表面相关组织因子（TF）时，使用未标记的 αCD142/HTF1 单克隆抗体（1 mg/mL），并以 Alexa Fluor 633 标记的山羊抗小鼠 IgG（2 mg/mL）作为二抗进行信号检测。采用腺苷5'-二磷酸（ADP）作为血小板激动剂，以诱导TF在细胞表面暴露。使用PE标记的抗体作为血小板群体标记物，以最小化荧光溢出，该溢出将通过信号补偿进行校正。

1. 组织因子（TF）染色
   1. 将αCD142/HTF1单克隆抗体用不含Ca⁺⁺ 和Mg⁺⁺、pH 7.4的1×PBS按1:100稀释，获得10 µg/mL的工作浓度。将Alexa Fluor 633标记的山羊抗小鼠IgG用不含Ca⁺⁺ 和Mg⁺⁺、pH  7.4的1×PBS按1:10稀释，获得200 μg/mL的工作浓度。
   2. 准备三个样本管，并按照 表3所示加入不含Ca⁺⁺ 和Mg⁺⁺、pH 7.4的1×PBS。
   3. 向每管中加入7.5 µL稀释后的αCD142/HTF1单克隆抗体，并加入5 µL ADP（200 μM），使ADP终浓度为10 μM。轻轻颠倒枸橼酸钠真空采血管5次，充分混匀血液与抗凝剂，然后向每管中加入5 µL全血。轻柔混匀各样本。
   4. 室温孵育20分钟。
2. 样本固定
   1. 每管加入300 µL 1%多聚甲醛（PFA）进行固定，室温孵育1小时。
      注：使用1% PFA固定的标记样本在4 °C保存可稳定长达4天。
   2. 向每管中加入300 µL不含Ca⁺⁺ 和Mg⁺⁺、pH 7.4的1×PBS，室温下以1500 × g 离心5分钟（开启刹车）。
   3. 弃去上清液，用移液器轻柔吹打，将沉淀重悬于95 µL不含Ca⁺⁺ 和Mg⁺⁺、pH 7.4的1×PBS中。
3. 二抗染色
   1. 向每管中加入5 µL稀释后的Alexa Fluor 633标记IgG，室温避光孵育15分钟。
   2. 向每管中加入300 μL不含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺、pH 7.4的1×PBS，室温下以1500 × g离心5分钟（开启刹车）。弃去上清液，将沉淀重悬于95 μL不含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺、pH 7.4的1×PBS中。
   3. 向每管中加入5 µL αCD41-PE（见表4），室温避光孵育15分钟。
   4. 向每管中加入300 µL不含Ca⁺⁺ 和Mg⁺⁺、pH 7.4的1×PBS并混匀。
   5. 将染色后的样本避光保存，直至进行流式细胞术分析（见步骤6）。
      注：为计算补偿矩阵，请根据步骤4.1–4.3以及 表5 和 表6中所述方案制备样本。