从小鼠下腔静脉依次采集血液，随后采集门静脉血，以评估肠道微生物代谢物

摘要

该方案演示了一种依次从小鼠门静脉和下腔静脉采集血液的方法，以评估肠道微生物代谢物的产生与吸收情况。

摘要

肠道微生物产物不仅可在肠道内局部发挥作用，还可被吸收进入循环系统，从而对多种远端器官系统产生影响。短链脂肪酸（SCFA）是肠道微生物在发酵不可消化膳食纤维过程中产生的一类代谢物，目前已被广泛认知 作为肠道微生物组通过肠-肺轴、肠-脑轴及其他肠-器官轴影响肠外器官系统的重要介导因子。短链脂肪酸（SCFAs）从结肠经肠组织吸收， 门静脉（PV）。随后它们经过肝脏，并在脑、肌肉、脂肪组织和肺等不同器官中被消耗。短链脂肪酸（SCFAs）最易在排出的粪便中检测，但更准确的测量结果来自结肠内粪便内容物。本文提出，采集单个受试者的门静脉及体循环血浆样本可能更有利于研究 吸收、运输及小鼠体内短链脂肪酸（SCFAs）的系统水平。我们介绍一种从门静脉（PV）和下腔静脉（IVC）高效采血的新技术，可从门脉循环和体循环中采集相对大量的血液。该方法通过结扎门静脉实现，从而允许 用于静脉导管（PV）的扩张或增粗，因其通过回流来自汇入其中的肠系膜静脉的血液而充盈。采用该方法后，我们成功提高了采血成功率以及总采血量（从下腔静脉（IVC）可采集至多0.3 mL，从PV可采集至多0.5 mL）。

引言

短链脂肪酸（SCFA）是一类由肠道微生物群产生的主要代谢产物。它们在肠道微生物组与其他远端器官相互作用中发挥关键作用¹ 已得到相关研究的描述支持 它们如何调节炎症、通过特异性受体传递信号，以及作为底物参与 细胞代谢^2,3,4,5近期研究 我们课题组已提出，短链脂肪酸（SCFAs）是关键因素 体内 肺部免疫稳态的炎症调节因子 体内 通过肠-肺轴^6,7. 其他研究已描述其通过肠-脑轴对代谢产生的功能影响^8,9总体而言，众多研究团队正在积极深入地探究短链脂肪酸（SCFAs）对宿主生理学和病理学的影响，涵盖多种疾病过程。

乙酸盐（C2）、丙酸盐（C3）和丁酸盐（C4）是主要的短链脂肪酸（SCFAs），由肠道微生物群在盲肠和大肠中通过可摄入膳食纤维的发酵产生。这三种短链脂肪酸 也....

方案

本非存活手术的所有步骤均经加州大学旧金山分校机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。所用小鼠的性别与品系为雄性 C57BL/6J 小鼠（体重 25–35 g，年龄 12–15 周）。也可使用雌性或/和其他标准小鼠品系。

1. 麻醉

1. 用70%乙醇棉片擦拭小鼠腹部下半部分。通过腹腔注射三溴乙醇（250–400 mg/kg）进行麻醉。也可使用氯胺酮/赛拉嗪或异氟烷进行麻醉。在眼睛上涂抹眼用软膏，以防止角膜损伤。
2. 腹腔注射布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg）以进行镇痛。
   注意：由于剖腹手术会引起疼痛，必须使用布托啡诺。 

2. 剖腹手术

1. 将麻醉后的小鼠仰卧置于手术台面（台面下放置加热垫）上，用胶带固定小鼠四肢。通过脚趾刺激确认麻醉深度是否合适 无缩足反射的夹捏
2. 提起皮肤，用解剖剪做一纵向切口 从脐部沿中线向剑突方向以及向尾侧至腹部基底部（外生殖器）剪开。
3. 使用解剖剪在腹膜上做一个类似的切口，注意不要穿孔或损伤肠道、膈肌或肝脏。
4. 扩大手术视野 做一个贯穿全长的横向切口 在脐部两侧用剪刀横向剪开（以扩大腹部宽度）。
5. 使用浸有温PBS的干....

结果

采用上述方法，我们可以在同一只小鼠中依次从下腔静脉（IVC）和门静脉（PV）采集血液样本，成功率超过95%。采集到的血液样本平均体积分别为：IVC 0.25 mL，PV 0.35 mL。

采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS），我们测定了粪便、门静脉血和下腔静脉血中短链脂肪酸（SCFAs）的浓度，从而能够追踪乙酸盐（C2）、丙酸盐（C3）和丁酸盐（C4）从结肠腔（由肠道细菌发酵产生）向体循环吸收和转运的过程。

具体而言，在这些实验中，我们研究了膳食纤维摄入对小鼠短链脂肪酸（SCFAs）生成的影响。我们给小鼠喂食高纤维饮食（35% 纤维）1 周或 2 周，并与喂食无纤维饮食的小鼠进行比较。我们预期并观察到高纤维组中纤维发酵菌群的分类群有所增加（数据未显示）。接下来，我们检测了结肠内容物、门静脉（PV）血液以及全身循环（下腔静脉，IVC）血液中的 SCFAs 水平（由密歇根大学代谢组学核心设施通过气相色谱-质谱法（GC-MS）定量）³（图 .......

讨论

本文描述了一种创新的 体内 近似同步连续采集血液样本的方法  从小鼠的下腔静脉（IVC）和门静脉（PV）采集血液样本。该方法适用于检测肠道微生物群产生的、经门脉循环转运的代谢产物（如短链脂肪酸，SCFAs）的水平。在终末取血实验中，每只体重为25–30 g的小鼠平均最大采血量约为1 mL，相当于其总循环血量的50%。¹⁸然而，获得足够的 从两个相互作用的个体中采集血液，用于所需的实验测量 且邻近的静脉系统可能具有挑战性。小鼠门静脉（PV）的血管内压仅比下腔静脉（IVC）高3-5 mmHg。²⁵，因此减少 门静脉（PV）内的压力升高可导致下降 下腔静脉（IVC）内的压力 反之亦然此外，小鼠的门静脉系统由来自肠系膜和脾脏的多条血管分支组成²⁶，相对较小且脆弱。因此，使用解剖显微镜可准确识别门静脉及其相关分支，并防止门静脉和下腔静脉塌陷 对本实验的成功至关重要。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,2,2 三溴乙醇，97%（Avertin）	Sigma Aldrich	T48402-25G	麻醉剂
盐酸丁丙诺啡注射液 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05	镇痛剂
敷料镊	Miltex	6-100	解剖
Graefe 镊	Roboz	RS-5136	解剖
肝素钠 1000 USP 单位/mL	Hikma	NDC 0641-0391-12	血液样本注射器/管肝素化
Prolene 7-0	Ethicon	8696G	门静脉结扎
剪刀	F.S.T	14058-11	解剖
学生型 Halsted-Mosquito 止血钳	F.S.T	91308-12	解剖
手术胶带	3M Transpore	1527-1	小鼠肢体固定
U-100 胰岛素注射器 28G 1/2	EXEL	26027	血液样本采集