该方案演示了一种依次从小鼠门静脉和下腔静脉采集血液的方法，以评估肠道微生物代谢物的产生与吸收情况。
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本文内容
摘要
摘要
肠道微生物产物不仅可在肠道内局部发挥作用，还可被吸收进入循环系统，从而对多种远端器官系统产生影响。短链脂肪酸（SCFA）是肠道微生物在发酵不可消化膳食纤维过程中产生的一类代谢物，目前已被广泛认知 作为肠道微生物组通过肠-肺轴、肠-脑轴及其他肠-器官轴影响肠外器官系统的重要介导因子。短链脂肪酸（SCFAs）从结肠经肠组织吸收， 门静脉（PV）。随后它们经过肝脏，并在脑、肌肉、脂肪组织和肺等不同器官中被消耗。短链脂肪酸（SCFAs）最易在排出的粪便中检测，但更准确的测量结果来自结肠内粪便内容物。本文提出，采集单个受试者的门静脉及体循环血浆样本可能更有利于研究 吸收、运输及小鼠体内短链脂肪酸（SCFAs）的系统水平。我们介绍一种从门静脉（PV）和下腔静脉（IVC）高效采血的新技术，可从门脉循环和体循环中采集相对大量的血液。该方法通过结扎门静脉实现，从而允许 用于静脉导管（PV）的扩张或增粗，因其通过回流来自汇入其中的肠系膜静脉的血液而充盈。采用该方法后，我们成功提高了采血成功率以及总采血量（从下腔静脉（IVC）可采集至多0.3 mL，从PV可采集至多0.5 mL）。
引言
短链脂肪酸（SCFA）是一类由肠道微生物群产生的主要代谢产物。它们在肠道微生物组与其他远端器官相互作用中发挥关键作用1 已得到相关研究的描述支持 它们如何调节炎症、通过特异性受体传递信号，以及作为底物参与 细胞代谢2,3,4,5近期研究 我们课题组已提出，短链脂肪酸（SCFAs）是关键因素 体内 肺部免疫稳态的炎症调节因子 体内 通过肠-肺轴6,7. 其他研究已描述其通过肠-脑轴对代谢产生的功能影响8,9总体而言，众多研究团队正在积极深入地探究短链脂肪酸（SCFAs）对宿主生理学和病理学的影响，涵盖多种疾病过程。
乙酸盐（C2）、丙酸盐（C3）和丁酸盐（C4）是主要的短链脂肪酸（SCFAs），由肠道微生物群在盲肠和大肠中通过可摄入膳食纤维的发酵产生。这三种短链脂肪酸 也可直接从饮食中获取，其中只有 乙酸盐可由哺乳动物细胞产生。短链脂肪酸在结肠中被吸收，并部分被肠上皮细胞利用（作为能量来源、用于局部组织的免疫调节以及维持肠道 屏障功能）。它们还通过肠系膜静脉系统进入门静脉10。丁酸盐主要被肠上皮细胞消耗，丙酸盐主要在肝脏中被利用11,12， 而乙酸盐进入外周循环后，已被报道可作用于肌肉和脂肪组织13,14。
全面评估短链脂肪酸（SCFA）的产生、吸收及其功能活性，需要了解结肠腔内、门静脉循环及外周血中的SCFA水平。这可以通过在同一动物中同时或依次从门静脉（PV）和体循环采集血液来实现。由于SCFA具有挥发性15，测定排出的粪便颗粒中的SCFA水平可能 无法准确反映结肠内的实际水平。此外，与结肠内容物的测定相比，门静脉中SCFA的水平可能更能准确反映宿主吸收的稳态水平与肠道微生物组在整个结肠长度上不均一产生的SCFA水平之间的净平衡 11。因此，门静脉中的SCFA水平对于研究SCFA对宿主生理和病理的影响（超出其在肠道内的局部作用）可能更具相关性和适用性。
为了协调并近乎同步地采集门静脉（PV）和体循环血液，应保持膈肌完整，以维持正常的血液循环并支持自主呼吸。因此，下腔静脉（IVC）是采集体循环血液同时获取PV血液的理想部位。该IVC血液还可用于其他用途，例如检测循环细胞因子以评估全身性炎症。
目前，仅有少数几种方法可用于从较大啮齿类动物的体循环和门静脉（PV）采集血液16,17。传统方法需要对大鼠的血管进行插管，但在小鼠中实施这些技术上较为困难。此外，这些方法采集的血液最大量通常不超过 0.3 mL18。
本文介绍了一种简化在同一小鼠中先后经下腔静脉（IVC）和门静脉（PV）进行双重采血过程的新方法 。该方法的独特之处在于门静脉采血前，先在肝门附近结扎门静脉。该操作可扩张门静脉管径，从而显著提高采血成功率，并将最大可采集血量增至0.5 mL。
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方案
本非存活手术的所有步骤均经加州大学旧金山分校机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。所用小鼠的性别与品系为雄性 C57BL/6J 小鼠（体重 25–35 g，年龄 12–15 周）。也可使用雌性或/和其他标准小鼠品系。
1. 麻醉
- 用70%乙醇棉片擦拭小鼠腹部下半部分。通过腹腔注射三溴乙醇（250–400 mg/kg）进行麻醉。也可使用氯胺酮/赛拉嗪或异氟烷进行麻醉。在眼睛上涂抹眼用软膏，以防止角膜损伤。
- 腹腔注射布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg）以进行镇痛。
注意：由于剖腹手术会引起疼痛，必须使用布托啡诺。
2. 剖腹手术
- 将麻醉后的小鼠仰卧置于手术台面（台面下放置加热垫）上，用胶带固定小鼠四肢。通过脚趾刺激确认麻醉深度是否合适 无缩足反射的夹捏
- 提起皮肤，用解剖剪做一纵向切口 从脐部沿中线向剑突方向以及向尾侧至腹部基底部（外生殖器）剪开。
- 使用解剖剪在腹膜上做一个类似的切口，注意不要穿孔或损伤肠道、膈肌或肝脏。
- 扩大手术视野 做一个贯穿全长的横向切口 在脐部两侧用剪刀横向剪开（以扩大腹部宽度）。
- 使用浸有温PBS的干净纱布将大肠和小肠移至术者右侧，以暴露下方的下腔静脉。
3. PV 结扎准备
- 用棉签在手术视野内轻柔地移动肠段，以在肠系膜根部找到门静脉（PV）。
- 使用解剖显微镜观察血管及其他腹部结构 结构，小心地将7-0 Prolene缝线穿过靠近肝门部的门静脉后方（位于肠系膜下静脉与脾静脉之间）19 以便在第5步中进行连接反应（图1).
注意：从这一步开始，使用显微镜并非强制要求，但可显著改善 整个操作的成功率。
4. 从下腔静脉采集血样
- 将肝素化1 mL胰岛素注射器上的28G ½英寸针头插入下腔静脉（IVC），采集0.2–0.3 mL血液样本。
注意：如果此步骤中采集的血液过多，将导致第5步中门静脉（PV）血液采集量减少 。 - 将针头保留在下腔静脉内，以避免拔出时引起出血。
5. 从门静脉采集血液样本
- 用7-0 Prolene缝线轻轻结扎门静脉（PV）；随着血液回流，门静脉应逐渐扩张。将另一支肝素化1 mL胰岛素注射器的28G ½英寸针头插入门静脉。
- 缓慢抽吸，从门静脉采集最多0.3–0.5 mL血液。门静脉可能会塌陷，但应随着肠系膜静脉系统的血液重新充盈而逐渐再次扩张。
6. 样品储存
- 采血后从下腔静脉和门静脉中移除针头。
- 将注射器中的血液样本转移至1.5 mL肝素化 eppendorf 管中，并将 样本置于冰上，后续处理为血浆，用于储存和按需分析。
- 采用麻醉过量法处死小鼠，随后进行颈椎脱位（依照加州大学旧金山分校IACUC批准的指南）。
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结果
采用上述方法，我们可以在同一只小鼠中依次从下腔静脉（IVC）和门静脉（PV）采集血液样本，成功率超过95%。采集到的血液样本平均体积分别为：IVC 0.25 mL，PV 0.35 mL。
采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS），我们测定了粪便、门静脉血和下腔静脉血中短链脂肪酸（SCFAs）的浓度，从而能够追踪乙酸盐（C2）、丙酸盐（C3）和丁酸盐（C4）从结肠腔（由肠道细菌发酵产生）向体循环吸收和转运的过程。
具体而言，在这些实验中，我们研究了膳食纤维摄入对小鼠短链脂肪酸（SCFAs）生成的影响。我们给小鼠喂食高纤维饮食（35% 纤维）1 周或 2 周，并与喂食无纤维饮食的小鼠进行比较。我们预期并观察到高纤维组中纤维发酵菌群的分类群有所增加（数据未显示）。接下来，我们检测了结肠内容物、门静脉（PV）血液以及全身循环（下腔静脉，IVC）血液中的 SCFAs 水平（由密歇根大学代谢组学核心设施通过气相色谱-质谱法（GC-MS）定量）3（图 ...
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讨论
本文描述了一种创新的 体内 近似同步连续采集血液样本的方法 从小鼠的下腔静脉（IVC）和门静脉（PV）采集血液样本。该方法适用于检测肠道微生物群产生的、经门脉循环转运的代谢产物（如短链脂肪酸，SCFAs）的水平。在终末取血实验中，每只体重为25–30 g的小鼠平均最大采血量约为1 mL，相当于其总循环血量的50%。18然而，获得足够的 从两个相互作用的个体中采集血液，用于所需的实验测量 且邻近的静脉系统可能具有挑战性。小鼠门静脉（PV）的血管内压仅比下腔静脉（IVC）高3-5 mmHg。25，因此减少 门静脉（PV）内的压力升高可导致下降 下腔静脉（IVC）内的压力 反之亦然此外，小鼠的门静脉系统由来自肠系膜和脾脏的多条血管分支组成26，相对较小且脆弱。因此，使用解剖显微镜可准确识别门静脉及其相关分支，并防止门静脉和下腔静脉塌陷 对本实验的成功至关重要。
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
AP 由美国国立卫生研究院/国家心脏、肺和血液研究所（NIH/NHLBI）的 R01 项目（1R01HL14653）资助。DM 由美国国立卫生研究院（NIH）的 T32 培训基金以及加州大学旧金山分校贝尼奥夫微生物组医学中心的培训生/工作人员启动奖资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2,2,2 三溴乙醇，97%（Avertin） | Sigma Aldrich | T48402-25G | 麻醉剂 |
| 盐酸丁丙诺啡注射液 0.3 mg/mL | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | 镇痛剂 |
| 敷料镊 | Miltex | 6-100 | 解剖 |
| Graefe 镊 | Roboz | RS-5136 | 解剖 |
| 肝素钠 1000 USP 单位/mL | Hikma | NDC 0641-0391-12 | 血液样本注射器/管肝素化 |
| Prolene 7-0 | Ethicon | 8696G | 门静脉结扎 |
| 剪刀 | F.S.T | 14058-11 | 解剖 |
| 学生型 Halsted-Mosquito 止血钳 | F.S.T | 91308-12 | 解剖 |
| 手术胶带 | 3M Transpore | 1527-1 | 小鼠肢体固定 |
| U-100 胰岛素注射器 28G 1/2 | EXEL | 26027 | 血液样本采集 |
参考文献
- vander Hee, B., Wells, J. M. Microbial regulation of host physiology by short-chain fatty acids. Trends Microbiol. 29 (8), 700-712 (2021).
- Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., Bäckhed, F. From dietary fiber to host physiology: Short-chain fatty acids as key bacterial metabolites. Cell. 165 (6), 1332-1345 (2016).
- Vinolo, M. A. R., Rodrigues, H. G., Nachbar, R. T., Curi, R. Regulation of inflammation by short chain fatty acids. Nutrients. 3 (10), 858-876 (2011).
- Layden, B. T., Angueira, A. R., Brodsky, M., Durai, V., Lowe, W. L. Short chain fatty acids and their receptors: new metabolic targets. Transl Res. 161 (3), 131-140 (2013).
- den Besten, G., et al. The role of short-chain fatty acids in the interplay between diet, gut microbiota, and host energy metabolism. J Lipid Res. 54 (9), 2325-2340 (2013).
- Tian, X., et al. Elevated gut microbiome-derived propionate levels are associated with reduced sterile lung inflammation and bacterial immunity in mice. Front Microbiol. 10, 159(2019).
- Liu, Q., Tian, X., Maruyama, D., Arjomandi, M., Prakash, A. Lung immune tone via gut-lung axis: Gut-derived LPS and short-chain fatty acids’ immunometabolic regulation of lung IL-1β, FFAR2, and FFAR3 expression. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 321 (1), L65-L78 (2021).
- De Vadder, F., et al. Microbiota-generated metabolites promote metabolic benefits via gut-brain neural circuits. Cell. 156 (1-2), 84-96 (2014).
- Dalile, B., Van Oudenhove, L., Vervliet, B., Verbeke, K. The role of short-chain fatty acids in microbiota–gut–brain communication. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (8), 461-478 (2019).
- Sun, M., Wu, W., Liu, Z., Cong, Y. Microbiota metabolite short chain fatty acids, GPCR, and inflammatory bowel diseases. J Gastroenterol. 52 (1), 1-8 (2017).
- Cummings, J. H., Pomare, E. W., Branch, H. W. J., Naylor, C. P. E., MacFarlane, G. T. Short chain fatty acids in human large intestine, portal, hepatic and venous blood. Gut. 28 (10), 1221-1227 (1987).
- Macfarlane, G. T., Gibson, G. R., Cummings, J. H. Comparison of fermentation reactions in different regions of the human colon. J Appl Bacteriol. 72 (1), 57-64 (1992).
- Neis, E. P., et al. Distal versus proximal intestinal short-chain fatty acid release in man. Gut. 68 (4), 764-765 (2019).
- Yamashita, H., et al. Effects of acetate on lipid metabolism in muscles and adipose tissues of type 2 diabetic Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) Rats. Biosci Biotechnol Biochem. 73 (3), 570-576 (2009).
- Ríos-Covián, D., et al. Intestinal short chain fatty acids and their ink with diet and human health. Front Microbiol. 7, 185(2016).
- Jaworska, K., et al. An in vivo method for evaluating the gut-blood barrier and liver metabolism of microbiota products. J Vis Exp. (140), e58456(2018).
- Ashcroft, S. P., et al. Protocol to assess arteriovenous differences across the liver and hindlimb muscles in mice following treadmill exercise. STAR Protoc. 4 (1), 101985(2023).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- Cheever, A. W., Warren, K. S. Portal vein ligation in mice: Portal hypertension, collateral circulation, and blood flow. J Appl Physiol. 18, 405-407 (1963).
- Bloemen, J. G., et al. Short chain fatty acids exchange across the gut and liver in humans measured at surgery. Clin Nutr. 28 (6), 657-661 (2009).
- Hoyles, L., et al. Microbiome–host systems interactions: Protective effects of propionate upon the blood–brain barrier. Microbiome. 6 (1), 55(2018).
- Shimizu, J., et al. Propionate-producing bacteria in the intestine may associate with skewed responses of IL10-producing regulatory T cells in patients with relapsing polychondritis. PLoS One. 13 (9), e0203657(2018).
- Wang, J., et al. Propionate protects against lipopolysaccharide-induced mastitis in mice by restoring blood–milk barrier disruption and suppressing inflammatory response. Front Immunol. 8, 1108(2017).
- Lucas, S., et al. Short-chain fatty acids regulate systemic bone mass and protect from pathological bone loss. Nat Commun. 9 (1), 55(2018).
- Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. J Vis Exp. (92), e51955(2014).
- Sänger, C., et al. Intrahepatic vascular anatomy in rats and mice - Variations and surgical implications. PLoS One. 10 (11), e0141798(2015).
- Phillips, B. J., Mirzaie, M., Turco, L. Portal Vein Injuries: A Review. J Emerg Trauma. 2 (2), 4(2017).
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