通过腹膜外氯化钙与弹性蛋白酶渗透建立的小鼠腹主动脉瘤模型

摘要

本论文介绍了一种利用氯化钙和弹性蛋白酶建立小鼠腹主动脉瘤模型的实验方案，该方法结合了既往建模技术的优点。此模型可用于研究腹主动脉瘤发生的病理生理机制。

摘要

腹主动脉瘤（AAA）是一种与高死亡率相关的危及生命的疾病，其特征是腹主动脉永久性扩张，动脉直径至少增加50%。目前已建立多种AAA动物模型，以模拟其病理生理变化并研究其潜在机制。在这些模型中，氯化钙（CaCl₂）诱导和弹性蛋白酶诱导的AAA模型在小鼠中被广泛使用。然而，这些方法存在一定的局限性：传统的管腔内猪胰弹性蛋白酶（PPE）灌注技术难度高，且破裂率较高；而外膜周围给予PPE则结果不稳定。此外，CaCl₂诱导的AAA模型缺乏人类AAA的关键特征，如动脉粥样硬化性血栓形成和动脉瘤破裂。因此，联合使用CaCl₂和PPE被认为是一种可提高建模成功率并促进动脉瘤直径显著增大的策略。本文提供了一种通过在腹主动脉肾下段周围主动脉浸润PPE和CaCl₂建立小鼠AAA模型的完整实验方案。采用该方案，可实现约90%的AAA形成率，且操作简便、可重复性强。进一步的超声成像和组织学实验表明，该模型能够有效模拟人类AAA的形态学和病理学改变。

引言

腹主动脉瘤（AAA）是指腹主动脉直径增加超过50%，或最大主动脉直径超过3 cm。该疾病具有重大生命威胁，一旦动脉瘤破裂，死亡率约为90%^1,2,3。目前，开放性手术修复和腔内主动脉修复术（EVAR）是AAA患者仅有的可用干预手段^4,5,6。然而，尚无充分证据支持药物治疗在抑制动脉瘤形成或延缓无手术指征患者腹主动脉扩张速度方面的有效性⁷。尽管如此，一些非特异性治疗措施，包括持续监测动脉瘤最大直径、控制血压、抗血小板治疗以及他汀类药物的使用，仍被用于尽可能降低动脉瘤突然破裂及潜在心血管和神经系统事件的风险。然而，抗血小板药物和他汀类药物在预防动脉瘤破裂中的作用仍存在争议，需要进一步研究加以明确^5,7,8,9,

方案

动物实验方案遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》（NIH出版号86/23，1985年），并经四川大学华西医院 Institutional Animal Care and Use Committee 批准（批准号202311300012）。本研究采用8至10周龄雄性C57/B6J小鼠。所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 术前准备

1. 在标准条件（温度 24 °C，湿度 40%-50%，12 小时光照-黑暗循环）下获取实验动物，并给予普通饲料和清洁饮水。
2. 将棉垫剪成 40 mm × 4 mm 的条状，并与剪刀、镊子及其他手术器械一同灭菌。
3. 将动物放入麻醉机的诱导室中，使用 3%-3.5% 异氟烷快速诱导麻醉（遵循机构批准的方案）。同时，给予布托啡诺（1 mg/kg，肌肉注射）作为预先镇痛药物。
   1. 当小鼠对疼痛刺激无反应时，将其从诱导室中取出，戴上麻醉面罩，并以 1%-1.5% 异氟烷维持麻醉深度。每 5-10 分钟监测一次呼吸频率和深度。
4. 将小鼠仰卧置于加热垫上，用胶带固定四肢，并涂抹眼膏以防止角膜干燥。
5. 使用电动剃毛器或脱毛膏彻底清除腹部区域的毛发，然后用浸有聚维酮碘和乙醇的棉签以环形方式至少消毒三次。

结果

本研究共纳入24只小鼠，并随机分组：假手术组12只，PPE + CaCl₂组12只。所有数据均以均值 ± 标准差表示，除非另有说明。平均手术时间为55.67 min ± 4.08 min。术中无死亡或动脉瘤破裂发生，术后21天内存活率为100%。未观察到严重肠粘连或与腹主动脉解剖相关的并发症。

在PPE + CaCl₂组中，12只小鼠中有11只（91.67%）在术后21天发生腹主动脉瘤（AAA），而假手术组未观察到动脉瘤形成。PPE + CaCl₂组的肾下腹主动脉平均最大内径为1.29 mm ± 0.18 mm，而假手术组为0.50 mm ± 0.04 mm。PPE + CaCl₂组肾下腹主动脉内径的平均增长百分比为99.50% ± 25.42%。PPE + CaCl₂组的肾下腹主动脉平均最大外径为1.49 mm ± 0.19 mm，而假手术组为0.61 mm ± 0.04 mm。

假手术组和PPE + CaCl

讨论

研究腹主动脉瘤（AAA）的分子机制需要稳定的动物模型。因此，自20世纪60年代Economou等人首次建立该模型以来，已开发出多种AAA动物模型²⁹。在这些模型中，氯化钙（CaCl₂）因成本低、操作简便且可重复性好，常被用于啮齿类动物。然而，研究表明，血管周围CaCl₂渗透法在诱导AAA形成方面并不稳定。Bi等人和Freestone等人报道，即使将AAA形成的判定标准定义为腹主动脉正常节段直径增加20%，也只有约60%的大鼠成功形成AAA。两项研究均指出，仅对腹主动脉周围单次孵育0.5 mol/L CaCl₂ 20分钟，并未观察到动脉瘤的形成^13,19,26,30。

此外，目前已有文献中对于CaCl₂

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
麻醉机	RWD	R550
丁丙诺啡	江苏恒瑞医药股份有限公司	220608BP	1ml: 1mg
C57BL/6JGpt 雄性小鼠	集萃药康	N000013
氯化钙	Sigma Aldrich	C4901	100 g
卡洛芬	MCE	HY-B1227	100 mg
普通饲料	多斯实验动物有限公司
数显游标卡尺	Greener	IP54
乙醇	津和药业有限公司	539682	75%/500 mL
EVG 染色试剂盒	Solarbio	G1597
GraphPad Prism	Graphpad		Ver 9.0.0
H&E 染色试剂盒	Servicebio	G1076
胰岛素注射器	BD	2143420
异氟烷	RWD	R510-22-4	100 mL
Masson 染色试剂盒	Servicebio	G1006
生理盐水	Servicebio	G4702	500 mL
多聚甲醛	Biosharp	BL539A	4%/500 mL
PBS, 1x	Servicebio	G4202	500 mL
猪胰弹性蛋白酶	Sigma Aldrich	E1250	100 mg
聚维酮碘	永安制药有限公司		5%/100 mg
普理灵聚丙烯缝线	Ethicon LLC	8709H
啮齿类动物超声成像系统	Fujifilm	Vevo 3100LT
体视显微镜	Olympus	SZ61
超声耦合剂	Keppler	KL-250	250 g