多种细菌性病原体可引起呼吸道感染，若未能准确检测并及时治疗，可能导致严重的健康问题。通过环介导等温扩增技术 对这些病原体进行快速且准确的检测，有助于在临床环境中有效管理和控制呼吸道感染。
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方法文章
基于微流控芯片的环介导等温扩增技术快速检测引起下呼吸道感染的细菌性病原体
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
呼吸道感染（RTIs）是临床中最常见的问题之一。快速且准确地鉴定致病菌可为呼吸道感染的管理和治疗提供实用的指导依据。本研究描述了一种通过多通道环介导等温扩增（LAMP）技术快速检测引起呼吸道感染的致病菌的方法。LAMP 是一种灵敏且特异的诊断工具，能够快速、高准确度和高可靠性地检测细菌核酸。与传统细菌培养方法相比，该方法具有显著优势，后者耗时较长，且在检测低水平细菌核酸时常需更高的灵敏度。本文展示了利用 LAMP 检测下呼吸道样本（痰液、支气管灌洗液和肺泡灌洗液）中肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）感染及其多种共感染的代表性结果。综上所述，多通道 LAMP 方法为临床样本中单一及多重致病菌的快速高效鉴定提供了有效手段，有助于防止致病菌的传播，并促进呼吸道感染的合理治疗。
引言
由细菌病原体引起的呼吸道感染（RTIs）是全球范围内发病率和死亡率的主要原因1。呼吸道感染定义为伴有持续2-3天发热的任何上呼吸道或下呼吸道症状。尽管上呼吸道感染比下呼吸道感染更为常见，但慢性及反复发作的呼吸道感染也是常见的临床病症，对个体构成重大风险，并给医疗系统带来显著负担2。常见的RTIs细菌病原体包括Streptococcus pneumoniae3、Haemophilus influenzae4、Staphylococcus aureus、Escherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Stenotrophomonas maltophilia等。这些致病菌通常定植于宿主鼻咽部和上呼吸道的黏膜表面，引起RTIs的典型症状，如咽喉痛和支气管炎。当它们从上呼吸道扩散至下呼吸道无菌区域时，可导致肺炎，并可通过呼吸道在人际间传播5。在严重情况下，还可引发侵袭性细菌性疾病，尤其是菌血性肺炎、脑膜炎和败血症，这些是全球各年龄段人群发病率和死亡率的主要原因。
传统的呼吸道感染（RTIs）检测方法包括使用咽拭子和痰液呼吸样本进行微生物培养6。此外，血清学检测方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）可用于检测血清中的抗体或抗原，而凝集试验则通过观察抗体与抗原的凝集反应来诊断感染7。微生物培养被认为是诊断RTIs的金标准，但其培养阳性率低、可靠性差以及检测周期长，限制了诊断效率8。实际上，对RTIs进行快速而准确的诊断对于精准清除致病菌至关重要。快速有效的检测方法有助于降低病原体传播率、缩短感染持续时间，并减少不必要的抗生素使用9,10。基于分子生物学的检测方法显著加快了病原体检出速度，例如聚合酶链式反应（PCR），该方法通过扩增目标基因的DNA序列来检测病原体。然而，传统PCR需要复杂的温度循环设备，操作繁琐且耗时。此外，每次PCR扩增（实时PCR除外）完成后还需进行扩增产物的电泳分离，进一步延长了检测时间。扩增产物的可视化依赖染料，而许多染料具有致突变性或致癌性。因此，持续开发新的诊断技术和方法以检测RTI致病菌显得尤为必要。
环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP）是一种由Notomi等人于2000年首次开发的新型且不断发展的分子检测技术11。LAMP可在稳定的等温条件下扩增DNA，无需复杂的温度循环设备，因此适用于快速检测，并可降低设备的复杂性和成本12。LAMP具有高灵敏度，能够检测到极低浓度的目标DNA13。该技术利用多对特异性引物，提高对目标序列的选择性，降低假阳性结果的可能性14。由于其操作简便、快速且直观，LAMP正逐渐在临床实验室中得到广泛应用，甚至可用于呼吸道感染（RTIs）的检测。在本研究中，我们评估了LAMP在临床样本（痰液、支气管灌洗液和肺泡灌洗液）中检测下呼吸道感染的效果，如图1所示。显然，与传统检测方法相比，LAMP在下呼吸道感染检测中具有速度快、灵敏度高和操作简便等优势，展现出良好的应用前景。
图1：LAMP检测方法的示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。
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方案
本研究的所有样本均经广东省人民医院伦理审查委员会评估并批准（批准文号：KY2023-1114-01）。所有参与者在实验前均签署了书面知情同意书。研究中使用的试剂和设备列于材料表中。本方案中使用的缩写词见补充表1。
1. 下呼吸道临床样本的采集
- 痰液采集
- 用清水清洁口腔和牙齿，如有义齿应取下。用力咳嗽，将深部呼吸道痰液咳入痰液收集容器中（至少 0.6 mL）。
- 避免混入唾液或鼻腔分泌物。若咳嗽困难，可吸入 45 °C 的 100 g/L NaCl 溶液以促进排痰。将标本转移至无菌、可密封的容器中。
注意：确保痰液样本在早晨采集，且在使用任何抗菌药物之前进行。
- 支气管灌洗液（BLF）
- 从鼻孔或气管造口处将收集头插入气管（约 30 cm 深度）。注入 5 mL 生理盐水，建立负压，旋转收集头，然后缓慢撤出。
- 收集提取的黏液，并用采样液（生理盐水或注射用无菌水）冲洗收集头一次。也可将儿科导尿管连接至 50 mL 注射器作为替代收集装置。
- 肺泡灌洗液（ALF）
- 通过胸部影像学检查确定病变位置，选择病变更显著或进展较快的区域进行灌洗。
- 灌洗过程中，经活检通道向支气管段注入 1-2 mL 的 2% 利多卡因，对灌洗肺段实施局部麻醉15。对于接受静脉全身麻醉但仍出现明显气道反应的患者，可追加注射 1-2 mL 的 2% 利多卡因。
- 局部麻醉后，经口或鼻插入纤维支气管镜，通过咽部进入右肺中叶或左肺舌段支气管，将镜端置于支气管分支开口处，缓慢注入无菌生理盐水。
- 每次注入 30-50 mL 生理盐水，总灌洗量为 100-250 mL（最多不超过 300 mL）。将回收的灌洗液收集于密闭无菌容器中。
2. DNA 提取
- 根据下呼吸道样本的黏稠度，加入适量的10% NaOH。对于低黏度样本，加入2-3倍样本体积的液化液；对于中等黏度样本，加入5-6倍样本体积的液化液；对于高黏度样本，加入8-10倍样本体积的液化液。
- 根据样本黏稠度调整10% NaOH的用量。使用涡旋混合器充分混匀样本约15秒，于37 °C孵育30分钟以实现液化。
注：对于更黏稠的样本，可增加NaOH用量或延长液化时间。样本液化质量直接影响后续提取效率。理想情况下，液化后的样本应呈现均匀、不黏稠的状态。
- 根据样本黏稠度调整10% NaOH的用量。使用涡旋混合器充分混匀样本约15秒，于37 °C孵育30分钟以实现液化。
- 取1 mL液化后的样本加入1.5 mL离心管中，于2-6 °C条件下以15,777 × g离心5分钟，随后用移液器吸除并弃去上清液。
注：吸取样本时应避免吸入管底杂质；若杂质较多，可在吸取前以1,753-2,739 × g离心1分钟。 - 向离心管中加入1 mL洗涤液，涡旋震荡使沉淀从管底悬浮，无需完全分散。
- 以15,777 × g离心5分钟，弃去上清液，操作时尽量避免触碰沉淀。
注：应彻底去除残留洗涤液，以免影响后续扩增反应。
- 以15,777 × g离心5分钟，弃去上清液，操作时尽量避免触碰沉淀。
- 向离心管中加入100 µL核酸提取液，用移液器充分吸打混匀沉淀。将液体与沉淀一同转移至核酸提取管中。核酸提取液的组成见表1。
- 将核酸提取管置于涡旋混合器中，以中等速度涡旋至少5分钟。涡旋完成后，将核酸提取管转移至恒温金属浴中，于100 °C加热5分钟。
- 于2-6 °C条件下以15,777 × g离心5分钟，暂存备用。
注：若在24小时内进行PCR扩增反应，核酸可保存于4 °C；扩增完成后，应将核酸保存于-20 °C。对于长期保存（超过24小时），需将核酸置于-20 °C保存。再次使用时，将样本自然解冻，涡旋混匀，于95 °C水浴中加热5分钟，以10,956 × g离心1分钟，取上清液用于PCR扩增。
| 溶液 | 组分 | 数量 | 规格 |
| 洗涤液 | 10 mM EDTA | 1 瓶 | 24 mL/瓶 |
| 核酸提取试剂 | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 核酸防腐剂 | 2 管 | 1.2 mL/瓶 |
| 核酸提取管 | 玻璃珠 | 1 袋 | 24 瓶/袋 |
表1：核酸提取试剂的组成成分。
3. 环介导等温扩增与微流控芯片
- 试剂与微流控芯片
- 在微型盘状微流控芯片上进行等温扩增反应（参见 材料清单）。在恒温条件下进行扩增反应 65 °C.
- 使用荧光染料掺入法进行实时荧光分析14 在恒温扩增微流控芯片核酸分析仪上，使用具有链置换功能的聚合酶，观察阳性样本的S形扩增曲线。
- 环介导等温扩增
- 使用四条特异性引物（随 LAMP 试剂盒提供），包括两条内引物和两条外引物，靶向六个序列区域。
注意：使用具有链置换功能的DNA聚合酶，在恒定温度下对DNA进行持续复制和扩增。反应过程包括哑铃形模板合成阶段、循环扩增阶段、延伸阶段及再循环阶段，最终形成含有茎环结构和花椰菜样结构的DNA片段混合物。详细信息请参阅试剂盒说明书（补充文件 1). - 向反应体系中加入两环引物以提高反应效率，该引物可结合茎环结构，启动链置换合成及循环扩增。呼吸道病原体核酸检测试剂盒的组成如下 表2.
注意：该试剂盒采用 LAMP 方法。其原理基于 DNA 在约 65 °C，其中在双链DNA的互补位点通过碱基配对延伸的引物会导致另一条链解离，形成单链。
- 使用四条特异性引物（随 LAMP 试剂盒提供），包括两条内引物和两条外引物，靶向六个序列区域。
- 微流控芯片
注意：每个微流控芯片（参见 材料清单) 配备有24个按逆时针方向编号的反应孔，其中1号孔的入口和出口对应于反应孔1（图2每个反应孔中均固定了一组用于扩增和检测特定核酸靶序列的特异性引物。- 将样本 DNA 与扩增试剂混合。将混合物注入芯片中，并通过离心（1,000 × g）分配至各反应孔 g 室温下持续30秒。
注意：芯片上每个反应孔中同时独立进行恒温扩增反应和实时荧光检测。若在某一反应孔中检测到S型扩增曲线，则该孔对应的检测指标为阳性。
- 将样本 DNA 与扩增试剂混合。将混合物注入芯片中，并通过离心（1,000 × g）分配至各反应孔 g 室温下持续30秒。
| 组分 | 组成 | 数量 |
| 芯片 | 引物 | 12 个位点 |
| 封膜 | / | 1 张 |
| 等温扩增试剂 | 荧光染料，酶 | 270 µL/管 |
| 阳性对照 | 大肠杆菌基因组 DNA | 160 µL/管 |
表2：呼吸道病原体核酸检测试剂盒的组成。
图 2：盘片芯片结构示意图。 反应孔按逆时针方向依次编号，其中进/出样口 1 对应反应孔 1。反应孔 1、4、7、10、13、16、19、22 和 24 为阴性对照。反应孔 6 为阳性对照（E. coli）。反应孔 12 为内部阳性对照，反应孔 23 为外部阳性对照。反应孔 2 检测 spn。反应孔 3 检测 sau。反应孔 5 检测 MRSA。反应孔 8 检测 kpn。反应孔 9 检测 pae。反应孔 11 检测 aba。反应孔 14 检测 sma。反应孔 15 检测 hin。样品详情请见 表 5。请点击此处查看该图的放大版本。
4. 样品制备与细菌检测
- 准备等温扩增反应体系
- 取出试剂盒中的等温扩增试剂，室温下充分解冻。轻轻振荡混匀，并短暂离心使液体聚集于离心管底部。
- 在试剂储存与准备区域，用移液器将 20 µL 等温扩增试剂加入已准备好的 200 µL 离心管中。盖好管盖，每份样本对应一个离心管，转移至样本制备区域。
- 在样本制备区域，加入 34.5 µL 待测核酸样本。轻轻振荡充分混匀，并短暂离心使液体聚集于管底。每个核酸扩增反应体系的总体积为 54.5 µL（表 3）。
- 芯片加样程序
- 在芯片包装上标记样本编号。打开微流控芯片，使包装标签面朝上。
- 将芯片放置为进样口和出样口朝上。使用移液器吸取 50 µL 已配制的扩增反应体系，通过进样口加入芯片的主通道中。当主通道充满后停止加样，并立即用无尘纸快速擦去进样口和出样口周围的多余液体。
- 使用镊子取一张封膜，覆盖在进样口和出样口上。用洁净的移液器吸头单向按压封膜，确保密封严密。
- qPCR 反应
- 核酸分析仪光源完成预热后，点击 打开托盘 按钮。将芯片正面朝上放置于托盘中，确保定位小圆柱从芯片中心缝隙中伸出以固定芯片。将托盘中的中心定位装置与芯片中央的大孔对齐。
- 点击 关闭托盘 按钮，将芯片插入核酸分析仪中。
- 在检测界面的 样本信息 区域，输入待测样本的相关信息。样本编号、芯片编号和样本类型为必填项；其余为可选项。
- 在操作区域点击 开始检测 按钮，启动样本检测。仪器将按照预设程序自动进行样本检测。
注：检测完成后，设备配套软件将自动进行数据分析。同时，核酸分析仪将启动自动降温程序。当温度降至 37 °C 时，仪器自动打开托盘并弹出芯片以便取回。系统将自动判读检测结果（表 4）。
- 质量控制标准
- 本试剂盒每张芯片内含一个阳性质控和九个阴性质控。需确保阳性质控检测结果为阳性，同时九个阴性质控结果均为阴性。
注：若图像右侧显示“质控结果：实验正常（阳性正常，阴性正常）”，表明检测结果有效。若任一质控结果异常，则需重新检测，且本次样本检测结果视为无效。芯片内含一个人源特异性引物的阳性内参，临床样本检测时结果应为阳性；若样本中人基因组 DNA 含量较低，则结果为阴性，提示细胞数量较少。此种情况下应重新采集并复检样本。
- 本试剂盒每张芯片内含一个阳性质控和九个阴性质控。需确保阳性质控检测结果为阳性，同时九个阴性质控结果均为阴性。
- 结果分析
- 检测完成后，软件采用二阶导数最大值法结合商业保护算法，计算 S 型扩增曲线在快速扩增阶段的第一个拐点。具体原理详见《呼吸道病原体核酸检测试剂盒说明书》中“检测原理”部分（补充文件 1）。
注：TP 值为拐点与原点之间的时间差。结果依据 TP 值与阳性判断值进行判读。若某检测指标的 TP 值小于或等于该指标的阳性判断值，则判为阳性；若 TP 值大于阳性判断值，则判为阴性，具体标准参照说明书中的“阳性判定值”规定。“荧光曲线区域”显示归一化后的曲线，“检测结果”区域显示各参数的质控与检测结果（表 5）。
- 检测完成后，软件采用二阶导数最大值法结合商业保护算法，计算 S 型扩增曲线在快速扩增阶段的第一个拐点。具体原理详见《呼吸道病原体核酸检测试剂盒说明书》中“检测原理”部分（补充文件 1）。
| 反应物 | 体积 (µl) |
| 等温扩增试剂 | 20 |
| 模板DNA | 34.5 |
表3：等温扩增反应体系。
| 步骤 | 一 | 二 |
| 温度 (°C) | 37 | 65 |
| 时间 (min) | 3 | 47 |
表4：核酸扩增反应程序。
| 指示剂名称 | 阳性对照值 |
| Streptococcus pneumoniae (sp) | 30 |
| Staphylococcus aureus (sau) | 34 |
| Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (mrsa) | 22 |
| Klebsiella pneumoniae (kpn) | 29 |
| Pseudomonas aeruginosa (pae) | 36 |
| Acinetobacter baumannii (aba) | 36 |
| Stenotrophomonas maltophilia (sma) | 27 |
| Haemophilus influenzae (hin) | 36 |
表5：感染指示剂的阳性对照值。
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结果
本实验采用等温扩增技术，在微流控圆盘芯片上进行反应。反应在微流控芯片核酸分析仪上进行，使用荧光染料插入法。等温反应在恒定的65 °C温度下进行，同时进行实时荧光分析。阳性样本在具有链置换功能的聚合酶作用下发生扩增，产生S形扩增曲线。该一步法过程即可完成目标基因的扩增与检测。本研究选取了7个具有不同实验结果的样本，以证明实验设计的可靠性。大写字母S代表样本。S1为单一致病菌K. pneumoniae感染的样本。S2至S7均为多重微生物感染的样本，均含有K. pneumoniae。为获得有效的检测结果，可通过图像中显示的归一化荧光曲线进行判读。阳性指标表现为呈现S形的扩增曲线，而水平直线则代表阴性指标（图3）。
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讨论
呼吸道感染是常见的医院相关性感染，对患者造成严重后果，并增加死亡率16。及时准确地识别潜在病原体并给予有效抗生素治疗，是成功治疗和改善预后的关键，尤其是在传统培养方法存在固有局限性的背景下17。在本研究中，我们采用基于环介导等温扩增（LAMP）的方法，用于快速、精确地检测呼吸道感染的单一或多重感染。该快速检测系统通过将LAMP技术与微流控技术相结合而建立。可从痰液、支气管肺泡灌洗液（BLF）和肺泡灌洗液（ALF）等临床样本中快速提取核酸。提取的核酸材料有助于对细菌性病原体进行快速而准确的检测，从而指导临床实践，提升对呼吸道感染的控制与治疗效果。
既往研究表明，与基于培养的方法和聚合酶链式反应相比，LAMP 检测在纯培养物和血液样本中具有100%的灵敏度和特异性，且与其他细菌无交叉反应18。LAMP 检测还可直接从血液、胸腔积液、腹腔积液和脑脊液等生物液体中检测病原体19。已有研究证实，外源性 ...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们非常感谢广东省基础与应用基础研究基金（资助号：2022A1515220023）和广东省人民医院高层次人才研究基金（资助号：KY012023293）提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 浴槽培养箱（MK2000-2） | ALLSHENG | 提供恒温环境 | |
| 支气管灌洗液收集头 | TIANPINGHUACHANG | SEDA 20172081375 | 收集支气管肺泡灌洗液 |
| 纤维支气管镜 | OLYMPUS | SEDA 20153062703 | 配备光纤光源和摄像头的软性支气管镜，用于直观检查气道及肺内结构，辅助采集支气管肺泡灌洗液 |
HR1500- B2 | Haier | SEDA 20183541642 | 生物安全柜 |
| NAOH | MACKLIN | S817977 | 液化黏稠的下呼吸道样本 |
| 呼吸道病原体核酸检测试剂盒 | Capitalbio Technology | SEDA 20173401346 | 检测细菌感染 |
| 核酸提取试剂 | Capitalbio Technology | SEDA 20160034 | 用于DNA提取 |
| RTisochip-W | Capitalbio Technology | SEDA 20193220539 | 环介导等温扩增 |
| THERMO ST16R | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20180585 | 离心去除管壁残留液体 |
| 涡旋混合器 VM-5005 | JOANLAB | 用于试剂混匀 |
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