本文以 phiC31 整合酶介导的果蝇转基因为例，介绍了一种优化的胚胎显微注射方案， 这是创建转基因果蝇的关键步骤。
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摘要
摘要
在 Drosophila 中进行转基因是研究基因在个体水平上功能的重要方法。胚胎显微注射是构建转基因果蝇的关键步骤。显微注射需要多种设备，包括显微注射仪、显微操作器、倒置显微镜和体视显微镜。 使用质粒小提试剂盒提取的质粒可用于显微注射。处于囊胚前期或合胞体囊胚期的胚胎（此时细胞核共享同一细胞质）适合进行显微注射。细胞筛可简化胚胎去壳过程。胚胎去壳和干燥的最佳时间需通过实验确定。为提高胚胎显微注射效率，需使用拉针仪制备注射针，并用针尖研磨器对针尖进行斜面处理。在研磨针尖过程中，我们使用带有压力表的脚踏式气泵，以避免针尖产生毛细效应。 我们通常对每种质粒注射120–140个胚胎，约85%的质粒可获得至少一个转基因品系。本文以phiC31整合酶介导的 Drosophila转基因为例， 详细介绍了Drosophila胚胎显微注射的实验方案。
引言
果蝇 黑腹果蝇 非常适合进行遗传操作和遗传分析。转基因果蝇在生物研究中被广泛使用。自20世纪80年代初建立以来，P元件转座子介导的转基因技术一直是不可或缺的 果蝇 研究1在某些情况下，其他转座子（如 piggyBac 和 Minos）已被用于转基因研究 果蝇 同样2通过转座子将转基因随机插入到 果蝇 基因组，且由于位置效应，不同基因组位点上外源基因的表达水平可能存在差异，因此无法进行比较2这些缺点通过phiC31介导的位点特异性转基因技术得以克服3噬菌体 phiC31 基因编码一种整合酶，该酶介导 attB 与 attP 位点之间的序列特异性重组 果蝇3已鉴定出多个attP整合位点，可在布卢明顿果蝇中心获取 果蝇 菌种保藏中心3,4,5,6,7,8,9.
Drosophila 的 phiC31 转基因系统已被果蝇研究领域广泛使用。在众多 attP 整合位点中，位于 X 染色体上的 attP18、第二染色体上的 attP40 和第三染色体上的 attP2 通常是各染色体上外源基因整合的首选位点，因为在这三个位点插入的转基因能够表现出高水平的可诱导表达，同时具有较低的基础表达水平5。然而，van der Graaf 及其同事最近发现，attP40 位点靠近 Msp300 基因位点，且在 attP40 位点整合的转基因会导致 Drosophila 幼虫肌肉细胞核出现聚集现象10。在另一项近期研究中，Duan 及其同事发现，纯合的 attP40 染色体会破坏 Drosophila Or47b 嗅觉受体神经元类群正常的肾小球组织结构11。这些发现提示，在实验设计和数据分析时应包含严格的对照。
果蝇 是进行研究的理想模式生物 体内 由于其生命周期短、成本低且易于培养，可用于基因功能研究。全基因组遗传筛选依赖于构建全基因组范围的转基因文库 果蝇12,13,14,15我们先前基于GAL4/上游激活序列双元系统构建了5551个UAS-cDNA/ORF载体 (GAL4/UAS 系统，覆盖了83%的 果蝇 在人类中保守的基因 果蝇 基因组资源中心（DGRC）黄金文库16UAS-cDNA/ORF 质粒可用于构建转基因 UAS-cDNA/ORF 文库 果蝇高效的胚胎显微注射技术可加速转基因果蝇品系库的构建。
进行胚胎显微注射时，通常需将注射针尖在盖玻片上折断以形成开口17。然而，这种方法常导致针头堵塞或引起大量细胞质泄漏；一旦出现这些问题，就必须更换新的注射针。尽管对针尖进行斜面打磨可提高显微注射效率，但在打磨过程中，研磨液会进入斜面针尖内部。该研磨液无法在常温下迅速自然蒸发，因此打磨后的针头不能立即用于显微注射。 上述因素均会降低胚胎显微注射的操作效率。本文以phiC31介导的位点特异性转基因技术在Drosophila中的应用为例，介绍一种适用于Drosophila的胚胎显微注射实验方案。 为防止研磨液进入针头内部，我们采用气泵向针管内施加气压，从而阻止研磨液渗入斜面针尖。经此处理后，打磨后的针头可在打磨完成后直接用于样品装载和显微注射。
方案
1. 质粒的制备
- 使用质粒小提试剂盒从4 mL过夜培养的细菌培养物中提取质粒，用40 µL洗脱缓冲液洗脱。
注意：无需使用质粒中提试剂盒进行质粒提取，质粒小提试剂盒已完全满足胚胎显微注射的实验需求。本方案中制备的UAS-cDNA/ORF质粒包含十个UAS拷贝、Hsp70最小启动子、attB位点、mini-white基因以及目的基因。 - 使用分光光度计测定质粒DNA浓度，并储存于-80 °C冰箱中。
注意：质粒浓度对胚胎显微注射的成功并非关键因素，因为在果蝇（Drosophila）转基因实验中，20 ng/µL至1683 ng/µL范围内的质粒浓度均表现良好（补充表1）。 - 显微注射前，将质粒解冻并在13000 x g条件下离心5分钟。
- 从液体上层吸取每种质粒10 µL，转移至新的1.5 mL离心管中。
2. 拉制玻璃毛细管
- 打开程序设定的拉针仪（加热：500，拉力：50，速度：60，延迟：90，压力：200，斜坡测试：510）。
- 将一根硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 1.0 mm，内径 0.75 mm，长度 10 cm）插入拉针仪中，并合上盖子。
- 按下 拉针 按钮。每根玻璃毛细管可制成两根针。
3. 研磨针（图1）
- 使用装有适当磨料盘（适用于 0.7–2.0 µm 尖端尺寸）的针头研磨仪。
- 用研磨液（100 mL 蒸馏水中含 0.9 g NaCl 和 1 mL 润湿剂）润湿布料（参考导线），并固定布料。
- 打开针头研磨仪，保持研磨盘旋转。
- 通过硅胶毛细管将针头连接至带压力表的脚控气泵，然后将针头安装到针头研磨仪的针头夹持器上。在显微镜下调节针头相对于研磨盘的角度至 35°（图 1A，B）。
- 在显微镜下使用粗调旋钮调节针尖位置，使其刚好位于研磨盘表面之上（图 1C）。
注意：第 2 步中拉制得到的针头具有 6–8 mm 的锥形部分和小于 1 µm 的尖端（图 1D），具体如拉针仪用户手册所述。 - 使用脚控气泵将针头内部压力保持在 40 psi。在显微镜下使用微调旋钮调节针尖位置，使针尖接触研磨盘表面。
- 研磨 3–5 秒。当微小气泡从针尖逸出时，卸下针头（图 1E）。
注意：研磨过程中使用气泵可防止研磨液发生虹吸。 - 将研磨后的针头放入储存盒中。
注意：应尽可能使用新研磨的针头，尽管研磨后的针头在显微注射前可在储存盒中保存至少数周。
4. 准备移液器以装载质粒
- 用酒精灯的外焰加热一支 200 µL 的移液枪头。
- 当枪头开始熔化时，将其拉伸。
- 用剪刀剪去拉伸后枪头的封闭端，即可用于向研磨针中装载 DNA。
注意：也可购买市售的极长且细的枪头，用于填充研磨针。 - 将这些枪头放入经高压灭菌的塑料盒中。
5. 收集胚胎
- 收集表达 phiC31 整合酶并携带 attP2 定点插入位点的果蝇（vas-phiC31; + ; attP2），在 50 个培养瓶中孵化后 3 天收集，并转移至一个笼子（φ 90 mm × 150 mm）中。在每块葡萄糖琼脂平板中央添加少量新鲜酵母糊18。
- 准备 2–4 个果蝇笼。将笼子和平板置于 25 °C 培养，每天更换平板，持续 2–4 天。
注意：本研究结合了位于第一染色体上的 vas-phiC31 转基因（菌株编号 #36313，Bloomington Drosophila 菌种中心）和位于第三染色体上的 attP2 转基因（菌株编号 #36313，Bloomington Drosophila 菌种中心）。由此获得的品系（vas-phiC31; + ; attP2）用于本实验方案。酵母糊需每日新鲜配制，并每日喂食果蝇。更换后的笼子需彻底清理并干燥，以去除残留的胚胎。 - 显微注射当天，于早晨更换笼子和平板。随后每隔 30 分钟更换一次平板，并从这些平板上收集胚胎。所有笼子和平板的更换均在室温（RT）下进行，之后将笼子和平板继续置于 25 °C 培养。
注意：部分实验方案倾向于将笼子和平板在 18 °C 下孵育以促进产卵。具体温度选择取决于显微注射所需胚胎的数量。
6. 胚胎去壳
- 通过将60 mL漂白剂（含活性氯34-46 g/L）与140 mL双蒸水混合，配制30%的漂白液。
- 用毛刷或镊子清除葡萄汁琼脂平板上残留的果蝇，并用双蒸水将胚胎冲洗至细胞筛中。
- 用纸巾将含有胚胎的细胞筛表面吸干。
- 将其放入盛有30%漂白液的培养皿中，手动或使用水平摇床以60 rpm的速度振荡1.5分钟。
注意：漂洗是关键步骤。若漂洗时间不足，胚胎外壳无法完全去除；若漂洗时间过长，会导致胚胎变软并容易破裂。细胞筛应完全浸没在30%漂白液中。操作时需佩戴橡胶手套和实验服，以防漂白剂造成伤害。 - 使用实验室塑料洗瓶中的双蒸水冲洗胚胎2分钟，以去除残留的漂白剂。挑选漂浮的胚胎用于后续排列。
7. 胚胎排列
- 使用刀片将固体葡萄汁琼脂切成条状。
注意：使用紫色葡萄汁琼脂，以便更清晰地排列白色胚胎。 - 使用画笔将胚胎转移至长条形琼脂上。
- 用解剖针将约60个胚胎沿长条边缘排列整齐，使胚胎的后端朝向琼脂条外侧。在5分钟内完成约60个胚胎的排列。
注意：胚孔（micropyle）是胚胎前端极的一个圆锥形突起，精子通过该结构进入并使卵细胞受精（图2A）。因此，根据胚胎前端极的圆锥形突起，可容易地判断去壳胚胎的后端位置。 - 将一段18 mm双面胶沿盖玻片（18 mm × 18 mm）边缘纵向粘贴，并移除纸衬。轻轻将盖玻片压在已排列好的胚胎上，确保胚胎粘附在胶带中央位置。
8. 胚胎干燥处理
- 将带有排列整齐胚胎的盖玻片放入含有干燥剂的盒子中。干燥时间根据温度和湿度而有所不同。
注意：干燥时间对显微注射至关重要，需通过实验确定。通常夏季为9-10分钟，冬季为17-18分钟。 - 用卤代烃油覆盖胚胎。
注意：不要将过多的油滴加到胚胎上，以免多余的油溢出粘合剂。卤代烃油700与卤代烃油27的体积比为1:3。
9. 胚胎显微注射
- 使用拉制好的移液枪将 2 µL DNA 加载到注射针中。确保针内无气泡。将注射针放入显微操作仪的针夹中。
- 将覆盖有卤代烃油的已排列胚胎置于倒置显微镜下。确保胚胎的后端朝向注射针。
- 使用显微操作仪将注射针移近胚胎。排出针内空气，确保可见液体从针尖滴出。初始设置为 300 hPa 注射压力和 20 hPa 平衡压力，调节注射压力与平衡压力，以获得适宜大小的液滴。
- 使用显微操作仪将注射针插入胚胎后端，并通过连接至显微注射仪的脚踏控制器注入 DNA（图 2）。若观察到微小光晕，则表明 DNA 已成功注入胚胎。
注意：选择多核胚胎进行注射，并使用 "clean" 按钮清除较老的胚胎。若注射后有大量细胞质外泄，说明胚胎脱水不足；若仅有少量或无细胞质外泄，则视为注射成功。若超过三分之一的胚胎在注射后出现细胞质泄漏，应延长干燥时间 1–2 分钟；若超过三分之一的胚胎脱水过度，则应缩短干燥时间 1–2 分钟。 - 将注射针从胚胎中退出。将针移动至下一个胚胎的后端，重复上述步骤。
- 将已注射的胚胎转移至琼脂培养皿中。将培养皿置于 18–20 °C 的环境中。次日，将培养皿转移至温度为 25 °C 、湿度为 50%–60% 的培养箱中，继续培养 1 天。
注意：注射后将胚胎保持在 18–20 °C 可减缓其发育速度，促进质粒 DNA 整合入黑腹果蝇（Drosophila）基因组，并提高注射胚胎的存活率。
10. 收集幼虫
- 使用解剖针刮取并松动试剂瓶中的食物，加入几滴蒸馏水润湿。
注意：让蒸馏水被食物吸收，以防止幼虫溺亡。 - 从培养箱中取出培养皿。
- 在体视显微镜下用毛笔收集孵化的幼虫，并转移至小瓶中。
- 将小瓶置于25 °C的培养箱中 和湿度 50%-60%.
11. 获得转基因果蝇
- 在试管于25 °C培养后收集羽化的果蝇 10天。
- 将一只雄蝇与三只 TM2/TM6C Sb 基因型的 virgin 雌蝇杂交1 Tb1 平衡染色体，将一只雌蝇与三只 TM2/TM6C Sb 雄蝇杂交1 Tb1 平衡染色体
- 将杂交样本置于25 °C、湿度为50%-60%的培养箱中。
- 筛选具有橙色眼睛的子代果蝇，这些即为转基因果蝇（图3A- C).
注意：在 attP2 整合位点携带一个转基因拷贝的果蝇具有橙色眼睛。 - 将一只橙眼雄蝇与三只TM2/TM6C Sb的处女雌蝇杂交1 Tb1 平衡染色体以建立品系。
注意：为了消除第一染色体上的 phiC31 转基因，需要设置多代杂交。
结果
注射针的针尖由针头研磨器磨成斜面（图1）。每小时可磨制50-60根针头。DNA显微注射在囊胚前期或合胞体囊胚期胚胎的后端进行，此时细胞核共享同一细胞质（图2A）。胚胎的后端可根据位于胚胎前端的精孔来快速定位（图2A）。细胞囊胚期和原肠胚形成期的胚胎不可用于注射，因为在这些阶段每个细胞核均被细胞膜包围，因此获得转基因果蝇的几率几乎为零（图2B）。过度干燥的胚胎在穿刺时会发生变形，无法用于显微注射（图2C）。干燥不足的胚胎在被针头刺入时会溢出大量细胞质（图2D），导致胚胎存活率降低。适当干燥的胚胎在注射时可能仅渗出少量细胞质，也可能不渗出（图2E）。
的 果蝇 表达 phiC31 整合酶并带有 attP2 定点插入位点、用于本方案中胚胎显微注射的果蝇品系具有白眼表型（图3A），该基因型的衰老果蝇由于眼睛中特异性表达的红色荧光蛋白积累而呈现粉红色眼睛图3B）。我们使用 mini-white 基因作为转基因的筛选标记 果蝇，通过眼睛颜色从浅黄色到红色的变化来鉴定转基因果蝇。在attP2整合位点携带转基因的转基因果蝇具有橙色眼睛（图3C），这一点可以通过不携带任何转基因的果蝇轻松识别。
图 1：针头的研磨。（A）使用带压力表的脚踏气泵向针头施加气压。（B）将针头以35°角固定在针头研磨器的研磨板表面。（C）使用粗调旋钮将针尖调整至略高于研磨板表面的位置，然后使用微调旋钮开始对针尖进行斜面研磨。（D）拉制后的针尖在显微镜下的图像。比例尺 = 10 µm。（E）斜面研磨后的针头在显微镜下的图像，箭头指示针尖的斜面部分。比例尺 = 10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：适用于显微注射的 Drosophila 胚胎。（A）处于前囊胚期或合胞体囊胚期的 Drosophila 胚胎可在其后极进行注射，图中红色椭圆标示该位置；胚胎前极的精孔由箭头指示。（B）处于细胞化囊胚期的 Drosophila 胚胎不可用于显微注射。（C）过度干燥的胚胎会呈现畸形。（D）干燥不足的胚胎在注射后会出现大量胞质泄漏。（E）成功注射时，仅有少量胞质泄漏。比例尺 = 50 µm。请点击此处查看此图的高清版本。
图 3：在 attP2 停泊位点携带转基因的转基因 Drosophila 的眼色。（A）表达 phiC31 整合酶的 attP2 显微注射品系（vas-phiC31; + ; attP2）具有白眼表型。RFP 在眼部特异性表达，用作筛选 phiC31 转基因的标记。（B）表达 phiC31 整合酶的衰老 attP2 显微注射品系因眼部积累 RFP 蛋白而呈现粉红色眼。（C）在 attP2 停泊位点整合了转基因的果蝇具有橙色眼。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的高清版本。
补充表1：转基因在 果蝇 由100种不同质粒的胚胎显微注射所致。 共计100种不同质粒，浓度范围从20 ng/µL 至 1683 ng/µL 被注射到胚胎中，并从100个质粒中的85个获得了转基因果蝇。 请点击此处下载此文件。
补充表2：胚胎显微注射在转基因中的效率 果蝇. 共向胚胎中注射了120种不同的质粒，其中101种质粒获得了转基因果蝇。 请点击此处下载该文件。
讨论
本文介绍了一种用于转基因的胚胎显微注射实验方案 果蝇对于由phiC31介导的位点特异性转基因实验，我们针对每种质粒注射了120至140个胚胎，约85%的质粒获得了至少一个转基因品系（补充表 2）。根据我们的经验，使用质粒小提试剂盒提取的质粒DNA已足以用于转基因实验 果蝇质粒DNA浓度在20 ng/µL至1683 ng/µL范围内可能对转基因成功率无明显影响，因为大多数浓度均可产生转基因果蝇补充表1).
注射针的制备对于高效的胚胎显微注射至关重要。注射针经拉针仪拉制后，针尖呈封闭状态。在常规的phiC31介导的转基因操作中 果蝇，通常用盖玻片折断针尖17然而，随机断裂的针头通常不适合用于胚胎显微注射，因为它们容易堵塞或导致大量细胞质泄漏，从而需要在注射过程中更换新的针头。通过研磨机将针尖磨成斜面的注射针通常不易堵塞，也不会引起大量细胞质泄漏，从而减少了更换针头的频率。我们注意到，在研磨过程中，一旦针尖开口，研磨液可能进入斜面针尖内部。一旦进入针内，研磨液无法在自然条件下迅速干燥。为防止研磨液产生虹吸现象，我们将注射针连接至带有压力表的脚踏式气泵. 在研磨针尖时，我们使用脚踏气泵对针管施加气压，从而防止研磨液进入斜面针尖，使斜面针头可立即投入使用。脚踏气泵与压力表联用，有助于加快转基因过程 果蝇， 特别是对于大量质粒而言。
确定处于前囊胚期或合胞体囊胚期的胚胎对于显微注射至关重要19,20，因为在较晚阶段注射几乎无法获得转基因果蝇。通常使用不足10日龄的果蝇进行产卵，因其产卵量高于较老的果蝇。在胚胎去壳过程中，使用细胞筛网可简化胚胎的次氯酸钠处理及双蒸水冲洗步骤。胚胎冲洗后，漂浮的胚胎表明卵壳已处理充分，可用于后续显微注射。胚胎的去壳时间和干燥时间均对显微注射至关重要，需通过实验优化；过长的去壳或干燥时间可能导致胚胎死亡。去壳和干燥时间受环境温度和湿度影响，不同地区和时间条件各异，应根据胚胎孵化率进行相应调整。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由南华大学高层次人才科研基金资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 μm 细胞滤筛 | NEST | 258367 | |
| 3M 双面胶带 | 3M | 415 | |
| 硼硅酸盐玻璃 | SUTTER | B100-75-10 | |
| 金刚石研磨板 | SUTTER | 104E | |
| FLAMING/BROWN 微量移液器拉制仪 | SUTTER | P-1000 | |
| 带压力表的脚踏气泵 | Shenfeng | SF8705D | |
| 卤代烷油 27 | Sigma | H8773 | |
| 卤代烷油 700 | Sigma | H8898 | |
| 倒置显微镜 | Nikon | ECLIPSE Ts2R | |
| 显微注射泵 | eppendorf | FemtoJet 4i | |
| 显微操作器 | eppendorf | TransferMan 4r | |
| 微量移液管斜面研磨仪 | SUTTER | BV-10 | |
| 显微镜盖玻片（18 mm × 18 mm） | CITOLAS | 10211818C | |
| 显微镜载玻片（25 mm × 75 mm） | CITOLAS | 188105W | |
| 培养皿（90 mm × 15 mm） | LAIBOER | 4190152 | |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1026269 | |
| QIAprep Spin Miniprep 试剂盒 | Qiagen | 27106 | |
| 体视显微镜 | Nikon | SMZ745 |
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